Summary
我们已经开发出用耳镜用2.0mm的窥器通过直接喉镜气管插管在小鼠一个简单，可靠，且相对廉价的方法。这种技术是无创伤和可用于在慢性实验重复测量。我们发现它优于气管造口术或先前报道非手术技术。
Abstract
小鼠，无论是野生型和转基因，是主要的哺乳动物模型在生物医学研究当前。插管和机械通气是必要的，需要深麻醉下或肺功能测量整个手术的动物实验。气管切开术一直是插管气道在这些小鼠，使机械通气的标准。经口气管插管有报道由于大量的技术困难或高度专业化的和昂贵的设备的要求，但并没有在许多研究中得到成功应用。此处我们报告直接喉镜的使用配有2.0mm的窥器耳镜，并使用20 G静脉导管为气管内管的技术。我们已经用这种技术广泛和可靠的插管和小鼠进行肺功能的准确评估。这种技术已被证明安全的，有经验的人员基本上没有动物的损失。此外，这种技术可用于小鼠的慢性模型反复研究。
Introduction
该实验室鼠标已经取代几乎所有的物种生物学和病理学的主要哺乳动物模型。该实验室的鼠标是已明确且全面证明是有价值的人类疾病的模型，并证明无价在我们人类生物学和疾病的认识的进步最小的哺乳动物。短期妊娠时间和大大降低了成本允许空和转基因小鼠的发展和研究，在生物医学研究的一个司空见惯的工具。然而，一般的实验室小鼠（20-25克）的大小限制了他们的研究在生理学或手术为基础的研究，因此，一些研究者研究大哺乳动物。妨碍利用老鼠在这些研究中是与插管技术，这将允许在深度麻醉下生理测量或广泛的外科手术中遇到的困难。气管切开1已被用作标准特chnique因为更容易利用这项技术并适度的技能需要的，而不是插管。然而，气管切开，不利于慢性或恢复手术研究;因此，它被限制在急性实验。气管造口术，也可以在研究一个混杂变量，其中炎症或敏感的生理反射是很重要的。
我们的实验室已尝试大部分由其他研究者描述的技术，并发现它们不足以用于各种原因。气管切开术是太痛苦并诱导出血及气道炎症。更成问题的是，它不能切实重复。许多需要适度的设备投资相对非侵入性的技术是不是足够可靠。其他技术需要昂贵的设备，是很难，如果不知道该设备将工作在一个特定的应用程序来证明。因此，我们试图开发一种非创伤性技术，它不需要更多的T汉适度的投资在专门的设备，可以迅速完成，并且可靠，可以重复在慢性模型中，并且可以在大量动物中使用。在这里，我们报告这样的技术。
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Protocol
1。动物的制备
- 获得小鼠早于8周，超过20克（小老鼠可以由专家插管）。
- 麻醉
- 注入老鼠用20毫克/千克氯胺酮和赛拉嗪腹膜内作为麻醉前，每个。 （该剂量是不足以完全麻醉的小鼠，但有利于安全转移，气管插管后，机械通气。）但是，调整该剂量可根据与体制兽医会诊麻醉反应是必要的。）
- 麻醉诱导小鼠与3.5％异氟醚/氧气感应室为90-120秒。
- 仔细观察呼吸频率。它应该逐步放缓至不低于45 BPM。
2。对于插管的准备
- 从感应腔中取出鼠标和浮渣紧密。
- 用软垫细镊子GENTLY从嘴里伸出舌头。
- 通过按住舌头两个手指之间和运用柔和的力保持伸展舌头的。
- 拖动鼠标上带有垂直运动的耳镜的反射镜。
- 期待通过耳镜的眼矿泉去油光的同时紧紧地和舌头和颈背拉动鼠标向上轻轻。
- 仔细寻找声带。它们必须容易看到在这个时候。该laryngis aditus（喉口的结构）应该比较白。应该有每次呼吸的线的运动。如果线不动或可视化很差，稍微旋转动物，轻轻超伸了脖子。
- 用优势手，保持20 G 1中的导管，通过所述导管的尖端延伸，像铅笔的PE10管1厘米的长度，并把它插入到反射镜的一侧。该PE管材作为探针或探条。
- 直接PE10 TUBING（钢丝）通过声带，推进20 G导管（气管插管）在PE管材，直到枢纽是在下颚门齿的水平。快速去除这种钢丝。
- 轻轻把动物关窥器的，并通过将动物的机械通气机上连续的2％异氟烷维持整个实验过程中全身麻醉核实管的位置。想象呼出的气体（气泡）经历一个PEEP陷阱，以确认气管插管。虽然食道插管可能会导致一些气泡，它不会像明显或气管插管的一致。此外，观察气道压力跟踪负偏差（ 图1）。这些确认管的妥善安置。另外，将少量的水进入输液管，并将其连接到ET管。验证动作和从鼠标随呼吸2。在食管插管时，p的情况下，ressure跟踪，就会发现显著更高的压力，没有负偏差。虽然呼气末二氧化碳将是有益的，在技术上给予小潮气量（约200微升）和设备做这将是非常昂贵的，这将是非常困难的。所描述的简单的技术是完全足够的和便宜得多。如异氟醚麻醉不可用，所有的程序，可以使用氯胺酮80-120毫克/千克与赛拉嗪10-20毫克/公斤为全身麻醉结合进行。
3。替代技术：直接喉镜与耳镜技术对其他用途随便使用，主要用于直接滴入研究物质进入肺部。
- 与单纯异氟醚对动物麻醉诱导此过程在3.5％90-120秒在感应室。
- 颈背动物紧紧地在颅底，延长舌尖轻轻用细镊子。
- 轻轻地捧着舌头，拉动物直线上升的窥器（未修改），直到动物不能进一步拉升。
- 声带可以经常可视化通过这种技术独自一人，但旋转动物和超扩展的脖子，使其完整视图。
- 前进含有滴注到声门凝胶上样和灌输流体。因为窥器使密封与喉咽鼠标将吸残留液体，不经过线。这很容易通过在rhonchorous验证听起来鼠标现在呼吸时使得直到流体在肺部完全分布式的。
- 或者，PE10管道连接至0.5ml注射器含有50微升的液体与液体背后的空气推注。通过声带对0.5厘米小心前进在PE管和内容物排放到气道慢。然而，偶尔的创伤下呼吸道发生ü唱这种技术没有更好的交付样品。
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Representative Results
插管与上述技术是可靠和快速。气管内管的适当位置是最容易通过的水下呼气肢观察呼出气鼓泡验证了呼吸机回路（通常在PEEP陷阱）和上气道压力跟踪（ 图1）负偏差的。上气道压力跟踪的负偏差是最可靠的。其他人在使用静脉注射管连接到呼气呼吸机回路2的小液滴的运动。虽然我们没有使用这种技术广泛应用，它应该足以验证管的位置。一个有经验的操作者可以使用这个方法大约90％的时间在所述第一通插管小鼠。对于那些失败了，管子被立即删除，动物再诱导异氟醚麻醉，及配售再次尝试。如果动物是左连接到呼吸机回路中的ESO的情况下，phageal插管，胃会逐渐吹进产生高的峰值气道压力，低氧血症，并最终死亡，如果没有干预。如果高气道峰压都没有负面的吸气努力观察，动物必须及时脱离呼吸机移除，并拔管。然而，从通气机除去动物并除去气管内管容易扭转的。在过去的300动物研究需要插管有经验的操作者插管80％的初始尝试和超过95％的第二次尝试。所有的动物都被经验丰富的运营商的第三次尝试插管。插管的小鼠所用的时间是至多5分钟的麻醉前，90-120秒来诱导小鼠用异氟烷和30秒，以确定和实际插管气道。我们发现，新学员要学会先可视化的声带。如果他们能够成功地证明了声带十倍的众目睽睽之下，他们已经准备好吨Ø开始训练插管。一旦学员已成功插管10倍，具体表现为上气道压力跟踪在自主呼吸的动物负偏差，他们准备在实验动物进行研究。然而，培训视频，将大大加快学习曲线。只有没有经验的操作引起气道损伤通过这种技术和动物的死亡，同时学习该技术，可能会出现在此设置。然而，动物与有经验的操作者的损失是罕见的。这是我们在1000多的动物，在过去多年的经验。
甲20 G导管被用作在小鼠气管内管，因为它使一个紧密密封的气道，从而使气道压力的精确测量，这是足够的直径为气道阻力的措施。然而，使用PE管作为探针或探条允许20 G以通过声带容易和更可靠地传递。在1导管（2.5厘米）长度允许管放置与轮毂在稳定的下门齿，但不会造成创伤，下气道或气管插管主支气管。
我们使用此技术，使气道阻力的测量结果，进行乙酰甲胆碱的剂量-反应曲线（ 图2），并测量在肺中（ 图3）的压力-体积关系。对于所有这些测量的动物必须完全瘫痪，以获得可用的，准确的数据。为此目的，我们已经使用泮库溴铵作为一种廉价的，非去极化在nonrecovery实验麻痹。然而，泮库溴铵不再可用，并且不能对动物，因为它的半衰期长，那要恢复使用。因此，我们已转，因为他们的半衰期较短，以维库溴铵（30分钟）或罗库溴铵的瘫痪，提供重复测量随时间的选项。其他研究者使用琥珀作为一种去极化麻痹，但它的半衰期太短，为广大的我们的实验。还琥珀胆碱可引起组胺释放3，因此将是一个潜在的混杂变量。
我们也使用了直接喉镜技术广泛用于交付测试物质的基础上最初由黑斯廷斯4日报道在大鼠的技术肺。大多数研究已用于鼻内滴入送货上门的试验物质到下呼吸道，因为老鼠是专性鼻呼吸和鼻内滴入很容易。然而，我们已经发现鼻腔滴注方法是不可靠的定量输送。通过使用我们发现定量输送更可靠和分布在肺的直接喉镜检查法是更均匀的。我们的主要的直接滴入技术的使用已经交付抗原的下呼吸道我过敏性炎症呐模型（ 图4）及气道高反应性（ 图2）。我们已经通过这个方法也发表其他的测试物质，如细胞因子和药物。
图1。气道压力的跟踪。蓝线反映了气道压力和红线反映了潮气 量插管后立即开始跟踪在小鼠。压力曲线（黑色箭头）负（向下）挠度表明在小鼠（C57BL / 6，24 g）在自主呼吸努力胸腔内负压的产生，并指出气管导管的妥善安置。 请点击这里到v IEW这个图的放大版本。
图2。气道阻力和乙酰甲胆碱的剂量-反应曲线。将小鼠（C57BL / 6）通过该技术插管可经历使用乙酰甲胆碱的双倍剂量通过超声波雾化器递送的气道阻力和支气管反应性的措施。在这个代表性的例子中，控制动物具有最小响应于乙酰甲胆碱高达25毫克/毫升和卵清蛋白免疫和激发小鼠示范高反应性乙酰甲胆碱。这些测量均采用气管插管用20 G导管小鼠和有别于在气管切开鼠标做出区分。
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图3。压力-体积曲线，这是在20g的小鼠已经插管用20 G静脉导管，瘫痪与泮库溴铵的代表性的压力-体积曲线，并进行机械通风。它表明，该导管不会泄漏长达30厘米H 2 O的压力，因此可以被用来制造在鼠标精确测量压力-体积关系。
图4。过敏性炎症模型卵清蛋白，这是一种代表性的苏木精和曙红小鼠肺的染色部分已接种和激发与卵清蛋白。它表明ovalbu滴注的广义效应通过直接喉镜法（放大倍率4倍）分钟服用。
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Discussion
在本报告中，我们描述一个简单的，可靠的技术来插管小鼠即非创伤性，并且可以在相同的动物反复使用。这种技术可以完成简单的实验室，或者被一个个小数目，可以购买医疗设备。直接喉镜的技术中，最初报告由Hastings和同事4，也可用于各种用途，但主要还是以准确递送试验物质到下呼吸道。我们发现这种技术，因为它的易用性，速度，简单，可靠，费用低，和潜在的重复测量的优于所报告的其他调查员日期。
技术插管老鼠是不是新的。其中最早报告，气管用透后口服插管用24政导管5。然而，这项研究和其他6,7没有提供足够的信息来复制TEChnique在我们的实验室。最近其他研究人员已经用这种透技术具有更大的成功8,9。布朗和他的同事首次详细研究报告的一项研究中，老鼠，悬挂在45°篮板，有他们的气管透照和气管插管口服直视下PE90管材使用制造喉镜片10。这种技术已被证明难以复制的，因此，还没有被广泛利用。其他报告描述了利用刚性光范围或纤维光学的提升的技术的可靠性。 Vergari和同事11,12用一个刚性关节镜1.7毫米外径以可视化的声带，然后通过声门放置导丝。这组作者报告100％的成功与他们有专门的和昂贵的设备进行这种技术。这种手术设备的成本似乎限制在小鼠广泛使用。使用手术显微镜和第2f导向线13的额外技术已被开发。这种技术与我们的相似，但需要使用手术显微镜，因此，我们倾向于使用耳镜实质上更便宜的。
纤支镜插管技术也被使用相对廉价的电池供电的纤维来源14日报道。我们试图使用该光纤的技术，但已经发现较有用的光少，因为没有对应的光纤可视通道。麦克唐纳和他的同事使用了更强大的卤素光源，并在报道一个小样本的成功。他们能够反复测量气道阻力15也。已经报道由他人16气道阻力在不同时间点重复测量。赵等人所使用的技术逆行穿刺气管和通过HYP供给导丝邻和口咽17。最近歌手， 等人已使用手术显微镜和荧光透视文件导管18的位置进行左主支气管的选择性插管的小鼠。然后，他们用这种方法来选择性地灌输试验物质进入肺部。然而，这又不会是一个可以不用显著费用和技术性很强的训练使用的方法。此外，透视也将增加辐射危害的研究。
总之，使用儿科小鼠耳镜直接喉镜是一种有价值的技术插管，反复插管，不插管测试物质传递。我们发现这种技术优于气管造口术和先前报道的小鼠中进行无创性气管插管的方法。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
从退伍军人事务部的优点格兰特和来自美国国立卫生研究院的NHLBI一个T32-HL098062资金支持这项工作。我们要衷心感谢兰多夫H.黑廷斯，医学博士，博士的意见以及建议和支持弗吉尼亚州圣迭戈医疗系统的兽医医疗单位。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating Otoscope Head | Welch Allyn | 21700 | $188.98 |
| Otoscope Handle | Welch Allyn | 71000 | $112.20 |
| Reuseable Speculum | Welch Allyn | 22002 | $3.98 |
| Fine Forceps | Miltex | 18-779 | $107.18 |
| Small clamp stand to hold otoscope | |||
| Isoflurane Vaporizer (multiple circuit with vacuum waste gas handling) | Summit Medical | $3,000 | |
| Flexivent (Animal Ventilator) | SCIREQ | $35,000 | |
| Intravenous catheter (20 G, 1 in) | BD | 381233 | $9.62 |
| Polyethylene tubing (PE10) (0.011 in I.D., 0.024 in O.D.) 100 ft | Intramedic, Clay-Adams | 427401 | $115.70 |
| Ketamine 100 mg/ml (10 ml bottle) | Butler | 23061 | $10.00 |
| Xylazine (100 ml bottle) | Vedco | 24105 | $20.00 |
| Isoflurane (250 ml bottle) | $15.00 | ||
| Vecuronium bromide 10 mg/10 ml | Pfizer | NDC 0069-0094-01 | $15.00 |
References
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