Summary
Fizyolojik ve patofizyolojik ortamlarda terapötik bileşiklerini değerlendirmek için de kullanılabilir deri yara iyileşmesinin Bir murin modeli.
Abstract
Yara iyileşmesi ve onarım insan hayatta meydana gelen en karmaşık biyolojik süreçleri bulunmaktadır. Yaralanma sonrası, birden fazla biyolojik yollar aktif hale gelir. Örneğin diyabetli hastalarda görülür Engelli yara iyileşmesi, bu amputasyon gibi ciddi olumsuz sonuçlara yol açabilir. Yara onarımı teşvik yeni ilaçlar geliştirmek için giderek artan bir ivme nedenle, var. Bunların test gibi genellikle pratik değildir domuz gibi büyük hayvan modellerinde sınırlı kalmıştır. Bu ekonomik ve mekanik soruşturma için izin verir genetik manipülasyon, mükellef olarak fareler, ideal klinik öncesi modeli temsil eder. Ancak, öncelikle daralma yoluyla gerçekleşir olarak bir fare iyileşme insanlarınkine temelden farklıdır sarılır. Bizim fare modeli yara etrafında bir atel dahil ederek bu üstesinden gelir. Yara splintleme olarak, onarım işlemi yakından ayna epitelizasyon, hücre çoğalması ve anjiyogenez, ardından bağlıdırinsan yara iyileşmesinin biyolojik prosesler. Tutarlılık ve bakım gerektiren iken, bu fare modeli karmaşık cerrahi teknikleri içerir ve örneğin, damar gelişimini inhibe edebilir ya da iltihap umut vaat eden maddelerin güçlü bir test edilmesine izin vermektedir. Iki yara hazırlanır Dahası, her bir fare, test bileşiği ve aynı hayvan üzerinde araç kontrolü, hem de uygulama sağlayan, kendi kontrolü olarak görev yapar. Sonuç olarak, biz insanların bu karşılaştırılabilir yara iyileşmesi, pratik bir,-öğrenmek için kolay ve güçlü modeli göstermektedir.
Introduction
Bozulmuş yara iyileşmesi önemli morbidite ve tüm dünyada ölüm sorumludur, bu diyabet 1,2 olanlar için geçerlidir. İnsanlarda, yara iyileşmesi 3 örtüşen önemli var olduğu, süreçlerin bir süreklilik olduğunu. Hemen sonra yaralama, inflamatuvar süreçleri başlatılır. Inflamatuar hücreler hücre çoğalması, göç ve anjiyogenez süreçleri teşvik faktörler bırakın. Reepitelizasyon ve yeni doku oluşumu sonra bu kollajen gibi matriks proteinlerinin apoptoz ve yeniden organizasyon hem de gerektirir yeniden bir aşaması vardır.
Yara iyileşmesinin karmaşıklığı şu in vitro çoğaltılması ve bu hayvan modellerinin kullanılması gerekmektedir edilemez. Bugüne kadar, yara iyileşmesi çalışmaları iyileşme süreçleri eşdeğer ve insanlar için benzer olmasını sağlamak için, bu tür domuz gibi büyük hayvan modelleri ile sınırlı kalmıştır. Ancak, büyük anima kullanarakbu tür çalışmalar için ls evine zor ve her zaman pratik 4 değildir olabilir. Laboratuvar fare kolayca genetik 5-7 mekanik soruşturma için manipüle edilebilir ekonomik bir hayvan modeli temsil eder. Ancak, fare yaralar daralma 8 sürecinde öncelikle nedeniyle, insan için farklı iyileşir. Bu da, kısmen, insanlarda büyük ölçüde eksik olan istemsiz carnosus adlandırılan geniş bir deri altı çizgili kas tabakası kaynaklanmaktadır. Farelerde, bu kas tabakası deriye bağımsız olarak derin kas hareket etmesine olanak sağlar ve cilt aşağıdaki yaralama hızlı daralma sorumludur.
Bu sınırlamayı aşmak için, sıçangil yara iyileşmesi bir splintin kullanımı (Şekil 1) 8,9 insan yara iyileşmesi çoğaltmak için adapte edilebilir. Bu videoda yeniden epithelializa insan süreçleri yara daralma ortadan kaldırır ve daha yakından yaklaşık olarak atel fare yara modeli göstermektion ve yeni doku oluşumu. Bu modelde panniculus carnosus içeren iki tam kat eksizyon fare orta hat her iki tarafında sırtı, bir oluşturulur. Bir silikon atel yapıştırıcı yardımı ile yara etrafına yerleştirilen ve atel sonra kesilen dikişlerle sabitlenir. Her fare böylece hayvan sayısını azaltarak, bir yara tedavi ve diğer araç kontrol alma ile, kendi kontrol gibi davranır. Topikal uygulama sonrası, şeffaf bir kapalı pansuman uygulanır. Daha da topikal uygulamalar ve / veya yara bölgesinde 10,11 ölçümü için gerekli zaman sargı kaldırılabilir. De deneylerin tamamlanması, yara kapama, morfolojik mimari ve neovaskülarizasyon derecesi immünohistokimyasal olarak değerlendirilebilir. Bu ekonomik ve model yapmak kolay da diyabet veya diğer patofizyolojilere bağlamında yara iyileşmesi değerlendirmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ateller ve Tıkayıcı Pansuman hazırlanması
- 0.5 mm kalınlığında silikon kaplama ve kullanım makas veya silikon diskler oluşturmak için bir biyopsi yumruk 10 mm daireler Anahat.
- Merkezi 10 mm dairenin ortasında bir 5 mm biyopsi yumruk ve bir atel olarak kullanılacak disk gibi-bir "halka" oluşturmak için bir delik oluşturmak için sıkıca bastırın.
- Bu Opsite ve dairesel pansuman oluşturmak için kullanımı makas gibi şeffaf bir kapalı pansuman 10 mm daireler Anahat.
2. Deney Hayvanları
- Yapılacak tüm deneyler için Hayvan Etik Kurulu onayı alın.
- Ticari bir damızlık (örneğin Jackson Laboratories) 8 haftalık (22-26 gram) erkek C57BL/6J fareler kullanın.
- 21 standart koşullar altında farenin Ol ° C ve yiyecek ve suya serbest erişim ile, 12 saat ışık-karanlık çevrimi.
- (İsteğe bağlı): Diyabet bir bolus intraperitoneal inje tarafından 6 ila 7 haftalık farelerde neden olabilirDüzenli kan şekeri izleme (AccuChek glucometer) ile teyit hiperglisemi ile 165 mg / kg streptozotosin (sitrat tamponu, pH 4,5) bir ction,. Diyabetik farelerde poliüri olabilir ve böylece yatak ıslaklık ortadan kaldırmak için ve ağırlıkları yakından izlenmelidir daha sık değiştirilmesi gerekebilir.
3. Anestezi ve Operatif Hazırlık
- % 100 oksijen izofluran% 5 (akış hızı 1 L / dk) ile genel anestezi neden ve izofluran% 1-3 ile anestezi korumak.
- Bastırılır fare derin pedal refleksleri olun ve yüzüstü pozisyonda fare yerleştirin.
- Daha da geri ve iki kürek kemikleri arasında 3 cm boyun tabanından kesme makineleri ile kürk kaldırarak ameliyat bölgesi hazırlayın.
- Tüy dökücü krem hafif bir uygulama 2 dakika daha uzun süre uygulanabilir. Islak gazlı bezlerden tüm krem sağlamak için kullanılabilir ve kalan kürk kaldırılır.
- Bir ile cilt silinalkol sürüntü ve% 10 iki uygulama povidon-iyot (Betadine) ve fare asmak.
4. Eksizyon ve Yara splintleme
- Fare yara iyileşme modeli şematik gösterimi Şekil 1'de sunulmuştur.
- (Şekil 2A-2B) omuz hizasında fare orta hattın her iki tarafında yara için iki adet dairesel model anahat steril bir 4 mm biyopsi yumruk kullanın.
- Anahat ve istemsiz, carnosus (Şekil 2e) de dahil olmak üzere deri altı doku (Şekil 2c-2d), boyunca devam eden tam kat yara oluşturmak için iris makası ortasında cilt kaldırmak için dişli forseps kullanın ve tüketim dairesel parça doku.
- Orta hat (Şekil 2f) diğer tarafında yara için işlemi tekrarlayın.
- Silikon atel her taraftan plastik koruyucu kaplama çıkarın.
- Cyanoacryla uygulayınte yapıştırıcı (örneğin Super Glue veya Krazy Tutkal) bir silikon atel bir tarafa.
- Merkezi yara üzerinde atel (Şekil 2g) ve çapa konumlandırma (Şekil 2 saat) sağlamak için kesintiye 6-0 naylon sütür ile atel.
- Diğer yara üzerindeki splintleme işlemi tekrarlayın.
- Bu zaman noktasında gerekli ise, bir yara (Şekil 2i) ve diğer araç kontrolü için, test edilecek olan tedavi edici bileşik (100 ul) uygulanır.
- Şeffaf bir oklüzif sargı (örneğin, OpSite) (Şekil 2J-2k) ile yara kapsamaktadır.
- Bir cetvel atel altına yerleştirilir ve bir fotomikrograf (2l Şekil) alınır.
6. Ameliyat sonrası Yönetimi
- Carprofen (5 mg / kg) ameliyat sonrası ağrı kesici için alt deri enjeksiyon yoluyla günde bir kez uygulanır.
- Ameliyat hayvan ayrı ayrı kafeslerde tutuldu ve ısı m muhafaza edildikten sonraats tamamen iyileşti kadar.
- Ağrı ve kilo kaybı bulguları için günde iki kez hayvan izleyin. Biz ağrı veya kilo kaybı hiçbir brüt davranış görüntüler görülmektedir.
7. Yara Ölçme ve Tedavi
- Yara, günlük olarak ölçülebilir.
- % 5 izofluran gaz (akış hızı 1 L / dk) ile genel anestezi neden, ve sonra fare derin duyu refleksleri sağlamak% 1-3 izofluran kullanılarak bastırılır.
- Forseps ile yavaşça geri kabuğu tıkayıcı pansuman.
- Yara çapının ölçülmesi için cerrahi kumpas kullanarak. Biz X, Y ve Z ekseni (Şekil 2m-2o) yanı sıra ileride (Şekil 2 p) için bir fotomikrograf boyunca üç ölçümün ortalama almak.
- İsteğe bağlı: Şu anda hayvan bir lazer Doppler görüntüleme (Şekil 2q) kullanarak kan perfüzyon için değerlendirilebilir.
- Tedavi edici bileşik ve araç kontrolü arasında yeniden uygulama performans olabilir,Bu noktada med.
- Temiz bir şeffaf kapalı pansuman sonra yeniden uygulanır ve tamamen iyileşti kadar hayvanların sıcak tutulur.
- Not: atel düzgün güvenli değilse yara kolayca sözleşme olacaktır (Şekil 2r).
8. Histolojik Analizi
- Anestezi aşırı dozda 10 gün sonra fareler Euthanize.
- Forseps kullanarak ve bir neşter bıçak sıyırın dikkatle atel dikişler çıkarın ve.
- Çevresinde ve yara alanı altında geniş bir tam eksizyon oluşturmak ve fosfat içinde% 4 paraformaldehit içinde doku inkübe iris makası kullanarak 4 ° C'da gece boyunca (PBS), tamponlu tuzlu su.
- ° C sonra -80 Ekim bileşik ve dondurularak doku ve yerine dikkatle dabbing aşırı çözeltinin ayrılması 4 ° C de 24 saat daha süreyle PBS çözeltisi içinde% 17 sukroz doku transferi
- Hematoksilin ve eozin boyama, yara yapısı ve epitel boşluğu görselleştirmek için kullanılabilir. Neovascularisation kılcal sayısı (Von Willebrand faktörü kullanılarak) belirlemek için immünohistokimyasal analizleri ile tespit edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
(Gün 0 çap / gün x çap) - bir yara kapatma kısmının eğri yaranın ortalama çapının hesaplanması ve bir yüzde, yani, 100 gibi sonuçlar ifade ile belirlenir. Bu deneyde, bir tedavi bileşiği (veya taşıyıcı ortam kontrol) yaraya günlük olarak uygulandı. Terapötik bileşim büyük ölçüde hızlandırılmış yara kapatma kısmının (Şekil 3). Bu atel çıkarıldıktan hızlı yara daralma (Şekil 2r) yol ve insanlarda görülen yara iyileşmesinin desen uzaklaşmaktadır gibi atel, deney süresince muhafaza edilmesi gerektiğini dikkat etmek önemlidir.
1 Şekil. Fare yara iyileşmesi modeli şematik gösterimi. Bu modelde iki tam kat yara ei oluşturulurHer fare kendi kontrolü olarak hizmet sağlayan orta hat orada yan. Silikon atel insanların buna tekrarlanabilir bir model sağlayan, yara daralma önlemek için yara çevresine yapıştırılır ve dikilir.
Şekil 2. Yara iyileşmesi cerrahi ve ameliyat sonrası ölçümleri. Iyot ve alkol ile cilt epilasyon ve hazırlık ardından (ab) biyopsi yumruk hafifçe orta hat her iki tarafında, sırtında iki daire anahat için kullanılır. (C) küçük bir kesi daha sonra oluşturulur ve (d) bir deri dairesel bir parça (e) (f) iki tam kalınlıkta yara oluşturmak için panniculosus carnosus de dahil olmak üzere kaldırılır. (g), daha sonra yapışkan silic uygulanır bir atel ve atel yara çevresine yapıştırılır. (h) Ateller sonra sütür ile teminat altına alınmıştır. (i) (yapışkan yapabilirsiniz Tedaviler topikal olarak uygulanır ve (jk) bir tıkayıcı, şeffaf pansuman yara üzerine yerleştirilir ve atel yapıştırılır Gerekirse) de kullanılabilir. (l) fotomikrografları her gün alınır ve yara alanı (m), y-ekseni, (n) x-ekseni ve (O) z-ekseni üzerinde üç çapı ölçümün ortalaması hesaplanır. (p 10. günde yaraların) Temsili nitelikte verilmedi terapötik bir bileşik ile muamele edilmiştir sağdaki küçük yara dikkat çekti. (q), yaranın kan perfüzyonunun Örnek lazer Doppler görüntüsü, 6. günde. (R), Örnek hızlı yara bölgesinin silikon atel çıkarıldıktan sonra daralma.
65/50265fig3.jpg "alt =" Şekil 3 "fo: içerik-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/50265/50265fig3highres.jpg "/>
Şekil 3,. Temsilcisi yara kapama grafik. Yara alan x, y ve z eksenleri boyunca üç günlük çapı ölçümün ortalaması hesaplanır. Yara kapanması 0. günde ilk yara alanının bir yüzdesi olarak ifade edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu deri yara iyileşmesinin deneysel fare modelidir. Bu modelin önemli bir özelliği, insanlarda oluşan işlemi için benzer hale reepitelizasyon ve yeni doku oluşumu meydana gelebilir, böylece yara büzülmesini önlemek için silikon splintlerin kullanılmasıdır. Bu model, çok yönlü ve fizyolojik ve patofizyolojik (örneğin, diyabet) ortamlarda yara iyileşmesi değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu model aynı zamanda ekonomik bir ortamda potansiyel yara iyileşmesi veya anjiyojenez tedavi değerlendirmek için kullanılabilir. Kendi kontrol görevi yapan her fare ile, hayvan sayıları en aza indirilir. Bu model için gerekli olan cerrahi teknikler böylece bu model yaygın nispeten daha az cerrahi deneyimi olanlar tarafından kullanılabilir, son derece gelişmiş değildir.
Bu atel yeterli yapışık ve dikiş ile cilt demirlemiş şarttır, ve t bu tekrarlanabilirlik ve doğru miktar sağlamak içinBurada iki yara oluşturma arasında minimum gecikme olduğunu. Fare yaraların eğilimi nedeniyle hızla fare atel günlük izlenmesini gerektirir tarafından çizilmeye için atel veya kısmi kaldırma aşağıdaki gevşeme sözleşme. Yapıştırıcı dikkatli uygulaması da çizilmeye teşvik edebilir atel etrafında sağlıklı cilt tahriş en aza indirmek için gereklidir. Bu aseptik teknikleri uygulayın ve iyice fareler arasında ekipman, özellikle kaliperler, dezenfekte etmek için de çok önemlidir. Yaralar günlük tedavi veya işlenmiş olacak değil, özellikle kapalı pansuman uygulanması da, göz önünde bulundurulmalıdır. Opsite ve Tegaderm (3M) sosları 12 karşılaştırılabilir ve Tegaderm sargılık sadece 1-2 gün boyunca yapışık olarak kalabilir gösterilmiştir. Uzun vadeli yara pansuman alternatif bir yaklaşım Chung ve arkadaşları 13 tarafından tarif edilmiştir gerekli olmalıdır.
Bu modelin potansiyel zayıf iltihabı d içerebilir sütür ankraj için ue, yara ve sistemik dolaşıma tedavi girişi arasında tedavisi ya da aracın difüzyon. Yerel inflamasyona neden dikişler ile ilgili olarak, dikişler yara nispeten uzak yerleştirilir ve her bir yara yaralar arasında benzer olmalıdır oluşabilir aynı, bu nedenle herhangi bir iltihap oluşturulur gibi. Benzer şekilde, yara ve yara arasında ödem eksikliği arasındaki mesafe, iki yatak arasında difüzyon en aza indirecektir. Bir tedavi kontrol iyileşmesi 9,10 yara hızlandırabilir sistemik dolaşıma, girebilirsiniz dair bazı kanıtlar vardır. Sistemik dolaşıma giren bir tedavi kapsamını belirlemek için, farenin Kardeş iki yara, sadece taşıyıcı ortam ile muamele edildiği, yararlanılabilir. Yara tek araç ile tedavi edilen farelerde arasında kapatılması, ve araç ve tedavi alan farelerin oranlarındaki farklılıklar daha sonra karşılaştırılabilir.
"> Sonuç olarak, insan yarası iyileşmesi gözlemlenen birçok özellikleri sergiler yara iyileşmesi nispeten basit bir fare modeli göstermiştir.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar, Ulusal Sağlık ve Avustralya Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) (: 632.512 Proje Hibe ID) fon desteği kabul etmek istiyorum. Louise Dunn Ulusal Kalp Vakfı Kariyer Geliştirme Bursu tarafından NHMRC Erken Kariyer Bursu ve Christina Bursill tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick | Invitrogen | P18178 | Cut into "donuts" with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter |
| Biopsy punch 5 mm | Steifel | BC-B1-0500 | To outline wound area to be excised |
| Vannas scissors 8.5 cm curved | World Precision Instruments | 501232 | For wound incision and excision |
| Dumonte #7b forceps, 11 cm | World Precision Instruments | 501302 | To grip skin when creating incision and excising skin |
| Graefe forceps, serrated 10cm | World Precision Instruments | 14142 | To help attach silicone splint to skin |
| Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm | World Precision Instruments | 14132 | |
| Malis forceps, smooth, straight, 12 cm | Codman and Shurtleff, Inc (J&J) | 80-1500 | To suture the silicon rings to the skin |
| Ruler, 0.5 mm gradation | n/a | ||
| Calipers 0.25 mm gradation | Duckworth and Kent | 9-653 | To measure wound area |
| Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m | Smith & Nephew | 66030570 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Pfizer | 462986 |
References
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair. 17, 763-771 (2009).
- Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17, 1-18 (2009).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Lindblad, W. J. Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).
- Grose, R., Werner, S. Wound-healing studies in transgenic and knockout mice. Mol. Biotechnol. 28, 147-166 (2004).
- Reid, R. R., Said, H. K., Mogford, J. E., Mustoe, T. A. The future of wound healing: pursuing surgical models in transgenic and knockout mice. J. Am. Coll. Surg. 199, 578-585 (2004).
- Fang, R. C., Mustoe, T. A. Animal models of wound healing: utility in transgenic mice. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 989-1005 (2008).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 969618 (2011).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t, Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair. 12, 485-492 (2004).
- Galiano, R. D., et al. Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells. The American Journal of Pathology. 164, 1935-1947 (2004).
- Thangarajah, H., et al. The molecular basis for impaired hypoxia-induced VEGF expression in diabetic tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13505-13510 (2009).
- Raza, A., Bayles, C., Biebel, D. Investigation of Bacterial Growth and Moisture Handling Properties of Transparent Dressings: 3M Tegaderm Transparent Dressing, 3M Tegaderm HP Transparent Dressing, and Opsite IV3000 Transparent Dressing. Smith and Nephew Report. , (1998).
- Chung, T. Y., Peplow, P. V., Baxter, G. D. Testing photobiomodulatory effects of laser irradiation on wound healing: development of an improved model for dressing wounds in mice. Photomed. Laser Surg. 28, 589-596 (2010).
