Summary
Hemos desarrollado un método simple, fiable, y relativamente barato para la intubación endotraqueal en ratones a través de la laringoscopia directa utilizando un otoscopio con un espéculo 2,0 mm. Esta técnica es atraumática y se puede utilizar para mediciones repetidas en experimentos crónicos. Nos resulta superior a la traqueotomía o previamente informó técnicas no quirúrgicas.
Abstract
Los ratones, tanto de tipo salvaje y transgénicos, son el modelo de mamíferos principal en la investigación biomédica en la actualidad. La intubación y la ventilación mecánica son necesarios para los experimentos con animales enteros que requieren cirugía bajo anestesia profunda o mediciones de la función pulmonar. La traqueotomía ha sido el estándar para la intubación de la vía aérea en estos ratones para permitir la ventilación mecánica. Intubación orotraqueal se ha informado, pero no ha sido utilizado con éxito en muchos estudios debido a la dificultad técnica sustancial o un requisito para un equipo altamente especializado y caro. Aquí mostramos una técnica de laringoscopia directa utilizando un otoscopio equipado con un espéculo 2,0 mm y el uso de un catéter intravenoso 20 G como un tubo endotraqueal. Hemos utilizado esta técnica extensamente y fiable que intubar y llevar a cabo una evaluación precisa de la función pulmonar en los ratones. Esta técnica ha demostrado ser seguro, esencialmente sin pérdida de animales en manos experimentadas. Por otra parte, esta técnicapuede ser utilizado para estudios repetidos de ratones en modelos crónicos.
Introduction
El ratón de laboratorio ha suplantado a prácticamente todas las especies de mamíferos como el modelo principal de la biología y la biopatología. El ratón de laboratorio es la especie de mamífero más pequeño que se ha demostrado de forma clara y extensamente para ser de valor como modelo de enfermedades humanas y ha demostrado ser invaluable en los avances de nuestra comprensión de la biología humana y las enfermedades. El tiempo de gestación corto y sustancialmente menor costo ha permitido el desarrollo y estudio de ratones nulos y transgénicos como una herramienta común en la investigación biomédica. Sin embargo, el tamaño del ratón de laboratorio media (20-25 g) ha limitado su estudio en los estudios basados fisiológicamente o quirúrgicamente y, en consecuencia, algunos investigadores estudian las especies de mamíferos más grandes. Un impedimento para el uso de ratones en estos estudios es la dificultad encontrada con técnicas de intubación que permitan mediciones fisiológicas o procedimientos quirúrgicos extensos bajo anestesia profunda. Traqueotomía 1 se ha utilizado como un estándar TEchnique lugar de intubación debido a la mayor facilidad de realización de esta técnica y habilidad modesta requerido. Sin embargo, la traqueostomía no es propicio para los estudios de cirugía crónicas o de recuperación; Por lo tanto, se limita a experimentos agudos. Traqueotomía también puede ser una variable de confusión en la investigación en las que la inflamación o los reflejos fisiológicos sensibles son importantes.
Nuestro laboratorio ha probado la mayoría de las técnicas descritas por otros investigadores y los encontró inadecuada para una variedad de razones. La traqueotomía es demasiado traumático y provoca sangrado y la inflamación de las vías respiratorias. Mucho más problemático es que no se puede repetir factible. Muchas técnicas relativamente no invasivas que requieren una modesta inversión en equipos no son suficientemente fiables. Otras técnicas requieren equipos costosos que es difícil de justificar, sin saber si el equipo va a trabajar en una aplicación específica. Por lo tanto, tratamos de desarrollar una técnica no traumática que requiere no más tHan una modesta inversión en equipos especializados, podría llevarse a cabo de forma rápida y fiable, se podría repetir en modelos crónicos, y podría ser utilizado en un gran número de animales. Aquí mostramos una técnica de este tipo.
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Protocol
1. Preparación de los animales
- Obtener los ratones que tienen más de 8 semanas y más de 20 g (ratones más pequeños pueden ser intubados por un experto).
- Anestesia
- Inyectar ratones con 20 mg / kg, cada uno, de ketamina y xilazina por vía intraperitoneal como una preanestésica. (Esta dosis es insuficiente para anestesiar completamente el ratón, sino que facilita la transferencia, después de la intubación, la ventilación mecánica.) Sin embargo, el ajuste de las dosis puede ser necesario de acuerdo a la respuesta anestésica en consulta con el veterinario institucional.)
- Inducir la anestesia en los ratones con 3,5% de isoflurano / oxígeno en una cámara de inducción de 90 a 120 seg.
- Observe la frecuencia respiratoria con cuidado. Se debe reducir la velocidad progresivamente a no menos de 45 latidos por minuto.
2. Preparación para la intubación
- Retire el ratón desde la cámara de inducción y pescuezo con fuerza.
- Utilice unas pinzas finas acolchadas para gentLY extender la lengua de la boca.
- Mantenga la extensión de la lengua mediante la celebración de la lengua entre los dos dedos y aplicando fuerza suave.
- Tire del ratón hacia arriba sobre el espéculo del otoscopio con un movimiento vertical.
- Mire a través del ocular del otoscopio mientras Scruffing firmemente y tire del ratón hacia arriba suavemente por la lengua y el pescuezo.
- Busque cuidadosamente las cuerdas vocales. Ellos deben ser fácilmente visible en este momento. El aditus laryngis (la estructura de la abertura laríngea) debería ser relativamente blanco. No debe haber movimiento de las cuerdas con cada respiración. Si las cuerdas no se mueven o están mal visualizadas, gire ligeramente el animal y hiperextender suavemente el cuello.
- Con la mano dominante, sostenga el 20 G, 1 en el catéter, con una longitud de 1 cm de la tubería PE10 se extiende a través de la punta del catéter, como un lápiz y la inserta en el lado del espéculo. La tubería de PE sirve como un estilete o candelilla.
- Dirigir el tubi PE10ng (estilete) a través de las cuerdas vocales y avanzar el catéter de 20 G (sonda endotraqueal) en la tubería de PE hasta que el centro es a nivel del incisivo inferior. Eliminar este estilete rápidamente.
- Saque con cuidado el animal fuera del espéculo y verificar la ubicación del tubo colocando al animal en un ventilador mecánico con 2% de isoflurano continua para mantener la anestesia general en todo el experimento. Visualice el aire expirado (burbujas) de pasar por una trampa de PEEP para confirmar la intubación. Aunque la intubación esofágica puede dar lugar a algunas burbujas, no será tan pronunciada o como consistente con la intubación endotraqueal. También, observar un trazado de presión de las vías respiratorias en caso de desviaciones negativas (Figura 1). Estos confirmar la colocación correcta del tubo. Como alternativa, coloque una pequeña cantidad de agua en el tubo de intravenosa, y conéctelo al tubo endotraqueal. Verificación de circulación hacia y desde el ratón con la respiración 2. En el caso de intubación esofágica, la prastreo resión revelará presiones significativamente más altos y no hay desviaciones negativas. Aunque tidal final de CO2 sería de gran ayuda, técnicamente esto sería muy difícil dado el pequeño volumen corriente (~ 200 l) y el equipo para hacer esto sería muy caro. Las técnicas simples descritas son totalmente suficiente y mucho menos caro. Si la anestesia isoflurano no está disponible, todos los procedimientos pueden llevarse a cabo usando ketamina 80-120 mg / kg en combinación con xilazina 10-20 mg / kg para la anestesia general.
3. Técnica alternativa: Laringoscopia directa con la Técnica otoscopio es fácilmente utilizados para otros fines, principalmente para la instilación directa de Sustancias de estudio en el pulmón.
- Inducir la anestesia en los animales con isoflurano solo para este procedimiento en 3.5% durante 90-120 segundos en la cámara de inducción.
- Scruff el animal fuertemente en la base del cráneo y extender la lengua suavementecon unas pinzas finas.
- La celebración de la lengua suavemente, tire el animal hacia arriba en el espéculo (sin modificar), hasta que el animal no se puede elevar aún más.
- Las cuerdas vocales se pueden visualizar más a menudo por esta técnica por sí sola, pero giran el animal y la hiper-extendido el cuello para ponerlas en vista completa.
- Avanzar en una pipeta de carga de gel que contiene el instilado a la glotis e inculcar el fluido. Debido a que el espéculo hace un sello con la hipofaringe el ratón aspirar cualquier líquido residual que no pasa por las cuerdas. Esto se comprueba fácilmente por el rhonchorous suena el ratón ahora hace cuando la respiración hasta que el líquido se distribuye completamente en los pulmones.
- Como alternativa, conecte la tubería PE10 a una jeringa de 0,5 ml que contiene 50 l de fluido con un bolo de aire detrás del líquido. Avanzar el tubo de PE con cuidado a través de las cuerdas vocales de 0,5 cm y descargar el contenido en las vías respiratorias lentamente. Sin embargo, el trauma de vez en cuando a las vías respiratorias inferiores se produce ucantar esta técnica sin una mejor entrega de la muestra.
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Representative Results
La intubación con la técnica anterior es fiable y rápido. La colocación apropiada del tubo endotraqueal es más fácilmente verificado por la observación de burbujeo del gas espirado desde la rama de expiración sumergida de la del circuito del ventilador (por lo general en una trampa de PEEP) y desviaciones negativos en una presión de la vía aérea rastreo (Figura 1). Las desviaciones negativas en el seguimiento de la presión de las vías respiratorias son las más fiables. Otros han utilizado el movimiento de una pequeña gota de líquido en tubo intravenoso conectado al circuito del ventilador espiratorio 2. Aunque no hemos utilizado esta técnica ampliamente, debe ser suficiente para verificar la ubicación del tubo. Un operador experimentado puede intubar ratones, usando el método de aproximadamente el 90% del tiempo en la primera pasada. Para aquellos que fallan, el tubo se retira inmediatamente, el animal se reinduced con anestesia con isoflurano, y la colocación intentó de nuevo. Si el animal se deja conectado al circuito del ventilador en el caso de una ESOintubación phageal, el estómago se insufle generando gradualmente altas presiones pico de la vía respiratoria, hipoxemia, y finalmente a la muerte si no se interviene. Si se observan las altas presiones pico de la vía aérea y sin esfuerzos inspiratorios negativos, el animal debe ser retirado de inmediato del ventilador y extubado. Sin embargo, la eliminación de los animales desde el ventilador y retirar el tubo endotraqueal fácilmente revertir esto. Durante los últimos 300 estudios en animales que requieren intubación un operador experimentado intubado 80% con el intento inicial y más de 95% en el segundo intento. Todos los animales fueron intubados por el tercer intento de los operadores experimentados. El tiempo necesario para intubar ratones es de hasta 5 min para el preanestésica, 90-120 seg para inducir el ratón con isoflurano, y 30 seg para identificar y, de hecho intubar la vía aérea. Hemos encontrado que los nuevos alumnos deben aprender a visualizar las cuerdas vocales primero. Si se puede demostrar con éxito una vista completa de las cuerdas vocales diez veces, están listos to comenzar a entrenar a intubar. Una vez que los alumnos han intubado con éxito 10 veces, según lo demostrado por las desviaciones negativas en una presión de la vía aérea de rastreo en un animal que respira espontáneamente, que están listos para llevar a cabo los estudios en animales de experimentación. Sin embargo, un video de entrenamiento acelerará considerablemente la curva de aprendizaje. Sólo los operadores inexpertos inducir trauma de la vía aérea por esta técnica y la muerte de los animales se pueden producir en este entorno, mientras que el aprendizaje de la técnica. Sin embargo, la pérdida de los animales con un operador con experiencia es rara. Esta es nuestra experiencia en más de 1.000 animales en los últimos 4 años.
A G catéter 20 se utiliza como un tubo endotraqueal en los ratones, ya que hace un cierre hermético con la vía aérea, lo que permite medidas exactas de las presiones de las vías respiratorias y es de diámetro suficiente para las medidas de la resistencia de las vías respiratorias. Sin embargo, utilizando el tubo de PE como un estilete o bujía permite que el 20 G para pasar fácilmente y de forma más fiable a través de las cuerdas vocales. El 1 de(2,5 cm) longitud del catéter permite que el tubo que se coloca con el cubo en los incisivos inferiores para la estabilidad, pero sin causar un trauma a la vía aérea inferior o la intubación de la bronquios principales.
Nosotros usamos esta técnica para realizar mediciones de resistencia de la vía aérea, realice metacolina curvas dosis-respuesta (Figura 2), y para medir las relaciones presión-volumen en el pulmón (Figura 3). Por todas estas mediciones los animales deben estar completamente paralizados para obtener datos precisos y útiles. Para ello hemos utilizado el bromuro de pancuronio como no despolarizantes paralítica de bajo costo en los experimentos no recuperación. Sin embargo, pancuronio ya no está disponible y no puede ser utilizado en animales que se van a recuperar, porque de su larga vida media. Por lo tanto, hemos cambiado al vecuronio (30 min) o rocuronio para la parálisis debido a su vida media más corta, proporcionando la opción de medidas repetidas en el tiempo. Otros investigadores han utilizadosuccinilcolina como un paralítico despolarizante, pero su vida media ha sido demasiado corto para la mayoría de nuestros experimentos. También succinilcolina puede causar la liberación de histamina 3 y por lo tanto sería una variable de confusión potencial.
También hemos utilizado la técnica de la laringoscopia directa extensivamente para la entrega de las sustancias de ensayo en el pulmón basado en una técnica reportada originalmente en ratas mediante Hastings 4. La mayoría de las investigaciones han utilizado la instilación nasal para la entrega de las sustancias de ensayo en el tracto respiratorio inferior, porque los ratones son respiradores nasales obligados y la instilación nasal es fácil. Sin embargo, hemos encontrado el método de instilación nasal de ser poco fiable para la entrega cuantitativa. Mediante el uso de la técnica de la laringoscopia directa hemos encontrado que la entrega cuantitativa es más fiable y distribución en el pulmón es más uniforme. Nuestro principal uso de la técnica de instilación directa ha sido entregar antígeno a la i del tracto respiratorio inferiormodelo na de la inflamación alérgica (Figura 4) y la hiperreactividad de las vías respiratorias (Figura 2). También hemos entregado otras sustancias de prueba, tales como las citoquinas y las drogas a través de este método.
Figura 1. Trazado de la presión de la vía aérea. La línea azul refleja la presión de la vía aérea y la línea roja refleja el volumen corriente de rastreo en el ratón inmediatamente después de la intubación. Los (a la baja) las desviaciones negativas de la curva de presión (flechas negras) indican la generación de la presión intratorácica negativa en el ratón (C57BL / 6, 24 g) por el esfuerzo respiratorio espontáneo e indica la colocación correcta del tubo endotraqueal. Por favor, haga clic aquí para v IEW una versión más grande de esta cifra.
Figura 2. Resistencia de las vías respiratorias y de metacolina curvas de dosis-respuesta. Ratones (C57BL / 6) intubado por esta técnica pueden someterse a medidas de la resistencia de las vías respiratorias y reactividad bronquial utilizando duplicación dosis de metacolina entregados a través de nebulizador ultrasónico. En este ejemplo representativo, un animal de control tiene una respuesta mínima a la metacolina hasta 25 mg / ml y la ovoalbúmina inmunizado y desafió ratón demuestra la hiperreactividad a la metacolina. Estas mediciones se realizan con ratones intubados con un G catéter 20 y son indistinguibles de las realizadas en un ratón traqueostomizada.
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Figura 3. Presión-volumen curva. Esta es una curva de presión-volumen representativo en un ratón de 20 g que se ha intubado con un G catéter intravenoso 20, paralizado por el pancuronio, y es ventilado mecánicamente. Demuestra que el catéter no se escapa hasta 30 cm H 2 O de presión y por lo tanto puede ser utilizado para hacer mediciones relaciones presión-volumen precisos en el ratón.
Figura 4. Modelo de ovoalbúmina de la inflamación alérgica. Este es un representante de hematoxilina y eosina sección manchada de pulmón de ratón que se ha inmunizado y desafiados con ovoalbúmina. Se demuestra el efecto generalizado de la instilación de ovalbumin administra a través del método de la laringoscopia directa (ampliación 4X).
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Discussion
En este informe se describe una técnica sencilla y fiable para intubar ratones que es no traumática y puede ser utilizado en varias ocasiones en el mismo animal. Esta técnica se puede lograr con un simple laboratorio o equipos médicos que se pueden comprar por una suma modesta. La técnica de la laringoscopia directa, originalmente reportado por Hastings y colegas 4, también se puede utilizar para una variedad de propósitos, pero principalmente para entregar con precisión sustancias de ensayo en el tracto respiratorio inferior. Hemos encontrado que esta técnica superior a los reportados por otros investigadores hasta la fecha debido a su facilidad, rapidez, simplicidad, confiabilidad, bajo costo, y el potencial para medidas repetidas.
Técnicas de intubar ratones no son nuevos. Uno de los primeros informes, transiluminación utilizado de la tráquea seguida de intubación oral con un G catéter 5 24. Sin embargo, este estudio y otros 6,7 no proporcionaron información suficiente para reproducir la technique en nuestro laboratorio. Recientemente otros investigadores han utilizado esta técnica de transiluminación con mayor éxito 8,9. El primer estudio detallado por Brown y sus colegas informaron de un estudio en el que los ratones, suspendido sobre un tablero de 45 °, tenían sus tráqueas transiluminados y su tráquea intubados por vía oral con un tubo PE90 bajo visualización directa utilizando una hoja de laringoscopio fabricado 10. Esta técnica ha demostrado ser difícil de replicar y, por lo tanto, no se ha utilizado ampliamente. Los informes adicionales describen el uso de ámbitos o fibra óptica ópticos rígidos para mejorar la fiabilidad de las técnicas. Vergari y colegas 11,12 utilizan un artroscopio rígido 1,7 mm de diámetro exterior para visualizar las cuerdas vocales y luego se colocan un alambre de guía a través de la glotis. Los autores informan de éxito del 100% con esta técnica que se llevan a cabo con un equipo especializado y costoso. El costo de este equipo quirúrgico parece prohibitivo para su uso generalizado en los ratones. Otras técnicas se han desarrollado utilizando un microscopio de operación y un alambre de guía 2f 13. Esta técnica es similar a la nuestra, pero requiere el uso de un microscopio operativo, y por lo tanto favorecer el uso de un otoscopio que es sustancialmente menos costoso.
Técnicas de intubación de fibra óptica también se han reportado utilizando una pieza relativamente económico impulsado fuente de fibra óptica 14. Hemos tratado de utilizar esta técnica de fibra óptica, pero hemos encontrado la luz menos útil porque no hay un canal de visualización de fibra óptica correspondiente. MacDonald y sus colegas utilizaron una más potente fuente de luz halógena y reportaron el éxito en una pequeña muestra. Ellos fueron capaces de medir varias veces la resistencia de la vía aérea 15 también. Medidas repetidas de la resistencia de la vía aérea en diferentes momentos han sido reportados por otros 16. Zhao, et al. Utiliza una técnica retrógrada por punción de la tráquea y la alimentación de un alambre de guía a través de la HYPo-y orofaringe 17. Más recientemente cantante, et al. Han realizado intubación selectiva del bronquio principal izquierdo en el ratón utilizando un microscopio de operación y fluoroscopia para documentar la ubicación del catéter 18. A continuación, utiliza este método para infundir sustancias de ensayo selectivamente en el pulmón. Sin embargo, esto de nuevo no sería un método que podría ser utilizado sin gasto significativo y la formación altamente técnica. Por otra parte, la fluoroscopia también sería añadir un peligro de radiación para el estudio.
En resumen, la laringoscopia directa de ratones utilizando un otoscopio pediátrica es una técnica valiosa para la intubación, la intubación repetida y entrega sustancia problema sin intubación. Nos encontramos con esta técnica superior a la traqueotomía y se informó anteriormente métodos para realizar de forma no invasiva la intubación endotraqueal en ratones.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Una Beca Mérito del Departamento de Asuntos de Veteranos y una subvención T32-HL098062 del NHLBI de los Institutos Nacionales de Salud apoya este trabajo. Queremos reconocer y agradecer el asesoramiento de Randolph H. Hasting, MD, Ph.D. y el asesoramiento y apoyo de la Unidad de Medicina Veterinaria de la VA Healthcare System San Diego.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating Otoscope Head | Welch Allyn | 21700 | $188.98 |
| Otoscope Handle | Welch Allyn | 71000 | $112.20 |
| Reuseable Speculum | Welch Allyn | 22002 | $3.98 |
| Fine Forceps | Miltex | 18-779 | $107.18 |
| Small clamp stand to hold otoscope | |||
| Isoflurane Vaporizer (multiple circuit with vacuum waste gas handling) | Summit Medical | $3,000 | |
| Flexivent (Animal Ventilator) | SCIREQ | $35,000 | |
| Intravenous catheter (20 G, 1 in) | BD | 381233 | $9.62 |
| Polyethylene tubing (PE10) (0.011 in I.D., 0.024 in O.D.) 100 ft | Intramedic, Clay-Adams | 427401 | $115.70 |
| Ketamine 100 mg/ml (10 ml bottle) | Butler | 23061 | $10.00 |
| Xylazine (100 ml bottle) | Vedco | 24105 | $20.00 |
| Isoflurane (250 ml bottle) | $15.00 | ||
| Vecuronium bromide 10 mg/10 ml | Pfizer | NDC 0069-0094-01 | $15.00 |
References
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