Modelo murino de Curación de Heridas

Summary

Un modelo murino de cicatrización de heridas cutáneas que se puede utilizar para evaluar los compuestos terapéuticos en los entornos fisiológicos y fisiopatológicos.

Abstract

La curación y la reparación de heridas son los procesos biológicos más complejos que se producen en la vida humana. Después de la lesión, múltiples vías biológicas se activan. Cicatrización de las heridas, que se produce en los pacientes diabéticos, por ejemplo, puede conducir a resultados desfavorables graves como la amputación. No es, por lo tanto, un impulso creciente para desarrollar nuevos agentes que promueven la reparación de la herida. Las pruebas de estos se ha limitado a modelos animales grandes tales como cerdos, que son a menudo poco práctico. Los ratones representan el modelo preclínico ideal, ya que son económicos y susceptibles de manipulación genética, que posibilite la investigación mecanicista. Sin embargo, la curación de heridas en un ratón es fundamentalmente diferente a la de los seres humanos, ya que se produce principalmente a través de la contracción. Nuestro modelo murino supera este mediante la incorporación de una férula alrededor de la herida. Por entablillado la herida, el proceso de reparación es entonces dependiente epitelización, proliferación celular y la angiogénesis, que reflejan de cerca laprocesos biológicos de cicatrización de la herida humana. Mientras que requieren consistencia y la atención, este modelo murino no implica técnicas quirúrgicas complicadas y permite la prueba robusta de agentes prometedores que pueden, por ejemplo, promover la angiogénesis o inhibir la inflamación. Además, cada ratón actúa como su propio control como se preparan dos heridas, lo que permite la aplicación tanto del compuesto de ensayo y el control del vehículo en el mismo animal. En conclusión, se demuestra un modelo práctico, fácil de aprender, y robusto de cicatrización de la herida, que es comparable a la de los humanos.

Introduction

Cicatrización de las heridas es responsable de la morbilidad y mortalidad en todo el mundo significativo, lo que es particularmente cierto para los que sufren de diabetes mellitus ^1,2. En los seres humanos, la cicatrización de heridas es un proceso continuo de procesos, en la que no es significativa superposición ^3. Inmediatamente se inició a raíz de los procesos inflamatorios, heridas. Las células inflamatorias liberan factores que estimulan los procesos de proliferación celular, la migración y la angiogénesis. Después de re-epitelización y formación de nuevo tejido hay una fase de remodelación que implica tanto la apoptosis y de re-organización de proteínas de la matriz tales como colágeno.

La complejidad de la cicatrización de heridas no puede actualmente ser replicado in vitro y esto requiere el uso de modelos animales. Hasta la fecha, los estudios de curación de heridas se han limitado a modelos animales grandes, tales como cerdos, para garantizar que los procesos de curación son equivalentes y comparables a los seres humanos. Sin embargo, el uso de grandes animals para este tipo de estudios pueden ser difíciles de casa y no siempre son prácticos ^4. El ratón de laboratorio representa un modelo animal económica que puede ser fácilmente manipulado genéticamente para la investigación mecanicista ^5-7. Sin embargo, las heridas se curan murinos de manera diferente a los humanos, principalmente debido al proceso de contracción ^8. Esto es en parte, debido a una amplia capa de músculo estriado subcutánea llamado el panículo carnoso que es en gran medida ausente en los seres humanos. En los ratones, esta capa muscular permite que la piel se mueva independientemente de los músculos más profundos y es responsable de la rápida contracción de la piel siguiente heridas.

Para superar esta limitación, la curación de heridas murino se puede adaptar para replicar la curación de heridas humanos mediante el uso de una férula (Figura 1) ^8,9. En este video se demuestra la herida modelo murino entablillado que elimina contracción de la herida y se aproxima más a los procesos humanos de re-epitelizaciónción y la formación de nuevos tejidos. En este modelo de dos escisiones de espesor completo que incluyen el panículo carnoso se crean en el dorso, uno a cada lado de la línea media del ratón. Una férula de silicona se coloca alrededor de la herida con la ayuda de adhesivo y la férula entonces asegurado con suturas interrumpidas. Cada ratón actúa como su propio control, con una herida de recibir tratamiento y otro de control del vehículo, lo que reduce el número de animales. Después de la aplicación tópica, se aplica un vendaje oclusivo transparente. El apósito se puede quitar cuando sea necesario para otras aplicaciones tópicas y / o de medición del área de la herida ^10,11. En la realización de experimentos, cierre de la herida, la arquitectura morfológica y grado de neovascularización se puede evaluar mediante técnicas de inmunohistoquímica. Este económico y fácil de realizar modelo también se puede utilizar para evaluar la cicatrización de heridas en el contexto de la diabetes mellitus o otros patofisiología.

Protocol

1. Preparación de férulas y vendajes oclusivos

1. Esquema 10 círculos mm en 0,5 mm de espesor y láminas de silicona con unas tijeras o un punzón de biopsia para crear discos de silicona.
2. Centro de un punzón de biopsia de 5 mm en el centro del círculo de 10 mm y presione firmemente para crear un agujero para formar una "rosquilla"-como disco que se utilizará como una férula.
3. Esquema 10 mm círculos sobre un apósito oclusivo transparente como Opsite y tijeras utilizar para crear vendajes circulares.

2. Animales de experimentación

1. Obtener la aprobación del Comité de Ética Animal de todos los experimentos que se realizarán.
2. Utilice 8 semanas de edad (22 a 26 gramos) ratones C57BL/6J macho de un criador comercial (por ejemplo, los Laboratorios Jackson).
3. Mantenga los ratones en condiciones estándar de 21 º C y una HR del ciclo 12 de luz-oscuridad con acceso libre a comida y agua.
4. (Opcional): La diabetes puede ser inducida en 6 a 7 semanas de edad ratones por un bolo intraperitoneal Injección de 165 mg / kg de estreptozotocina (en tampón citrato, pH 4,5), con hiperglucemia confirmada por control de la glucemia normal (accuchek glucómetro). Los ratones diabéticos pueden tener poliuria y así pueden necesitar su ropa de cama que cambiar con mayor frecuencia para eliminar la humedad y los pesos deben ser estrechamente monitorizados.

3. Anestesia y preparación Operativo

1. Inducir la anestesia general utilizando 5% de isoflurano en oxígeno al 100% (tasa de flujo de 1 l / min) y mantener la anestesia utilizando 1-3% de isoflurano.
2. Asegúrese de que los reflejos profundos del pedal del ratón se suprimen y coloque el puntero del ratón en la posición prona.
3. Preparar la región operativa mediante la eliminación de piel con una maquinilla de la base del cuello a 3 cm más abajo en la parte posterior y entre las dos láminas de hombro.
4. Una ligera aplicación de crema depilatoria puede aplicarse por no más de 2 min. Hisopos de gasa húmeda se pueden usar para asegurar que todos crema y se retira de piel restante.
5. Limpiar la piel con unaalgodón con alcohol y dos aplicaciones de 10% de povidona yodada (Betadine) y cubren el ratón.

4. La escisión y el entablillado de la herida

1. Representación esquemática del modelo de curación de heridas murino se presenta en la Figura 1.
2. Utilice un estéril 4 mm biopsia en sacabocados para delinear dos patrones circulares para la herida a cada lado de la línea media del ratón en el nivel de los hombros (véanse las figuras 2a-2b).
3. El uso de fórceps dentadas para levantar la piel en el medio del esquema y tijeras iris para crear una herida de espesor total que se extiende a través del tejido subcutáneo (Figuras 2c-2d), incluyendo el panículo carnoso (Figura 2e), y la pieza circular especiales de tejido.
4. Repetir el proceso para la herida en el otro lado de la línea media (Figura 2f).
5. Eliminar capa protectora de plástico de cada lado de la férula de silicona.
6. Aplicar cyanoacrylaTE adhesivo (por ejemplo, Super Glue o Krazy Glue) a un lado de una férula de silicona.
7. Centro de la férula sobre la herida (Figura 2g) y el ancla de la férula con interrumpidas 6-0 suturas de nylon para asegurar el posicionamiento (figura 2h).
8. Repetir el proceso de colocación de una férula en la otra herida.
9. Si es necesario en este punto de tiempo, aplicar el compuesto terapéutico a ensayar (de hasta 100 l) a una herida (figura 2i), y el control del vehículo a la otra.
10. Cubra la herida con un apósito oclusivo transparente (por ejemplo, OpSite) (figura 2j-2k).
11. Un gobernante se coloca por debajo de las férulas y una microfotografía tomada (Figura 2l).

6. Tratamiento postoperatorio

1. Carprofeno (5 mg / kg) se administra una vez al día mediante inyección sub-cutánea para el alivio del dolor post-operatorio.
2. Después de la cirugía los animales están enjaulados y se mantienen a fuego m individualats hasta que esté completamente recuperado.
3. Supervisar los animales dos veces al día durante las manifestaciones de dolor y pérdida de peso. No se observaron muestras de comportamiento graves de dolor o pérdida de peso.

7. Medición de la herida y Tratamiento

1. La herida puede medirse todos los días.
2. Inducir la anestesia general utilizando 5% de gas isoflurano (tasa de flujo de 1 l / min), y a continuación, asegurar los reflejos profundos sensoriales del ratón se suprimen utilizando 1-3% de isoflurano.
3. Suavemente jale el vendaje oclusivo con fórceps.
4. Use pinzas quirúrgicas para medir el diámetro de la herida. Tomamos el promedio de tres mediciones a lo largo de los ejes X, Y y Z (Figuras 2m-2o), así como una microfotografía para referencia futura (figura 2p).
5. Opcional: En este momento el animal se puede evaluar la perfusión arterial mediante un Doppler impresora láser (Figura 2q).
6. Re-aplicación del compuesto terapéutico y el control del vehículo puede ser realizadosmed en este punto.
7. Un vendaje oclusivo transparente limpia se vuelve a aplicar y los animales mantiene caliente hasta que esté completamente recuperado.
8. Nota: si las férulas no se fijan correctamente la herida se contrae rápidamente (Figura 2r).

8. Análisis histológico

1. La eutanasia a los ratones después de 10 días con una sobredosis de anestesia.
2. Con unas pinzas y un bisturí quitar las suturas y con cuidado retire la férula.
3. Con unas tijeras iris para crear una amplia, la escisión completa alrededor y debajo de la zona de la herida e incubar el tejido en 4% de paraformaldehído en tampón fosfato salino (PBS) a 4 ° C durante la noche.
4. Transferencia de tejido a 17% de sacarosa en solución de PBS durante una hora 24 más a 4 º C y después eliminar el exceso de solución frotando cuidadosamente sobre el tejido y el lugar en compuesto OCT y congelar a -80 ° C.
5. Tinción con hematoxilina y eosina se pueden utilizar para visualizar la estructura y la brecha de la herida epitelial. Neovascularisation puede ser evaluada por análisis inmunohistoquímico para determinar el número de capilares (utilizando el factor de Von Willebrand).

Representative Results

Una curva de cierre de la herida se determina calculando el diámetro medio de la herida y expresando los resultados como un porcentaje, es decir, 100 - (Día 0 / diámetro X Día). En este experimento se aplicó un compuesto terapéutico (o vehículo de control) al día a la herida. El compuesto terapéutico de cierre acelerado en gran medida la herida (Figura 3). Es importante señalar que las férulas deben mantenerse durante la duración del experimento, como la eliminación de las férulas dará lugar a una rápida contracción de la herida (figura 2r) y divergen a partir del patrón de cicatrización de la herida observada en los seres humanos.

Figura 1. Representación esquemática del modelo de cicatrización de la herida murino. En este modelo de dos heridas de espesor completo se crean en eiTher lado de la línea media que permite a cada ratón para servir como su propio control. Férulas de silicona se adhieren y se suturan al perímetro de la herida para prevenir la contracción de la herida, proporcionando un modelo replicable a la de los seres humanos.

Figura 2. Cirugía de cicatrización de la herida y las mediciones post-quirúrgicas. Después de la eliminación del vello y la preparación de la piel con yodo y alcohol (ab) un punzón de biopsia se utiliza suavemente para delinear dos círculos en el dorso, cada lado de la línea media. (C) una pequeña incisión se crea a continuación, y (d) se retira una pieza circular de la piel, (e) incluyendo la panniculosus carnosus, (f) para crear dos heridas de espesor completo. (g) El adhesivo se aplica entonces a la silícico uno férulas y las férulas se adhirieron al perímetro de la herida. (h) Las tablillas se fijan entonces con puntos de sutura. (i) Los tratamientos se aplican por vía tópica y (jk) un vendaje oclusivo, transparente se coloca sobre la herida y se adhirieron a las férulas (adhesivo puede pueden usar si se requiere). (l) Las fotomicrografías se toman diariamente y área de la herida se calcula a partir de la media de tres mediciones de diámetro en el (m) del eje y, (n) x-eje y (o) del eje z. (p ) Una foto representativa de las heridas en el día 10, tomando nota de la herida más pequeña a la derecha que fue tratado con un compuesto terapéutico. (q) Imagen representativa láser Doppler de la perfusión de la sangre de la herida en el día 6. (r) Ejemplo de rápido la herida contracción después de la eliminación de las férulas de silicona.

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Figura 3. Gráfico de cierre de la herida Representante. Área de la herida se calcula a partir de la media de tres mediciones de diámetro diarias a lo largo de las direcciones x, y y z-ejes. Cierre de la herida se expresa como un porcentaje del área de la herida inicial en el día 0.

Discussion

Este es un modelo experimental murino de cicatrización de heridas cutáneas. Una característica importante de este modelo es el uso de férulas de silicona para prevenir la contracción de la herida por lo que pueden producirse de re-epitelización y formación de nuevo tejido, por lo que es similar al proceso que se produce en los seres humanos. Este modelo es muy versátil y se puede utilizar para evaluar la cicatrización de heridas en la configuración tanto fisiológicos y fisiopatológicos (por ejemplo, diabetes mellitus). El modelo también puede usarse para evaluar el potencial de curación de heridas o angiogénesis terapéutica en un marco económico. Con cada ratón que actúa como su propio control, el número de animales se reducen al mínimo. Las técnicas quirúrgicas necesarias para que este modelo no son muy sofisticados, por lo que este modelo puede ser ampliamente utilizado por las personas con relativamente poca experiencia quirúrgica.

Para asegurar la reproducibilidad y la cuantificación precisa es imprescindible que la férula se adhiere y se ancla a la piel con suturas adecuadamente, y que taquí hay un retardo mínimo entre la creación de las dos heridas. La propensión de las heridas murinos se contraiga rápidamente tras la relajación de la férula o parcial retirada debido al rascado por el ratón requiere un seguimiento diario de las férulas. También se requiere la aplicación cuidadosa de adhesivo para minimizar la irritación de la piel sana alrededor de la férula que puede promover el rascado. También es muy importante seguir técnicas asépticas y desinfectar a fondo equipos, en particular las pinzas de freno, entre los ratones. La aplicación del apósito oclusivo también debe tenerse en cuenta, sobre todo si las heridas no van a ser tratados o adobada diaria. Apósitos Tegaderm y OpSite (3M) son comparables ^12, y se ha demostrado que los apósitos Tegaderm sólo pueden permanecer adheridos durante 1-2 días. En caso de apósitos para heridas a más largo plazo se requiere un enfoque alternativo ha sido descrito por Chung y sus colegas ^13.

Debilidades potenciales de este modelo pueden incluir inflamación d ue para el anclaje de suturas, la difusión del tratamiento o del vehículo entre las heridas y la entrada del tratamiento en la circulación sistémica. En lo que respecta a las suturas que inducen la inflamación local, las suturas se colocan relativamente lejos de la herida y como cada herida se crean de la misma, por lo tanto, cualquier tipo de inflamación que puede ocurrir debe ser similar entre las heridas. Del mismo modo, la distancia entre las heridas y la falta de edema entre las heridas reduciría al mínimo la difusión entre las dos camas. Existe alguna evidencia de que un tratamiento puede entrar en la circulación sistémica, que puede acelerar la curación de la herida de control de ^9,10. Para determinar la extensión de un tratamiento de entrar en la circulación sistémica, los ratones hermanos de camada se podrían utilizar, en el que las dos heridas se tratan sólo con el vehículo. Las diferencias en las tasas de cierre de la herida entre los ratones tratados con vehículo solo, y los ratones que recibieron el vehículo y el tratamiento podrían entonces ser comparados.

"> En conclusión, hemos demostrado un modelo murino relativamente simple de la cicatrización de heridas que exhibe muchas de las características observadas en la cicatrización de heridas humana.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick	Invitrogen	P18178	Cut into "donuts" with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter
Biopsy punch 5 mm	Steifel	BC-B1-0500	To outline wound area to be excised
Vannas scissors 8.5 cm curved	World Precision Instruments	501232	For wound incision and excision
Dumonte #7b forceps, 11 cm	World Precision Instruments	501302	To grip skin when creating incision and excising skin
Graefe forceps, serrated 10cm	World Precision Instruments	14142	To help attach silicone splint to skin
Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm	World Precision Instruments	14132
Malis forceps, smooth, straight, 12 cm	Codman and Shurtleff, Inc (J&J)	80-1500	To suture the silicon rings to the skin
Ruler, 0.5 mm gradation	n/a
Calipers 0.25 mm gradation	Duckworth and Kent	9-653	To measure wound area
Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m	Smith & Nephew	66030570
Rimadyl (Carprofen)	Pfizer	462986