Summary
Un modèle murin de la cicatrisation cutanée qui peut être utilisé pour évaluer les composés thérapeutiques dans des contextes physiologiques et physiopathologiques.
Abstract
La cicatrisation des plaies et la réparation sont des processus biologiques les plus complexes qui se produisent dans la vie humaine. Après une blessure, de multiples voies biologiques s'activent. La cicatrisation des plaies, qui se produit chez les patients diabétiques par exemple, peut conduire à des résultats défavorables sévères telles que l'amputation. Il est, par conséquent, un élan croissant de développer de nouveaux agents qui favorisent la cicatrisation des plaies. Les essais de ces a été limitée aux grandes modèles animaux comme la viande porcine, qui sont souvent impraticables. Souris représentent le modèle préclinique idéal, car ils sont économiques et se prêtent à la manipulation génétique, ce qui autorise des investigations mécaniste. Cependant, la cicatrisation des plaies chez une souris est fondamentalement différente de celle de l'homme comme cela se fait principalement par l'intermédiaire de la contraction. Notre modèle murin surmonte ce en intégrant une attelle autour de la plaie. Moyen d'une attelle la plaie, le processus de réparation est alors dépendante de l'épithélialisation, la prolifération cellulaire et l'angiogenèse, qui reflètent étroitement lales processus biologiques de cicatrisation des plaies de l'homme. Bien que nécessitant cohérence et de soins, ce modèle murin ne comporte techniques chirurgicales complexes et permet de tester robuste des agents prometteurs qui peuvent, par exemple, favoriser l'angiogenèse ou inhiber l'inflammation. En outre, chaque souris agit comme son propre contrôle en deux plaies sont préparés, permettant l'application à la fois le composé d'essai et la commande du véhicule sur le même animal. En conclusion, nous démontrons un modèle pratique, facile à apprendre et robuste de cicatrisation de la plaie, ce qui est comparable à celle des humains.
Introduction
La cicatrisation des plaies est responsable de morbidité et de mortalité dans le monde entier significative, ce qui est particulièrement vrai pour les personnes souffrant de diabète sucré de 1,2. Chez l'être humain, la cicatrisation des plaies est un continuum de processus, dans lequel il est important de chevauchement 3. Immédiatement processus inflammatoires, blessant suivantes sont initiées. Les cellules inflammatoires libèrent des facteurs qui favorisent les processus de prolifération cellulaire, la migration et l'angiogenèse. Après réépithélisation et la formation de nouveaux tissus il ya une phase de rénovation qui implique à la fois l'apoptose et la réorganisation des protéines de la matrice comme le collagène.
La complexité de la cicatrisation ne peut actuellement pas être reproduit in vitro, ce qui nécessite l'utilisation de modèles animaux. À ce jour, les études de cicatrisation ont été limitées aux grands modèles d'origine animale, comme la viande porcine, afin de s'assurer que le processus de guérison sont équivalentes et comparables pour les humains. Toutefois, l'utilisation à grande animals pour de telles études peuvent être difficiles à la maison et ne sont pas toujours pratique 4. La souris de laboratoire représente un modèle animal économique qui peut être facilement manipulé génétiquement pour enquête mécaniste 5-7. Cependant, les blessures guérissent murins différemment à de l'homme, principalement en raison du processus de contraction 8. Ceci est dû en partie à une vaste couche de muscle strié sous-cutanée appelée panniculus carnosus qui est largement absente chez les humains. Chez la souris, cette couche musculaire permet à la peau de se déplacer indépendamment des muscles plus profondes et est responsable de la contraction rapide des blessures de la peau suivant.
Pour contourner cette limitation, la cicatrisation murin peut être adapté pour reproduire la cicatrisation des plaies de l'homme par l'utilisation d'une attelle (Figure 1) 8,9. Dans cette vidéo, nous démontrons le modèle murin de la plaie attelle qui élimine contraction de la plaie et se rapproche plus étroitement les processus humains de re-epithelialization et la formation de nouveaux tissus. Dans ce modèle, deux excisions pleine épaisseur qui incluent le panniculus carnosus sont créés sur le dos, un de chaque côté de la ligne médiane de la souris. Une attelle silicone est placé autour de la plaie à l'aide d'un adhésif et l'attelle ensuite fixé avec des sutures interrompues. Chaque souris agit comme son propre contrôle, avec une plaie de recevoir un traitement et l'autre contrôle du véhicule, réduisant ainsi le nombre d'animaux. Après applications topiques, un pansement occlusif transparent est appliqué. Le pansement peut être retiré en cas de besoin pour d'autres applications topiques et / ou la mesure de la surface de la plaie 10,11. À l'issue d'expériences, la fermeture des plaies, l'architecture morphologique et le degré de néovascularisation peut être évalué par immunohistochimie. Cette solution économique et facile à effectuer modèle peut également être utilisé pour évaluer la cicatrisation des plaies dans le cadre d'un diabète ou d'autres pathophysiologies.
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Protocol
1. Préparation des attelles et des pansements occlusifs
- Décrivez 10 cercles mm sur 0,5 mm feuilles de silicone épais et utiliser des ciseaux ou un biopsie pour créer des disques de silicone.
- Centre mm de biopsie 5 dans le milieu du cercle mm 10 et appuyez fermement pour créer un trou pour former un "donut"-comme disque qui sera utilisé comme une attelle.
- Décrivez 10 cercles mm sur un pansement occlusif transparent comme Opsite et utiliser des ciseaux pour créer des pansements circulaires.
2. Animaux de laboratoire
- Obtenir l'approbation du comité d'éthique animale pour toutes les expériences qui seront effectuées.
- Utilisez âgées de 8 semaines (22-26 grammes) C57BL/6J mâles chez un éleveur commercial (par exemple, les Jackson Laboratories).
- Gardez souris dans des conditions standard de 21 ° C et un cycle lumière-obscurité de 12 heures avec un accès libre à la nourriture et à l'eau.
- (Facultatif): Le diabète peut être induite dans les 6 à 7 semaines souris par un bolus intra-péritonéale Injection de 165 mg / kg de streptozotocine (dans un tampon citrate, pH 4,5), l'hyperglycémie confirmée par un contrôle de la glycémie normale (Accuchek glucomètre). Souris diabétiques peuvent avoir polyurie et ainsi de leur litière peuvent avoir besoin d'être changé plus souvent pour éliminer l'humidité et leur poids doivent être étroitement surveillés.
3. Anesthésie et préparation d'Exploitation
- Induire une anesthésie générale en utilisant 5% d'isoflurane dans 100% d'oxygène (débit de 1 l / min) et maintenir une anesthésie avec 1-3% d'isoflurane.
- S'assurer que les réflexes de pédale profondes de la souris sont supprimées et placer la souris dans la position couchée.
- Préparer la zone opératoire en supprimant la fourrure avec une tondeuse à partir de la base du cou à 3 cm plus bas dans le dos et entre les deux omoplates.
- Une légère application de crème dépilatoire peut être appliquée pendant une durée de 2 min. Des tampons de gaze humide peuvent être utilisés pour assurer toutes les crèmes et le reste fourrure est enlevée.
- Essuyez la peau avec untampon imbibé d'alcool et deux applications de 10% de povidone-iode (Betadine) et drapé de la souris.
4. L'excision et la contention de la plaie
- Représentation schématique du modèle de cicatrisation murin est présentée dans la figure 1.
- Utiliser un stérile mm biopsie 4 à esquisser deux motifs circulaires pour la blessure de chaque côté de la ligne médiane de la souris au niveau des épaules (voir figures 2a-2b).
- Utilisez une pince dentelés pour soulever la peau au milieu de l'esquisse et ciseaux à iris pour créer une plaie de pleine épaisseur qui s'étend à travers le tissu sous-cutané (figures 2c-2d), y compris le panniculus carnosus (figure 2e), et de l'accise de la pièce circulaire du tissu.
- Répéter le processus pour la blessure de l'autre côté de la ligne médiane (figure 2f).
- Supprimer revêtement de protection en matière plastique à partir de chaque côté de l'attelle de silicone.
- Appliquer cyanoacrylate colle (par exemple Super Glue ou Krazy Glue) d'un côté d'une attelle silicone.
- Centre de l'attelle sur la plaie (figure 2g) et ancre l'attelle avec interrompues 6-0 fils de nylon pour assurer un positionnement (figure 2h).
- Répétez le processus contention d'autre blessure.
- En cas de besoin à ce point de temps, appliquer le composé thérapeutique à tester (jusqu'à 100 ul) à une plaie (figure 2i), et le contrôle du véhicule à l'autre.
- Recouvrez la plaie avec un pansement occlusif transparent (par exemple, OpSite) (figure 2j-2k).
- Une règle est placée sous les gouttières et une microphotographie prise (Figure 2l).
6. Gestion postopératoire
- Carprofène (5 mg / kg) est administré une fois par jour par injection sous-cutanée pour le soulagement de la douleur post-opératoire.
- Après que les animaux de chirurgie sont en cage individuellement et maintenus à feu mats jusqu'à ce que complètement rétabli.
- De surveiller les animaux deux fois par jour pour les manifestations de douleur et de perte de poids. Nous n'avons observé aucune affiche comportement brut de la douleur ou de la perte de poids.
7. Mesure et traitement des plaies
- La blessure peut être mesurée quotidiennement.
- Induire une anesthésie générale en utilisant 5% de gaz isoflurane (débit de 1 L / min), puis s'assurer que les réflexes sensoriels profonds de la souris sont supprimées en utilisant 1-3% d'isoflurane.
- Délicatement décoller le pansement occlusif avec une pince.
- Utilisez étriers chirurgicales pour mesurer le diamètre de la plaie. Nous prenons la moyenne des trois mesures le long des axes X, Y et Z (Figures 2m-2o) ainsi que d'une microphotographie pour référence future (figure 2p).
- Facultatif: Pour le moment l'animal peut être évalué pour la perfusion de sang en utilisant un appareil d'imagerie laser Doppler (figure 2 po).
- Ré-application du composé thérapeutique et la commande du véhicule peuvent être effectuées quemed à ce point.
- Un pansement occlusif transparent propre est ensuite ré-appliquée et les animaux gardés au chaud jusqu'à ce que complètement rétabli.
- Note: si attelles ne sont pas sécurisés correctement la plaie va se contracter facilement (figure 2r).
8. L'analyse histologique
- Euthanasier les souris après 10 jours avec une surdose d'anesthésique.
- En utilisant des pinces et d'un scalpel enlever les sutures et décoller délicatement l'attelle.
- Utilisez des ciseaux iris pour créer une large excision complète autour et sous la surface de la plaie et incuber le tissu dans du paraformaldéhyde 4% dans du tampon phosphate salin (PBS) à 4 ° C pendant la nuit.
- Transfert tissus à 17% de saccharose dans une solution de PBS pour une nouvelle heure 24 à 4 ° C puis retirez l'excès de solution en tamponnant délicatement sur le tissu et le placer dans du composé OCT et congeler à -80 ° C.
- Hématoxyline et éosine peuvent être utilisés pour visualiser la structure de la plaie et l'écart de l'épithélium. Neovascularisation peut être évaluée par des analyses d'immunohistochimie pour déterminer le nombre de capillaires (à l'aide du facteur Von Willebrand).
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Representative Results
Une courbe de fermeture de la plaie est déterminé en calculant le diamètre moyen de la plaie et d'exprimer les résultats sous forme de pourcentage, soit 100 - (Jour 0 / diamètre diamètre du Jour de X). Dans cette expérience, un composé thérapeutique (ou le contrôle du véhicule) a été appliqué quotidiennement sur la plaie. Le composé thérapeutique de fermeture de plaies fortement accélérée (Figure 3). Il est important de noter que les attelles doivent être conservés pendant la durée de l'expérience, que l'élimination des attelles mènera à contraction rapide de la blessure (figure 2r) et s'écarter du modèle de cicatrisation observé chez l'homme.
Figure 1. Représentation schématique du modèle de cicatrisation murin. Dans ce modèle, deux coups de pleine épaisseur sont créés sur l'assurance-emploicôté ther de la ligne médiane permettant à chaque souris pour servir leur propre contrôle. attelles de silicone sont collées et suturés sur le périmètre de la plaie pour empêcher la contraction de la plaie, en fournissant un modèle à reproduire à celle de l'homme.
Figure 2. chirurgie de la guérison des plaies et des mesures post-chirurgicales. Après l'épilation et la préparation de la peau avec de l'iode et de l'alcool (ab) une biopsie est doucement utilisés pour décrire deux cercles sur le dos, de chaque côté de la ligne médiane. (c) Une petite incision est ensuite créé, et (d) un morceau circulaire de la peau est éliminé, (e) comprenant l'panniculosus carnosus, (f) pour créer deux plaies de pleine épaisseur. (g) adhésif est ensuite appliqué sur la silic un attelles et les attelles ont adhéré à la périphérie de la plaie. (h) attelles sont ensuite maintenus avec des points. (i) Les traitements sont appliqués localement et (jk) une occlusive, pansement transparent est placé sur la plaie et respectées les attelles (adhésif peut être utilisés si nécessaire). (l) microphotographies sont prises par jour et de la zone de la plaie est calculée à partir de la moyenne des trois mesures de diamètre sur l'axe y, (n), l'axe des x (m) et (o) de l'axe z. (p ) Une photo représentant des blessures au jour 10, notant la plaie plus petit sur le droit qui a été traité avec un composé thérapeutique. (q) représentant l'image laser Doppler de la perfusion de sang de la plaie au jour 6. (r) Exemple de blessure rapide contraction après le retrait des attelles en silicone.
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Figure 3. graphique de fermeture de plaies représentatif. surface de la plaie est calculée à partir de la moyenne des trois mesures du diamètre quotidiens le long de l'axe z axes x, y et. fermeture de plaie est exprimée en pourcentage de la surface initiale de la plaie au jour 0.
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Discussion
Il s'agit d'un modèle expérimental murin de la cicatrisation cutanée. Une caractéristique importante de ce modèle est l'utilisation d'attelles en silicone pour empêcher la contraction de la plaie afin que réépithélisation et la formation de nouveaux tissus peuvent se produire, ce qui en fait similaire au processus qui se produit chez l'homme. Ce modèle est polyvalent et peut être utilisé pour évaluer la cicatrisation des plaies dans les milieux physiologiques et physiopathologiques (diabète sucré). Le modèle peut également être utilisé pour évaluer la cicatrisation des plaies ou potentiel thérapeutique de l'angiogenèse dans un cadre économique. Avec chaque souris agissant comme son propre témoin, le nombre d'animaux sont minimisés. Les techniques chirurgicales requises pour ce modèle ne sont pas très sophistiqués, donc ce modèle peut être largement utilisé par ceux qui ont relativement peu d'expérience chirurgicale.
Pour assurer la reproductibilité et la précision de quantification, il est impératif que l'attelle est suffisamment respecté et ancré à la peau avec des sutures, et que tici est un minimum de retard entre la création de deux plaies. La propension des blessures murins de contracter rapidement après relâchement de l'attelle ou partielle retrait dues au grattage de la souris nécessite un suivi quotidien des attelles. L'application d'adhésifs est également nécessaire pour minimiser l'irritation de la peau saine autour de l'attelle qui peut favoriser les rayures. Il est également très important de suivre les techniques d'asepsie et désinfectez soigneusement l'équipement, en particulier les étriers, entre les souris. L'application du pansement occlusif doit également être envisagée, surtout si les blessures ne vont pas être traitée ou habillé quotidien. Opsite et Tegaderm (3M) pansements sont comparables 12, et il a été montré que les pansements Tegaderm ne peuvent rester collé pendant 1-2 jours. Si les pansements à plus long terme seront nécessaires une approche alternative a été décrite par Chung et ses collègues 13.
Les faiblesses potentielles de ce modèle peuvent inclure inflammation d ue pour l'ancrage des sutures, la diffusion du traitement ou du véhicule entre les blessures et l'entrée du traitement dans la circulation systémique. En ce qui concerne les sutures induisant une inflammation locale, les sutures sont placées relativement loin de la plaie et que chaque blessure est créé la même chose, donc toute inflammation qui peut se produire devrait être similaire entre les blessures. De même, la distance entre les blessures et un manque d'oedème entre les blessures serait minimiser la diffusion entre les deux lits. Il existe certaines preuves que le traitement peut entrer dans la circulation systémique, ce qui peut accélérer la guérison du contrôle enroulé 9,10. Pour déterminer l'étendue d'un traitement entrant dans la circulation systémique, les souris de même portée pourraient être utilisés, dans lequel les deux plaies ne sont traités avec le véhicule. Les différences dans les taux de fermeture de la plaie entre les souris traitées avec le véhicule seulement, et les souris recevant à la fois véhicule et de traitement pourraient ensuite être comparés.
»> En conclusion, nous avons démontré un modèle murin relativement simple de la cicatrisation qui présente de nombreuses caractéristiques observées dans la cicatrisation des plaies de l'homme.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le soutien financier du Conseil de recherches médicales (NHMRC) de l'Australie (Project Grant ID: 632512) Santé nationale et du. Louise Dunn a été soutenue par un début de carrière NHMRC Fellowship et Christina Bursill par une Fondation carrière Bourse nationale de développement du coeur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick | Invitrogen | P18178 | Cut into "donuts" with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter |
| Biopsy punch 5 mm | Steifel | BC-B1-0500 | To outline wound area to be excised |
| Vannas scissors 8.5 cm curved | World Precision Instruments | 501232 | For wound incision and excision |
| Dumonte #7b forceps, 11 cm | World Precision Instruments | 501302 | To grip skin when creating incision and excising skin |
| Graefe forceps, serrated 10cm | World Precision Instruments | 14142 | To help attach silicone splint to skin |
| Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm | World Precision Instruments | 14132 | |
| Malis forceps, smooth, straight, 12 cm | Codman and Shurtleff, Inc (J&J) | 80-1500 | To suture the silicon rings to the skin |
| Ruler, 0.5 mm gradation | n/a | ||
| Calipers 0.25 mm gradation | Duckworth and Kent | 9-653 | To measure wound area |
| Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m | Smith & Nephew | 66030570 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Pfizer | 462986 |
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