Murinmodell sårläkning

Summary

En murin modell av kutan sårläkning som kan användas för att utvärdera terapeutiska föreningar i fysiologiska och patofysiologiska inställningar.

Abstract

Sårläkning och reparation är de mest komplexa biologiska processer som sker i människans liv. Efter skador, flera biologiska banor blir aktiverade. Försämrad sårläkning, vilket förekommer hos diabetespatienter till exempel, kan leda till allvarliga negativa effekter såsom amputation. Det finns därför ett ökande drivkraft att utveckla nya medel som främjar sårläkning. Testningen av dessa har begränsad till stora djurmodeller, såsom svin, som ofta opraktiskt. Möss är den idealiska preklinisk modell, eftersom de är ekonomiska och mottagliga för genetisk manipulation, vilket möjliggör mekanistiska utredning. Men sårläkning i en mus är fundamentalt annorlunda än människor som det i första hand sker via kontraktion. Vår murin modell övervinner detta genom att införliva en skena runt såret. Med skenor såret, är reparationen därefter beroende epiteliseringen, cellulär proliferation och angiogenes, som nära speglarbiologiska processer av mänsklig sårläkning. Samtidigt kräver konsekvens och omsorg, innebär detta murinmodell inte komplicerade kirurgiska tekniker och möjliggör robusta testning av lovande medel som kan, exempelvis, främjar angiogenes eller hämma inflammation. Dessutom agerar varje mus som sin egen kontroll som två sår framställes, vilket möjliggör tillämpning av både testföreningen och fordonet kontroll i samma djur. Sammanfattningsvis, visar vi en praktisk, lätt att lära sig, och robust modell av sårläkning, vilket är jämförbart med det av människor.

Introduction

Försämrad sårläkning är ansvarig för betydande morbiditet och mortalitet i hela världen, detta gäller särskilt för dem som lider av diabetes mellitus ^1,2. Hos människa är sårläkning ett kontinuum av processer, där det finns en betydande överlappning ^3. Omedelbart efter sårskada, inflammatoriska processer initieras. Inflammatoriska celler släpper faktorer som gynnar processerna för celltillväxt, migration och angiogenes. Efter återepitelisering och ny vävnad bildas finns det en fas av ombyggnad som innebär både apoptos och omorganisation av matrix proteiner såsom kollagen.

Komplexiteten i sårläkning kan för närvarande inte replikeras in vitro och detta leder till användning av djurmodeller. Hittills har sårläkande studierna begränsats till stora djurmodeller, såsom svin, för att säkerställa att läkningsprocesser är likvärdiga och jämförbara till människor. Men med hjälp av stora animals för sådana studier kan vara svåra att huset och är inte alltid praktiskt ^4. Laboratoriet musen utgör en ekonomisk djurmodell som lätt kan manipuleras genetiskt för mekanistiska utredning ^5-7. Men murina sår läker olika på människans, främst på grund av den process av kontraktion ^8. Detta är delvis på grund av en omfattande subkutana tvärstrimmig muskulatur lagret kallas panniculus carnosus som är i stort sett frånvarande i människor. I möss, ger detta muskellager huden för att röra sig oberoende av de djupare muskler och är ansvarig för den snabba kontraktionen av huden efter sårskada.

För att övervinna denna begränsning, kan murina sårläkning anpassas för att replikera mänsklig sårläkning genom användning av en skena (figur 1) ^8,9. I denna video visar vi splinted murina såret modell som eliminerar sårkontraktion och mer lik de mänskliga processer re-epithelializaning och ny vävnad bildas. I denna modell två full tjocklek excisions som inkluderar panniculus carnosus skapas på dorsum, en på varje sida om mittlinjen av musen. En silikon skena placeras runt såret med hjälp av limmet och skenan säkras sedan med avbrutna suturer. Varje mus fungerar som sin egen kontroll, med ett sår får behandling och det andra fordonet kontroll, och därigenom minska antalet djur. Efter topiska applikationer används ett transparent ocklusionsförband tillämpas. Förbandet kan tas bort vid behov för ytterligare aktuella tillämpningar och / eller mätningen av sårområdet ^10,11. Vid slutförandet av experiment, sår, morfologisk arkitektur och grad av kärlnybildning kan bedömas genom immunohistokemi. Denna ekonomiskt och lätt att utföra modellen kan också användas för att bedöma sårläkning i samband med diabetes mellitus eller andra pathophysiologies.

Protocol

Ett. Framställning av spjälor och ocklusivförband

1. Disposition 10 mm cirklar på 0,5 mm tjockt silikon plåt och sax användning eller en biopsi punch för att skapa silikon diskar.
2. Centre är en 5 mm biopsistans i mitten av 10 mm cirkel och tryck ordentligt för att skapa ett hål för att bilda en "donut"-liknande skiva som kommer att användas som en skena.
3. Disposition 10 mm cirklar på en transparent ocklusionsförband såsom Opsite och saxar använda för att skapa cirkulära förband.

2. Experimental Animals

1. Skaffa Animal etikkommitté godkännande för alla experiment som ska utföras.
2. Använd 8 veckor gamla (22-26 gram) manliga C57BL/6J-möss från en kommersiell uppfödare (t.ex. The Jackson Laboratories).
3. Håll möss i vanliga förhållanden på 21 ° C och en 12 timmars ljus-mörker-cykel med fri tillgång till mat och vatten.
4. (Valfritt): kan Diabetes induceras i 6 till 7 veckor gamla möss med en bolus intraperitoneal InjeInsatser på 165 mg / kg streptozotocin (i citratbuffert, pH 4,5), med hyperglykemi bekräftas av regelbunden blodsockerkontroll (accuchek glukometer). Diabetiska möss kan ha polyuri och så deras sängkläder kan behöva bytas oftare att eliminera väta och deras vikter bör övervakas noga.

Tre. Anestesi och Operative Förberedelse

1. Framkalla narkos med 5% isofluran i 100% syrgas (flöde 1 L / min) och bibehålla anestesi med 1-3% isofluran.
2. Se till de djupa pedal reflexer på musen undertrycks och placera musen i liggande ställning.
3. Förbered operativa området genom att ta bort päls med Clippers från basen av halsen till 3 cm längre ned i ryggen och mellan de båda skulderbladen.
4. En lätt tillämpning av hårborttagningskräm kan sökas längre än 2 minuter. Våta gasväv kompresser kan användas för att säkerställa att allt grädde och återstående päls avlägsnas.
5. Torka av huden med ettalkoholtork och två ansökningar av 10% povidon-jod (Betadine) och drapera musen.

4. Excision och förbandtekniker of Wound

1. Schematisk återgivning av den murina sårläkande Modellen presenteras i figur 1.
2. Använd en steril 4 mm biopsistans att beskriva två cirkulära mönster för såret på vardera sidan av musens mittlinjen i nivå med axlarna (se figurerna 2a-2b).
3. Använd tandade pincett för att lyfta huden i mitten av konturerna och iris sax för att skapa en full-tjocklek sår som sträcker sig genom den subkutana vävnaden (figur 2c-2d), inklusive panniculus carnosus (figur 2e), och skära ut runda lappar av vävnad.
4. Upprepa processen för såret på den andra sidan om mittlinjen (figur 2f).
5. Ta bort plast skyddande beläggning från varje sida av silikon skena.
6. Applicera cyanoacrylate lim (t.ex. Super Glue eller Krazy Lim) till en sida av en silikon skena.
7. Centrum skenan över såret (figur 2g) och förankra skenan med avbrutna 6-0 nylonsuturer att säkerställa placering (figur 2h).
8. Upprepa skenor processen på andra såret.
9. Om så krävs vid denna tid-punkt, tillämpa den terapeutiska föreningen som skall testas (upp till 100 | il) till ett sår (figur 2i), och kontroll av fordon till den andra.
10. Täck såret med ett transparent ocklusivt förband (exempelvis OpSite) (figur 2j-2k).
11. En linjal placeras under skenor och ett mikrofotografi taget (Figur 2l).

6. Postoperativ Ledning

1. Karprofen (5 mg / kg) administreras en gång dagligen via subkutan injektion för postoperativ smärtlindring.
2. Efter operationen djuren individuellt bur och underhållas på värme mats tills återhämtat sig helt.
3. Övervaka djur två gånger dagligen för manifestationer av smärta och viktnedgång. Vi observerade inga stora beteendemässiga skärmar av smärta eller viktminskning.

7. Sår mätning och behandling

1. Såret kan mätas dagligen.
2. Framkalla narkos med 5% isofluran gas (flödeshastighet 1 L / min), och sedan se till att de djupa sensoriska reflexer på musen undertrycks med 1-3% isofluran.
3. Dra försiktigt tillbaka ocklusionsförband med pincett.
4. Använd kirurgiska bromsok att mäta såret diameter. Vi tar ett genomsnitt av tre mätningar längs X-, Y-och Z-axeln (figur 2m-2o) samt ett mikrofotografi för framtida referens (Figur 2p).
5. Tillval: Vid denna tidpunkt djuret kan bedömas för blodperfusion med laser Doppler Imager (Figur 2Q).
6. Re-tillämpning av den terapeutiska föreningen och kontroll av fordon kan vara prestandaMed på denna punkt.
7. En ren transparent Ocklusionsförband sedan åter tillämpas och djuren hålls varm tills helt återställd.
8. Obs: Om spjälor inte sitter fast ordentligt såret kommer lätt krympa (Figur 2r).

8. Histologisk analys

1. Euthanize mössen efter 10 dagar med en överdos av anestesi.
2. Använd pincett och en skalpell blad bort suturer och försiktigt bort skenan.
3. Använd iris sax för att skapa ett brett, full excision runt och under sårområdet och inkubera vävnaden i 4% paraformaldehyd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 4 ° C över natten.
4. Överför vävnad till 17% sackaros i PBS-lösning under ytterligare 24 h vid 4 ° C och avlägsna överskott av lösning genom att badda försiktigt på vävnad och placera i OCT-förening och frys vid -80 ° C.
5. Hematoxylin och eosin färgning kan användas för att visualisera den lindade strukturen och epitelial gap. Neovascularisation kan bedömas genom immunhistokemiska analyser för att bestämma antalet kapillärer (med användning av Von Willebrands faktor).

Representative Results

Sårförslutningssystem kurva bestäms genom att beräkna den genomsnittliga diametern av såret och uttrycka resultaten i procent, dvs 100 - (Dag 0 diameter / dag x diameter). I detta experiment en terapeutisk förening (eller vehikelkontroll) applicerades dagligen på såret. Den terapeutiska föreningen kraftigt accelererad sårtillslutning (Figur 3). Det är viktigt att notera att splinten måste bibehållas under hela experimentet, eftersom avlägsnande av spjälor kommer att leda till snabb sårkontraktion (Figur 2r) och divergerar från mönstret av sårläkning observerats hos människa.

Figur 1. Schematisk representation av den murina sårläkning modell. I denna modell två fullhudssår skapas på eiTher sida om mittlinjen låta varje mus för att fungera som sin egen kontroll. Silikon spjälor följs och sys såret omkrets för att förhindra sårkontraktion, ger en modell replikeras till det av människor.

Figur 2. Sårläkning kirurgi och postoperativa mätningar. Efter hårborttagning och förberedelse av huden med jod och alkohol (ab) är ett biopsistans försiktigt används för att beskriva två cirklar på dorsum, endera sidan av mittlinjen. (C) Ett litet snitt Därefter skapas och (d) en cirkulär bit hud tas bort, (e) inklusive panniculosus carnosus, (f) att skapa två fullhudsskador. (g) Lim appliceras sedan på den silic en spjälor och spjälor följs såret omkrets. (h) spjälor sedan säkras med suturer. (i) Behandlingar lokalt applicerad och (jk) en ocklusiv, transparent förband placeras över såret och fäst med spjälor (lim användas om det krävs). tas dagligen och sårområdet beräknas från medelvärdet av tre diametermätningar på (m) y-axeln, (n) x-axel och (o) z-axeln (L) Mikrofotografier. (p ) En representativ bild av såren vid dag 10, notera den mindre sår på höger som behandlades med en terapeutisk förening. (q) Representant laser Doppler bild av genomblödning i såret på dag 6. (R) Exempel på snabba sår kontraktion efter avlägsnande av silikonkomponenterna spjälor.

65/50265fig3.jpg "alt =" Bild 3 "fo: innehåll-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/50265/50265fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Representant sårtillslutning grafen. Wound ytan beräknas från medelvärdet av tre dagliga diametermätningar längs med x-, y-och z-axlar. Tillslutning av sår uttrycks som en procentandel av initial sårområdet vid dag 0.

Discussion

Detta är en experimentell musmodell av kutan sårläkning. Ett betydande inslag i denna modell är att använda silikon spjälor att förhindra sårkontraktion så att återepitelisering och ny vävnad bildas kan förekomma, vilket gör det liknar den process som sker hos människor. Denna modell är mångsidig och kan användas för att utvärdera sårläkning i både fysiologiska och patofysiologiska (t.ex. diabetes mellitus) inställningar. Modellen kan också användas för att bedöma potentiella sårläkning eller terapi angiogenes i en ekonomisk miljö. Med varje mus fungerar som sin egen kontroll, ökar antalet djur minimeras. De kirurgiska tekniker som krävs för denna modell är inte mycket sofistikerad, alltså denna modell kan ofta används av personer med relativt liten kirurgisk erfarenhet.

För att säkerställa reproducerbarhet och noggrann kvantifiering är det absolut nödvändigt att skenan är tillräckligt vidhäftat och förankras till huden med suturer, och att thär är minimal fördröjning mellan att skapa de två sår. Benägenhet murina sår att snabbt krympa efter lossning av skenan eller partiellt avlägsnande på grund av repor med musen kräver daglig övervakning av spjälor. Omsorgsfull tillämpning av lim krävs också för att minimera irritation av frisk hud runt skenan som kan främja repor. Det är också mycket viktigt att följa aseptisk teknik och grundligt desinficera utrustning, särskilt bromsok, mellan möss. Tillämpningen av ocklusivförbandet måste också beaktas, särskilt om sår inte kommer att behandlas eller klädd dagligen. Opsite och Tegaderm (3M) förband är jämförbara ^12, och det har visat sig att Tegaderm förband endast kan förbli vidhäftat under 1-2 dagar. Bör långsiktiga sårförband krävas en alternativ metod har beskrivits av Chung och kollegor ^13.

Potentiella svagheter av denna modell kan omfatta inflammation d ue till förankringen av suturer, diffusionen av behandling eller fordonet mellan sår och införandet av behandlingen in i den systemiska cirkulationen. I fråga om att de suturer som inducerar lokal inflammation, de suturer placeras relativt långt från såret och som varje sår skapas samma, alltså någon inflammation som kan uppstå bör vara likartad mellan sår. Likaså skulle avståndet mellan sår och bristande ödem mellan såren minimera diffusion mellan de två sängar. Det finns vissa belägg för att en behandling kan komma in i kretsloppet, vilket kan påskynda läkning av kontrollen lindad ^9,10. För att fastställa omfattningen av en behandling kommer in i den systemiska cirkulationen, kunde kullsyster möss användas, i vilken de två såren endast behandlas med fordonet. De skillnader i frekvensen av sårtillslutning mellan möss behandlade med enbart vehikel, och mössen fick både fordonet och behandling kan sedan jämföras.

"> Sammanfattningsvis har vi visat en relativt enkel murin modell av sårläkning som uppvisar många av de funktioner som observerats i humant sårläkning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick	Invitrogen	P18178	Cut into "donuts" with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter
Biopsy punch 5 mm	Steifel	BC-B1-0500	To outline wound area to be excised
Vannas scissors 8.5 cm curved	World Precision Instruments	501232	For wound incision and excision
Dumonte #7b forceps, 11 cm	World Precision Instruments	501302	To grip skin when creating incision and excising skin
Graefe forceps, serrated 10cm	World Precision Instruments	14142	To help attach silicone splint to skin
Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm	World Precision Instruments	14132
Malis forceps, smooth, straight, 12 cm	Codman and Shurtleff, Inc (J&J)	80-1500	To suture the silicon rings to the skin
Ruler, 0.5 mm gradation	n/a
Calipers 0.25 mm gradation	Duckworth and Kent	9-653	To measure wound area
Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m	Smith & Nephew	66030570
Rimadyl (Carprofen)	Pfizer	462986