Summary
Nós desenvolvemos um método simples, confiável e relativamente barata para a intubação traqueal em ratos através de laringoscopia direta utilizando um otoscópio com um espéculo 2,0 mm. Esta técnica é não traumático e pode ser usado para as medições repetidas em experiências crónicas. Achamos superior à traqueostomia ou relatado anteriormente técnicas não cirúrgicas.
Abstract
Ratos, ambos do tipo selvagem e transgênica, são o modelo de mamíferos capital em pesquisa biomédica atualmente. Intubação e ventilação mecânica são necessários para experimentos com animais inteiros que necessitam de cirurgia sob anestesia profunda ou medidas de função pulmonar. A traqueostomia tem sido o padrão para entubar as vias aéreas nestes ratos para permitir a ventilação mecânica. A entubação orotraqueal foi relatado, mas não tem sido utilizada com sucesso em muitos estudos, devido à dificuldade técnica substancial ou uma necessidade de equipamento altamente especializado e caro. Aqui nós relatamos uma técnica de laringoscopia direta utilizando um otoscópio equipado com um espéculo 2,0 mm e com um cateter intravenoso 20 G como um tubo endotraqueal. Nós temos usado esta técnica extensivamente e de forma confiável para entubar e realizar avaliações precisas da função pulmonar em camundongos. Esta técnica tem se mostrado segura, com praticamente nenhuma perda de animais em mãos experientes. Além disso, esta técnicapode ser utilizado para estudos repetidos de ratinhos em modelos crónicos.
Introduction
O rato de laboratório suplantou praticamente todas as espécies como o principal modelo de mamíferos de biologia e pathobiology. O rato de laboratório é a menor espécie de mamíferos que tem sido clara e exaustivamente demonstrado ser de valor como um modelo da doença humana e provou inestimável em avanços de nossa compreensão da biologia humana e doenças. O tempo de gestação curto e substancialmente menor custo tem permitido o desenvolvimento e estudo de ratinhos nulos e transgénicos como uma ferramenta comum em pesquisa biomédica. No entanto, o tamanho do rato de laboratório média (20-25 g) tem limitado o seu estudo em estudos com base fisiológica ou cirurgicamente e, consequentemente, alguns investigadores estudar espécies de mamíferos maiores. Um impedimento ao uso de camundongos nestes estudos é a dificuldade encontrada com técnicas de intubação que permitiriam medidas fisiológicas ou extensos procedimentos cirúrgicos sob anestesia profunda. Traqueostomia 1 tem sido utilizado como um padrão de tehaver descrição prévia em vez de intubação, devido à maior facilidade de realizar esta técnica e habilidade modesto necessário. No entanto, a traqueostomia não é propício para estudos de cirurgia, crônicas ou de recuperação; Assim, é limitada a experiências agudas. A traqueostomia também pode ser uma variável de confusão na pesquisa em que a inflamação ou reflexos fisiológicos sensíveis são importantes.
O nosso laboratório tem tentado a maioria das técnicas descritas por outros investigadores e encontrou-inadequada para uma variedade de razões. A traqueostomia é muito traumático e induz a sangramento e inflamação das vias aéreas. Muito mais problemático é que ele não pode ser viável repetido. Muitas técnicas relativamente não invasivos que requerem um investimento modesto em equipamentos não são suficientemente fiáveis. Outras técnicas exigem equipamentos caros que é difícil de justificar, sem saber se o equipamento irá trabalhar em um aplicativo específico. Assim, buscou-se desenvolver uma técnica não traumática que não necessitaram de mais than um pequeno investimento em equipamento especializado, pode ser conseguida rapidamente e de forma fiável, pode ser repetido em modelos crónicos, e poderia ser utilizada em um grande número de animais. Aqui nós relatamos tal técnica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação animal
- Obter ratos que estão com mais de 8 semanas e mais de 20 g (camundongos menores podem ser entubado por um especialista).
- Anestesia
- Injectar ratinhos com 20 mg / kg, cada uma, de cetamina e xilazina intraperitonealmente como uma pré-anestésica. (Esta dose é insuficiente para anestesiar totalmente o mouse, mas facilita a transferência, após intubação, a ventilação mecânica.) No entanto, o ajuste das doses podem ser necessárias de acordo com a resposta do anestésico, em consulta com o veterinário institucional.)
- Induzir a anestesia em ratos com 3,5% de isoflurano / oxigênio em uma câmara de indução para 90-120 seg.
- Observar a freqüência respiratória com cuidado. Deve diminuir progressivamente a não menos de 45 bpm.
2. Preparação para intubação
- Remover o rato da câmara de indução e nuca com força.
- Use uma pinça fina almofadadas a gently estender a língua da boca.
- Manter extensão da língua, segurando a língua entre dois dedos e aplicar a força suave.
- Puxe o mouse em cima da espéculo do otoscópio com um movimento vertical.
- Olhe pela ocular do otoscópio enquanto scruffing firmemente e puxe o mouse para cima suavemente pela língua e da nuca.
- Olhe atentamente para as cordas vocais. Eles devem ser facilmente visíveis neste momento. O aditus laryngis (a estrutura da abertura da laringe) deve parecer relativamente branco. Não deve haver movimento dos cordões, com cada respiração. Se os cabos não estão se movendo ou são mal visualizado, gire o animal um pouco e delicadamente hiperextensão do pescoço.
- Com a mão dominante, segure a 20 G, 1 em cateter, com um comprimento de um centímetro do tubo PE10 se estende através da ponta do cateter, como um lápis e coloque-o ao lado do espéculo. O tubo de PE serve como um estilete ou vela.
- Direcione a tubi PE10ng (estilete) através das cordas vocais e avançar o cateter de 20 G (tubo endotraqueal) sobre o tubo de PE, até o cubo está ao nível dos incisivos inferiores. Remover esta estilete rapidamente.
- Delicadamente, levar o animal fora do espéculo e verificar a localização do tubo, colocando o animal em um ventilador mecânico com contínua isoflurano a 2% para manter a anestesia geral durante todo o experimento. Visualize ar expirado (bolhas) passando por uma armadilha PEEP para confirmar a intubação. Embora prótese esofágica pode resultar em algumas bolhas, não será tão pronunciados ou como consistente com a intubação endotraqueal. Além disso, observar um traçado da pressão das vias aéreas para desvios negativos (Figura 1). Estes confirmar o posicionamento adequado do tubo. Alternativamente, coloque uma pequena quantidade de água em tubos IV e conectá-lo ao tubo ET. Verificando o movimento de e para o mouse com a respiração 2. No caso da prótese esofágica, do prastreamento ressure revelará pressões significativamente mais elevados e sem desvios negativos. Embora ao final da expiração de CO 2 seria útil, tecnicamente isso seria muito difícil, dado os pequenos volumes correntes (~ 200 mL) e o equipamento para fazer isso seria muito caro. As técnicas simples descritas são inteiramente suficiente e muito menos dispendioso. Se a anestesia de isoflurano não está disponível, todos os procedimentos podem ser realizados utilizando cetamina 80-120 mg / kg em conjunto com xilazina 10-20 mg / kg de anestesia geral.
3. Técnica Alternativa: laringoscopia direta com a Técnica otoscópio é usado Prontamente para outros fins, principalmente para o direto instilação de substâncias estudo sobre o pulmão.
- Induzir a anestesia dos animais com isoflurano sozinho para este procedimento em 3,5% de 90-120 segundos na câmara de indução.
- Nuca do animal com força na base do crânio e estender a língua suavementecom uma pinça fina.
- Segurando a língua gentilmente, puxe o animal para cima sobre o espéculo (sem modificações) até que o animal não pode ser puxado para cima ainda mais.
- As cordas vocais podem ser visualizados na maioria das vezes por esta técnica por si só, mas girar o animal e hiper-estendeu o pescoço para trazê-los em plena vista.
- Avance uma pipeta de gel de carregamento contendo o instilado a glote e incutir o fluido. Porque o espéculo faz um selo com a hipofaringe o mouse irá aspirar qualquer líquido residual que não atravessa as cordas. Este é facilmente verificado pelo rhonchorous soa o rato torna agora quando a respiração até que o fluido é distribuído completamente nos pulmões.
- Em alternativa, ligar PE10 tubagem para uma seringa de 0,5 ml contendo 50 ul de fluido com um bolus de ar atrás do líquido. Avançar o tubo PE cuidadosamente através das cordas vocais para 0,5 cm e descarregar o conteúdo para a via aérea lentamente. No entanto, o trauma ocasional para as vias aéreas inferiores ocorre ucantar esta técnica sem a melhor entrega da amostra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intubação com a técnica acima é confiável e rápido. O posicionamento adequado do tubo endotraqueal é mais facilmente verificado observando borbulhamento de gases expirados a partir do membro expiratório submersa do circuito do ventilador (geralmente numa armadilha de PEEP) e desvios negativos sobre a pressão das vias respiratórias traçando (Figura 1). Os desvios negativos sobre o rastreamento de pressão nas vias aéreas são as mais confiáveis. Outros têm utilizado o movimento de uma pequena gota de fluido na tubagem intravenosa conectado ao circuito ventilador expiratório 2. Apesar de não ter usado esta técnica extensivamente, deve ser suficiente para verificar a localização do tubo. Um operador experiente pode entubar ratinhos usando este método cerca de 90% do tempo sobre a primeira passagem. Para aqueles que falham, o tubo é removido imediatamente, o animal é reinduzia com anestesia de isoflurano, e a colocação novamente tentada. Se o animal é deixado ligado ao circuito ventilador, no caso de uma esointubação transesofágico, o estômago irá gradualmente insuflar gerando altas pressões de pico das vias aéreas, a hipoxemia, e finalmente a morte se não houver intervenção. Se as pressões de alta de pico das vias aéreas são observados sem esforços inspiratórios negativos, o animal deve ser imediatamente removido do ventilador e extubado. No entanto, remover o animal do ventilador e remover o tubo endotraqueal facilmente reverter isso. Durante os últimos 300 estudos em animais que necessitem de intubação um operador experiente entubados 80% com a tentativa inicial e mais do que 95% pela segunda tentativa. Todos os animais foram entubados por a terceira tentativa de operadores experientes. O tempo necessário para entubar camundongos é de até 5 minutos para o pré-anestésica, 90-120 segundos para induzir o mouse com isoflurano e 30 segundos para identificar e realmente entubar as vias aéreas. Descobrimos que novos estagiários devem aprender a visualizar as cordas vocais primeiro. Se eles podem com sucesso demonstrar uma visão completa das cordas vocais dez vezes, eles estão prontos to começar a treinar para entubar. Uma vez que os estagiários têm intubado com sucesso 10 vezes, como demonstrado por desvios negativos sobre uma pressão das vias aéreas rastreamento em um animal respirando espontaneamente, eles estão prontos para realizar estudos em animais experimentais. No entanto, um vídeo de treinamento irá acelerar a curva de aprendizado. Somente os operadores inexperientes induzir trauma das vias aéreas por esta técnica e mortes de animais pode ocorrer neste cenário ao mesmo tempo aprender a técnica. No entanto, a perda de animais com um operador experiente é raro. Esta é a nossa experiência em mais de 1.000 animais ao longo dos últimos 4 anos.
Um cateter 20 L é usada como um tubo endotraqueal nos ratos, porque faz uma vedação estanque com a via aérea, permitindo assim que as medidas precisas da pressão das vias aéreas e é de diâmetro suficiente para medidas de resistência das vias aéreas. No entanto, usando a tubulação de PE como um estilete ou vela permite que o 20 G para passar facilmente e de forma mais confiável através das cordas vocais. A 1 em(2,5 cm) de comprimento do cateter permite que o tubo para ser colocado com o cubo com os incisivos inferiores para a estabilidade, mas sem causar trauma para as vias respiratórias inferiores ou entubação brônquios mainstem.
Utilizamos esta técnica para fazer medições de resistência das vias aéreas, realizar as curvas de dose-resposta de metacolina (Figura 2), e para medir as relações de pressão e volume do pulmão (Figura 3). Por todas estas medidas, os animais devem ser totalmente paralisado obter utilizáveis, dados precisos. Para este efeito, temos usado o brometo de pancurônio como, não despolarizantes paralítico barato em experimentos nonrecovery. No entanto, pancurónio já não está disponível e não podem ser utilizados em animais que vão recuperar devido à sua longa meia-vida. Por isso, passaram a vecurônio (30 min) ou rocurônio para a paralisia por causa de sua meia-vida mais curta, proporcionando a opção de medidas repetidas no tempo. Outros pesquisadores têm utilizadosuccinilcolina como um paralítico despolarização, mas sua meia-vida foi curta demais para a maioria dos nossos experimentos. Também succinilcolina pode causar a liberação de histamina 3 e seria, portanto, uma variável de confusão em potencial.
Também usaram a técnica de laringoscopia direta extensivamente para a entrega de substâncias de teste para o pulmão baseado em uma técnica originalmente relatado em ratos por Hastings 4. A maioria das investigações usaram instilação nasal para a entrega de substâncias de teste para o trato respiratório inferior, porque os ratos são respiradores nasais obrigatórios e instilação nasal é fácil. No entanto, temos encontrado o método de instilação nasal para não ser confiável para entrega quantitativa. Ao usar a técnica de laringoscopia directa descobrimos que a entrega quantitativa é mais fiável e distribuição no pulmão é mais uniforme. Nosso diretor uso da técnica de instilação direta tem sido a de entregar antígeno ao i trato respiratório inferiornd modelo de inflamação alérgica (Figura 4) e hiper-responsividade das vias aéreas (figura 2). Também foram apresentadas outras substâncias de teste, tais como as citoquinas e drogas através deste método.
Airway traçado pressão Figura 1.. A linha azul reflete a pressão das vias aéreas e da linha vermelha reflete o volume corrente rastreamento no rato imediatamente após a intubação. Os (para baixo) os desvios negativos da curva de pressão (setas pretas) indicam a geração de pressão negativa intratorácica no rato (C57BL / 6, 24 g) por esforço respiratório espontâneo e indica a colocação correta do tubo endotraqueal. Clique aqui para v IEW uma versão maior desta figura.
Resistência das vias aéreas Figura 2. E curvas dose-resposta de metacolina. Mice (C57BL / 6) entubado por esta técnica pode sofrer medidas de resistência das vias aéreas e reatividade brônquica usando doses duplicação da metacolina entregues via nebulizador ultra-sônico. Neste exemplo representativo, um animal de controlo tem uma resposta mínima à metacolina até 25 mg / ml e ovalbumina imunizados e desafiados rato demonstra a hiperresponsividade de metacolina. Essas medições são feitas com ratos entubados com um cateter 20 G e são indistinguíveis daqueles feitos em um mouse traqueostomizados.
/ Files/ftp_upload/50269/50269fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50269/50269fig3.jpg "/>
Figura 3. Pressão-volume curva. Esta é uma curva representativa de pressão-volume em 20 g rato que foi entubado com um cateter intravenoso G 20, paralisado de pancurônio, e é ventilado mecanicamente. Isto demonstra que o cateter não vaza-se a 30 cm de H 2 O e a pressão podem, portanto, ser usado para fazer medições precisas relações de pressão e volume do rato.
Figura 4. Ovalbumina modelo de inflamação alérgica. Esta é uma representante hematoxilina e eosina, de pulmão do rato que tem sido imunizados e desafiados com ovalbumina. Isto demonstra o efeito generalizado de instilação de ovalbumin administrados através do método de laringoscopia direta (ampliação 4X).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neste relatório nós descrevemos uma técnica simples e confiável para entubar ratos que é não traumática e pode ser usado repetidamente no mesmo animal. Esta técnica pode ser realizada com laboratório simples ou equipamentos médicos que podem ser comprados por uma módica quantia. A técnica de laringoscopia directa, originalmente relatado por Hastings e colegas 4, pode também ser usado para uma variedade de fins, mas principalmente para administrar com precisão as substâncias de ensaio para o trato respiratório inferior. Nós encontramos esta técnica superior aos relatados por outros investigadores a data por causa de sua facilidade, rapidez, simplicidade, confiabilidade, baixo custo, e potencial para medidas repetidas.
Técnicas de intubação camundongos não são novas. Um dos primeiros relatos, transillumination usado de traquéia seguido de intubação oral com um cateter 24 G 5. No entanto, este estudo e outros 6,7 não forneceu informações suficientes para replicar o technique em nosso laboratório. Recentemente outros investigadores têm utilizado esta técnica de transiluminação com maior sucesso 8,9. O primeiro estudo detalhado por Brown e seus colegas relataram um estudo em que ratos, suspenso em um 45 ° tabela, tiveram suas traquéias transiluminou e sua traquéia intubada por via oral com tubulação PE90 sob visão direta utilizando uma lâmina de laringoscópio fabricado 10. Esta técnica provou ser difícil de reproduzir e, portanto, não tem sido utilizada extensivamente. Relatórios adicionais descrever o uso de escopos ópticos rígidos ou fibra ótica para aumentar a confiabilidade das técnicas. Vergari e colegas 11,12 utilizada uma rígida artroscópio 1,7 milímetros de diâmetro externo para visualizar as cordas vocais e, em seguida, colocado um fio de guia através da glote. Os autores relatam sucesso de 100% com esta técnica que realizada com equipamento especializado e caro. O custo deste equipamento cirúrgico parece proibitivo para uso generalizado em ratos. Técnicas adicionais têm sido desenvolvidas usando um microscópio cirúrgico e um fio de guia 13, 2f. Esta técnica é semelhante ao nosso, mas requer o uso de um microscópio de operação, e, portanto, nós favorecemos a utilização de um otoscópio que é substancialmente menos caro.
Técnicas de intubação de fibra óptica também foram relatados utilizando uma bateria relativamente barato alimentado fonte de fibra óptica 14. Nós tentamos usar esta técnica de fibra óptica, mas ter encontrado a luz menos do que útil, porque não há correspondente canal de visualização de fibra óptica. MacDonald e seus colegas usaram um mais potente fonte de luz halógena e relataram sucesso em uma pequena amostra. Eles foram capazes de medir repetidamente resistência das vias aéreas 15 também. Medidas repetidas de resistência das vias aéreas em diferentes pontos no tempo tem sido relatada por outros 16. Zhao, et ai. Utilizada uma técnica retrógrada por punção da traqueia e que alimenta um fio guia através do hypo-e orofaringe 17. Mais recentemente Cantor et al. Realizaram intubação seletiva do brônquio principal esquerdo no rato utilizando um microscópio de operação e de fluoroscopia para documentar a localização do cateter 18. Eles então usaram este método para incutir substâncias de ensaio seletiva para o pulmão. No entanto, isso também não seria um método que poderia ser usado, sem despesa significativa e formação altamente técnica. Além disso, fluoroscopia também adicionar um risco de radiação para o estudo.
Em resumo, a laringoscopia direta de ratos, utilizando um otoscópio pediátrico é uma técnica valiosa para a intubação, intubação repetidas e entrega substância sem intubação. Encontramos esta técnica superior à traqueostomia e métodos de forma não invasiva realizando a intubação traqueal em ratos previamente relatado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
A Grant Mérito do Departamento de Assuntos de Veteranos e uma bolsa T32-HL098062 do NHLBI dos Institutos Nacionais de Saúde apoiaram este trabalho. Queremos agradecem o conselho de Randolph H. Hasting, MD, Ph.D. e os conselhos e apoio da Unidade de Medicina Veterinária do Sistema de Saúde VA San Diego.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating Otoscope Head | Welch Allyn | 21700 | $188.98 |
| Otoscope Handle | Welch Allyn | 71000 | $112.20 |
| Reuseable Speculum | Welch Allyn | 22002 | $3.98 |
| Fine Forceps | Miltex | 18-779 | $107.18 |
| Small clamp stand to hold otoscope | |||
| Isoflurane Vaporizer (multiple circuit with vacuum waste gas handling) | Summit Medical | $3,000 | |
| Flexivent (Animal Ventilator) | SCIREQ | $35,000 | |
| Intravenous catheter (20 G, 1 in) | BD | 381233 | $9.62 |
| Polyethylene tubing (PE10) (0.011 in I.D., 0.024 in O.D.) 100 ft | Intramedic, Clay-Adams | 427401 | $115.70 |
| Ketamine 100 mg/ml (10 ml bottle) | Butler | 23061 | $10.00 |
| Xylazine (100 ml bottle) | Vedco | 24105 | $20.00 |
| Isoflurane (250 ml bottle) | $15.00 | ||
| Vecuronium bromide 10 mg/10 ml | Pfizer | NDC 0069-0094-01 | $15.00 |
References
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 8277-8281 (1991).
- Watanabe, A., Hashimoto, Y., Ochiai, E., Sato, A., Kamei, K. A simple method for confirming correct endotracheal intubation in mice. Lab. Anim. 43, 399-401 (2009).
- Orebaugh, S. L. Succinylcholine: adverse effects and alternatives in emergency medicine. Am. J. Emerg. Med. 17, 715-721 (1999).
- Hastings, R. H., Summers-Torres, D. Direct Laryngoscopy in Mice. Contemp. Lab. Anim. Sci. 38, 33-35 (1999).
- Berul, C. I., Aronovitz, M. J., Wang, P. J., Mendelsohn, M. E. In vivo cardiac electrophysiology studies in the mouse. Circulation. 94, 2641-2648 (1996).
- Ewart, S. L., Gavett, S. H., Margolick, J., Wills-Karp, M. Cyclosporin A attenuates genetic airway hyperresponsiveness in mice but not through inhibition of CD4+ or CD8+ T cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 627-634 (1996).
- Ewart, S. L., Mitzner, W., DiSilvestre, D. A., Meyers, D. A., Levitt, R. C. Airway hyperresponsiveness to acetylcholine: segregation analysis and evidence for linkage to murine chromosome 6. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 487-495 (1996).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Lab. 41, 128-135 (2007).
- Boll, H., et al. High-speed single-breath-hold micro-computed tomography of thoracic and abdominal structures in mice using a simplified method for intubation. J. Comput. Assist. Tomogr. 34, 783-790 (2010).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
- Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G. Video-assisted orotracheal intubation in mice. Lab. Anim. 37, 204-206 (2003).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 8, 103-106 (2004).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Lab. Anim. 42, 222-230 (2008).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Cont. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 52-55 (2005).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J. Appl. Physiol. 106, 984-987 (2009).
- De Vleeschauwer, S. pI., et al. Repeated invasive lung function measurements in intubated mice: an approach for longitudinal lung research. Lab. Anim. 45, 81-89 (2011).
- Zhao, X., et al. A technique for retrograde intubation in mice. Lab. Anim. 35, 39-42 (2006).
- Singer, T., et al. Left-sided mouse intubation: description and evaluation. Exp. Lung Res. 36, 25-30 (2010).
