Summary
Een murine model van cutane wondgenezing die kunnen worden gebruikt om therapeutische samenstellingen te beoordelen fysiologische en pathofysiologische instellingen.
Abstract
Wondgenezing en reparatie zijn de meest complexe biologische processen die zich in het menselijk leven. Na verwonding, verschillende biologische routes geactiveerd worden. Verstoorde wondheling, die voorkomt bij diabetici bijvoorbeeld kan leiden tot ernstige ongunstige resultaten zoals amputatie. Er is dus een toenemende impuls aan nieuwe middelen die wondheling bevorderen. Het testen van deze is beperkt tot grote diermodellen zoals varkens, die vaak onpraktisch. Muizen vertegenwoordigen de ideale preclinical model aangezien ze zuinig en vatbaar voor genetische manipulatie, die zorgt voor mechanistische onderzoek. Echter, wondgenezing in een muis is fundamenteel verschillend van die van de mens als het voornamelijk via contractie. Onze muizenmodel ondervangt dit doordat een spalk rond de wond. Door spalken de wond, is het herstelproces dan afhankelijk epithelisatie, cellulaire proliferatie en angiogenese, die nauw de spiegelbiologische processen van menselijke wondgenezing. Terwijl die consistentie en verzorging, dit muizenmodel niet om ingewikkelde chirurgische technieken en maakt de robuuste testen van veelbelovende middelen die kunnen bijvoorbeeld angiogenese bevorderen of ontstekingsremmende. Bovendien, elke muis fungeert als eigen controle als twee wonden worden bereid, zodat de toepassing van zowel de testverbinding en controle voertuig op hetzelfde dier. Concluderend demonstreren we een praktische, eenvoudig te leren en robuuste uitvoering van wondgenezing, vergelijkbaar met die van mensen.
Introduction
Verstoorde wondgenezing is verantwoordelijk voor aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit, dit geldt met name voor patiënten van diabetes mellitus 1,2. Bij mensen wondgenezing een continuüm van processen, waarbij er een aanzienlijke overlapping 3. Onmiddellijk na verwonding, inflammatoire processen worden geïnitieerd. Ontstekingscellen vrij factoren die de processen van celproliferatie, migratie en angiogenese stimuleren. Na re-epithelialisatie en nieuwvorming weefsel er een fase van remodeling dat zowel apoptose en reorganisatie van matrix eiwitten zoals collageen meebrengt.
De complexiteit van de wondheling kan momenteel niet worden gerepliceerd in vitro en dit is het gebruik van diermodellen. Tot op heden zijn wondhelende studies beperkt tot grote diermodellen, zoals varkens, dat de genezingsprocessen gelijkwaardig zijn en vergelijkbaar met de mens. Echter, het gebruik van grote animals deze studies kan moeilijk zijn huis en zijn niet altijd praktisch 4. Het laboratorium muis vertegenwoordigt een economisch diermodel dat gemakkelijk genetisch kunnen worden gemanipuleerd mechanistische onderzoek 5-7. Echter, muizen wonden verschillend op de mens, vooral door het proces van contractie 8. Dit is gedeeltelijk te wijten aan een uitgebreide onderhuidse dwarsgestreepte spierlaag genaamd de panniculus carnosus dat is grotendeels afwezig in de mens. In muizen, deze spierlaag laat de huid los van de diepere spieren bewegen en is verantwoordelijk voor de snelle samentrekking van de huid volgt verwonding.
Om deze beperking te overwinnen, kunnen murine wondgenezing aangepast aan menselijke wondgenezing repliceren door middel van een splint (figuur 1) 8,9. In deze video laten we zien de gespalkt muizen wondmodel dat wondcontractie elimineert en meer overeenstemt met de menselijke processen van re-epithelializatie en de nieuwe formatie weefsel. In dit model twee volle dikte uitsnijdingen dat de panniculus carnosus zijn worden op het dorsum, een aan elke kant van de middellijn van de muis. Een silicone splint is geplaatst rond de wond met behulp van lijm en de spalk vervolgens vastgezet met onderbroken hechtingen. Elke muis fungeert als zijn eigen controle, met een wond die behandeld en het andere voertuig controle, waardoor het aantal dieren verminderen. Na topische toepassingen, is een transparante afsluitend verband aangebracht. Het verband kan worden verwijderd indien nodig verder topische toepassingen en / of meting van het wondgebied 10,11. Bij de voltooiing van experimenten wondsluiting morfologische architectuur en de mate van neovascularisatie kan worden beoordeeld door immunohistochemie. Deze economische en gemakkelijk te voeren model kan ook worden gebruikt om wondheling in het kader van diabetes mellitus of andere pathophysiologies beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van Spalken en afsluitend verband
- Schetsen 10 mm cirkels op 0,5 mm dik siliconen lakens en gebruik een schaar of een biopsie punch aan siliconen schijven maken.
- Centre een 5 mm punch biopsie in het midden van de 10 mm cirkel en druk stevig een gat om een "donut" vorm-achtige schijf die wordt gebruikt als een spalk maken.
- Schetsen 10 mm cirkels op een transparante afsluitend verband, zoals Opsite en gebruik een schaar om circulaire verbanden te creëren.
2. Proefdieren
- Verkrijgen Dier Ethische Commissie goedkeuring voor alle experimenten die zullen worden uitgevoerd.
- Gebruik 8-weken oude (22-26 gram) mannelijke C57BL/6J-muizen van een commerciële fokker (bv. The Jackson Laboratories).
- Houd muizen in standaard omstandigheden van 21 ° C en een 12 uur licht-donker cyclus met vrije toegang tot voedsel en water.
- (Optioneel): Diabetes kan in 6 tot 7 weken oude muizen worden geïnduceerd door een bolus intraperitoneale injectie van 165 mg / kg streptozotocine (in citraat-buffer, pH 4,5), met hyperglycemie bevestigd door regelmatig bloed glucose monitoring (accuchek glucometer). Diabetische muizen kunnen polyurie hebben en dus hun beddengoed kan nodig zijn om vaker worden veranderd om nattigheid te elimineren en hun gewichten moeten nauwgezet worden gecontroleerd.
3. Anesthesie en Operative Voorbereiding
- Induceren algemene anesthesie met 5% isofluraan in 100% zuurstof (stroomsnelheid 1 L / min) en anesthesie met 1-3% isofluraan handhaven.
- Zorgen de diepe pedaal reflexen van de muis worden onderdrukt en plaats de muis in buikligging.
- Bereid de operatieve gebied door het verwijderen vacht met tondeuse van de basis van de nek tot 3 cm verder achter en tussen de schouderbladen.
- Een lichte toepassing van ontharingscrème kan worden toegepast voor niet langer dan 2 minuten. Natte gaas swabs kunnen worden gebruikt om alle crème waarborgen en resterende vacht verwijderd.
- Veeg de huid met eenalcoholdoekje en twee toepassingen van 10% povidonjood (Betadine) en leg de muis.
4. Excisie en spalken van Wound
- Schematische weergave van de muizen wondgenezing model wordt getoond in Figuur 1.
- Een steriele 4 mm punch biopsie twee cirkelvormige patronen voor de wond schetsen aan weerszijden van de middellijn muis ter hoogte van de schouders (zie figuren 2a-2b).
- Gebruik getande tang om de huid te tillen in het midden van de omtrek en de iris schaar om een volledige dikte wond die zich uitstrekt door het onderhuidse weefsel (figuur 2c-2d), met inbegrip van de panniculus carnosus (figuur 2e) te creëren, en accijnzen de cirkelvormige stuk van weefsel.
- Herhaal de werkwijze voor de wond aan de andere zijde van de middellijn (figuur 2f).
- Verwijder de plastic beschermlaag van elke kant van de siliconen spalk.
- Solliciteer cyanoacrylate klevende (bijv. Super Glue of Krazy Glue) op een zijde van een silicone splint.
- Centre de spalk over de wond (figuur 2g) en anker de spalk met onderbroken 6-0 nylon hechtingen te positioneren (Figuur 2 uur) te garanderen.
- Herhaal de spalken taak op de andere wond.
- Indien vereist op dit tijdpunt, de therapeutische toepassing te testen verbinding (tot 100 pi) op een wond (figuur 2i) en de controle over het voertuig naar de andere.
- Bedek de wond met een transparante afsluitend verband (bijvoorbeeld OpSite) (figuur 2j-2k).
- Een heerser is onder het spalken geplaatst en een microfoto gemaakt (Figuur 2l).
6. Postoperatieve beheer
- Carprofen (5 mg / kg) wordt eenmaal daags toegediend via subcutane injectie voor post-operatieve pijnverlichting.
- Na de operatie dieren individueel worden gehuisvest en onderhouden op warmte mats tot volledig hersteld.
- Monitor dieren tweemaal daags manifestaties van pijn en gewichtsverlies. We namen geen grove gedragsmatige uitingen van pijn of gewichtsverlies.
7. Wond Meting en behandeling
- De wond kan dagelijks worden gemeten.
- Induceren algehele anesthesie met 5% isofluraan gas (debiet 1 L / min), en vervolgens zorgen voor de diepe zintuiglijke reflexen van de muis worden onderdrukt met behulp van 1-3% isofluraan.
- Haal voorzichtig terug het afsluitend verband met een tang.
- Gebruik chirurgische remklauwen aan de wond diameter meten. We nemen het gemiddelde van drie metingen langs de X, Y en Z-as (figuur 2m-2o) en een microfoto voor toekomstig gebruik (figuur 2p).
- Optioneel: Op dit moment is het dier kan worden beoordeeld voor de doorbloeding met behulp van een laser Doppler imager (figuur 2q).
- Re-toepassing van de therapeutische verbinding en de controle over het voertuig kunnen prestaties wordenmed op dit punt.
- Een schone transparante afsluitend verband wordt dan opnieuw aangebracht en de dieren warm gehouden tot ze volledig hersteld.
- Opmerking: als spalken niet goed beveiligd zijn de wond zal gemakkelijk samentrekken (figuur 2r).
8. Histologische analyse
- Euthanaseren de muizen na 10 dagen met een overdosis van anesthesie.
- Met behulp van een tang en een scalpel verwijdert de hechtingen en voorzichtig afpellen de spalk.
- Gebruik iris schaar om een brede, volledige excisie creëren rond en onder het wondgebied en incubeer het weefsel in 4% paraformaldehyde in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 ° C overnacht.
- Overdracht weefsel tot 17% sucrose in PBS oplossing nog eens 24 uur bij 4 ° C verwijder overmaat oplossing door voorzichtig deppen op weefsel en plaats in OCT verbinding en bevroren bij -80 ° C.
- Hematoxyline en eosine kleuring kan worden gebruikt om de wond structuur en epitheliale gap visualiseren. Neovascularisation kan worden vastgesteld door immunohistochemische analyses van het aantal capillairen (met von Willebrand factor) te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wondsluitingstelsel curve wordt bepaald door de gemiddelde diameter van de wond en het uitdrukken van de resultaten als een percentage, dat wil zeggen 100 - (Dag 0 diameter / dag X diameter). In dit experiment een therapeutische verbinding (of voertuig controle) werd dagelijks aangebracht op de wond. De therapeutische verbinding sterk versneld wonden (figuur 3). Het is belangrijk op te merken dat de spalken moet worden gehandhaafd gedurende de duur van het experiment, het verwijderen van spalken zal leiden tot een snelle wondcontractie (figuur 2r) en afwijken van het patroon van wondgenezing bij de mens.
Figuur 1. Schematische weergave van de murine wondgenezing model. In dit model twee full thickness wonden worden geregistreerd op either kant van de middellijn zodat elke muis om te dienen als hun eigen controle. Silicone spalken worden nageleefd en gehecht aan de wond omtrek om wondcontractie voorkomen, die een model repliceerbaar met die van mensen.
Figuur 2. Wondgenezing chirurgie en post-operatieve metingen. Na ontharing en voorbereiding van de huid met jodium en alcohol (ab) een biopsie pons voorzichtig om twee cirkels schetsen op het dorsale gedeelte, aan weerszijden van de middellijn. (C) een kleine incisie Vervolgens wordt gemaakt en (d) een rond stukje huid wordt verwijderd, (e) zoals de panniculosus carnosus, (f) twee volledige dikte wonden maken. (g) Lijm wordt dan aangebracht op de silic men spalken en de spalken gehandeld op de wond perimeter. (h) Spalken worden vervolgens vastgezet met hechtingen. (i) Behandelingen worden lokaal toegepast en (jk) een occlusieve, transparante folie wordt geplaatst over de wond en gehandeld op grond van de spalken (lijm kan indien nodig worden gebruikt). (l) Microfoto per dag drinkt en wondgebied wordt berekend uit het gemiddelde van drie metingen van de diameter (m) y-as (n) x-as en (o) z-as. (p ) Representatieve laser Doppler beeld van bloeddoorstroming van de wond een vertegenwoordiger foto van de wonden op dag 10, merkt de kleinere gewikkeld op rechts werd behandeld met een therapeutische verbinding. (q) op dag 6. (r) Voorbeeld van snelle wond krimp na verwijdering van de siliconen spalken.
65/50265fig3.jpg "alt =" Figuur 3 "fo: content-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/50265/50265fig3highres.jpg "/>
Figuur 3. Representatieve wondsluiting grafiek. Wound wordt berekend uit het gemiddelde van drie metingen per dag diameter langs de x, y en z-assen. Wondsluiting wordt uitgedrukt als een percentage van de oorspronkelijke wond op dag 0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit is een experimenteel muizenmodel van cutane wondgenezing. Een belangrijk kenmerk van dit model is het gebruik van siliconen spalken voorkomen wondcontractie zodat re-epithelialisatie en nieuwvorming weefsel optreden, zodat het op het proces dat plaatsvindt in mensen. Dit model is veelzijdig en kan worden gebruikt om wondheling in zowel fysiologische en pathofysiologische (bijvoorbeeld diabetes mellitus) waarden te beoordelen. Het model kan ook worden gebruikt om potentiële wondgenezing of angiogenese therapieën op economische omgeving beoordelen. Bij elke muis die als zijn eigen controle, ook het aantal dieren tot een minimum beperkt. De chirurgische technieken die voor dit model zijn niet zeer geavanceerd, waardoor dit model op grote schaal kunnen worden gebruikt door mensen met relatief weinig chirurgische ervaring.
De reproduceerbaarheid en kwantificatie waarborgen is het noodzakelijk dat de splint voldoende is gehecht en verankerd aan de huid met hechtingen, en dat thier minimale vertraging tussen het maken van de twee wonden. De neiging van muizen wonden snel te contracteren volgende versoepeling van de spalk of gedeeltelijke verwijdering vanwege krassen door de muis vereist dagelijkse monitoring van de spalken. Zorgvuldige toepassing van hechtmiddel moet ook irritatie van gezonde huid te minimaliseren in de spalk die kunnen bevorderen krabben. Het is ook heel belangrijk om aseptische technieken te volgen en grondig desinfecteren apparatuur, in het bijzonder de remklauwen, tussen muizen. De toepassing van het afsluitend verband moet ook worden overwogen, vooral als wonden niet zullen dagelijks worden behandeld of aangekleed. Opsite en Tegaderm (3M) dressings vergelijkbaar 12, en het is aangetoond dat Tegaderm verbanden slechts mag blijven gehecht gedurende 1-2 dagen. Indien langere termijn wondverbanden vereist een alternatieve benadering is beschreven door Chung en collega 13.
Potentiële zwakke punten van dit model kan onder andere ontsteking d ue de verankering van hechtingen, de verspreiding van de behandeling of voertuig tussen de wonden en de vermelding van de behandeling in de systemische circulatie. Met betrekking tot de hechtingen veroorzaken plaatselijke ontsteking, worden de hechtingen relatief ver uit de wond geplaatst en aangezien elke wond gemaakt hetzelfde, derhalve geen ontsteking die kunnen optreden tussen soortgelijke wonden moeten zijn. Evenzo zou de afstand tussen de wonden en het ontbreken van oedeem tussen de wonden diffusie tussen de twee bedden minimaliseren. Er is enig bewijs dat een behandeling de systemische circulatie, die versnellen de genezing van de wond 9,10 control kunnen komen. Voorzover van een behandeling die in de systemische circulatie te bepalen, kan hetzelfde nest muizen worden gebruikt, waarbij de twee wonden alleen met het medium. De verschillen in de tarieven van de wondsluiting tussen muizen behandeld met het voertuig alleen, en de muizen die zowel het voertuig en de behandeling zou dan kunnen worden vergeleken.
"> Concluderend hebben we aangetoond een relatief eenvoudige muizenmodel van wondgenezing dat veel van de functies waargenomen in menselijke wondgenezing vertoont.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag om de financiering te erkennen dat zij steun van de National Health en Medical Research Council (NHMRC) van Australië (Project Grant ID: 632512). Louise Dunn werd ondersteund door een NHMRC Early Career Fellowship en Christina Bursill door een National Heart Foundation Career Development Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick | Invitrogen | P18178 | Cut into "donuts" with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter |
| Biopsy punch 5 mm | Steifel | BC-B1-0500 | To outline wound area to be excised |
| Vannas scissors 8.5 cm curved | World Precision Instruments | 501232 | For wound incision and excision |
| Dumonte #7b forceps, 11 cm | World Precision Instruments | 501302 | To grip skin when creating incision and excising skin |
| Graefe forceps, serrated 10cm | World Precision Instruments | 14142 | To help attach silicone splint to skin |
| Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm | World Precision Instruments | 14132 | |
| Malis forceps, smooth, straight, 12 cm | Codman and Shurtleff, Inc (J&J) | 80-1500 | To suture the silicon rings to the skin |
| Ruler, 0.5 mm gradation | n/a | ||
| Calipers 0.25 mm gradation | Duckworth and Kent | 9-653 | To measure wound area |
| Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m | Smith & Nephew | 66030570 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Pfizer | 462986 |
References
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair. 17, 763-771 (2009).
- Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17, 1-18 (2009).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y.
- Lindblad, W. J. Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).
- Grose, R., Werner, S. Wound-healing studies in transgenic and knockout mice. Mol. Biotechnol. 28, 147-166 (2004).
- Reid, R. R., Said, H. K., Mogford, J. E., Mustoe, T. A. The future of wound healing: pursuing surgical models in transgenic and knockout mice. J. Am. Coll. Surg. 199, 578-585 (2004).
- Fang, R. C., Mustoe, T. A. Animal models of wound healing: utility in transgenic mice. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 989-1005 (2008).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 969618 (2011).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t, Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair. 12, 485-492 (2004).
- Galiano, R. D., et al. Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells. The American Journal of Pathology. 164, 1935-1947 (2004).
- Thangarajah, H., et al. The molecular basis for impaired hypoxia-induced VEGF expression in diabetic tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13505-13510 (2009).
- Raza, A., Bayles, C., Biebel, D. Investigation of Bacterial Growth and Moisture Handling Properties of Transparent Dressings: 3M Tegaderm Transparent Dressing, 3M Tegaderm HP Transparent Dressing, and Opsite IV3000 Transparent Dressing. Smith and Nephew Report. , (1998).
- Chung, T. Y., Peplow, P. V., Baxter, G. D. Testing photobiomodulatory effects of laser irradiation on wound healing: development of an improved model for dressing wounds in mice. Photomed. Laser Surg. 28, 589-596 (2010).
