Intubation bei Mäusen Published: April 5, 2014 doi: 10.3791/50269

DOI

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Joanna L. Thomas^1,2, Justin Dumouchel², Jinghong Li², Jenna Magat², Dana Balitzer³, Timothy D. Bigby^1,2

¹Medical and Research Services, VA San Diego Healthcare System, ²Department of Medicine, University of California, San Diego, ³School of Medicine, University of California, San Diego

Summary

Wir haben eine einfache, zuverlässige und relativ kostengünstiges Verfahren zur Intubation bei Mäusen durch direkte Laryngoskopie mit einem Otoskop mit einem 2,0-mm-Spekulum entwickelt. Diese Technik ist atraumatisch und für wiederholte Messungen bei chronischen Experimente eingesetzt werden. Wir finden es besser als zuvor berichtet, Tracheostoma oder chirurgischen Techniken.

Abstract

Mäusen, sowohl Wildtyp-und transgenen, sind die wichtigsten Säugetiermodell in der biomedizinischen Forschung aktuell. Intubation und Beatmung sind für ganze Tierversuche, die eine Operation unter Vollnarkose oder tiefe Messungen der Lungenfunktion benötigen notwendig. Tracheotomie, hat den Standard für Intubation der Atemwege in diesen Mäusen die mechanische Belüftung zu ermöglichen. Orotracheale Intubation ist wegen der erheblichen technischen Schwierigkeiten oder eine Anforderung für hoch spezialisierte und teure Ausrüstung wurde berichtet, aber nicht erfolgreich in vielen Studien verwendet. Hier berichten wir über eine Technik der direkten Laryngoskopie mit einem Otoskop mit einem 2,0-mm-Spekulum ausgestattet und mit einer 20 G intravenösen Katheter als Endotrachealtubus. Wir haben diese Technik umfassend und zuverlässig zur intubieren und führen eine genaue Beurteilung der Lungenfunktion bei Mäusen. Diese Technik hat sich als sicher erwiesen, im Wesentlichen ohne Tierverlust in erfahrenen Händen. Darüber hinaus ist diese Technikkann für wiederholte Untersuchungen von Mäusen chronische Modelle verwendet werden.

Introduction

Die Labormaus hat nahezu alle Arten als Hauptsäugetiermodell der Biologie und Pathobiologie verdrängt. Die Labormaus ist die kleinste Säugetier-Spezies, die klar und ausführlich dargestellt worden ist, um der Wert als ein Modell der menschlichen Krankheit und wurde in Fortschritte der unser Verständnis der menschlichen Biologie und Krankheiten von unschätzbarem Wert erwiesen. Die kurze Tragzeit und wesentlich geringeren Kosten hat die Entwicklung und Untersuchung von null und transgenen Mäusen als alltäglich Werkzeug in der biomedizinischen Forschung erlaubt. Allerdings hat die Größe der durchschnittlichen Labormaus (20-25 g) in ihrer Studie physiologisch oder chirurgisch basierte Studien begrenzt und folglich untersuchen einige Forscher größeren Säugetieren. Ein Hindernis für die Verwendung von Mäusen in diesen Studien ist die Schwierigkeit, mit Intubation Techniken, die physiologischen Messungen oder umfangreiche chirurgische Eingriffe unter Narkose tief erlauben würde angetroffen. Tracheotomie ¹ wurde als Standard verwendet technique statt Intubation wegen der leichteren Durchführung dieser Technik und bescheidenen Fähigkeiten erforderlich. Allerdings ist nicht förderlich für die Tracheotomie chronischen oder Wiederherstellung Chirurgie Studien; somit ist es begrenzt auf akute Experimenten. Tracheotomie, kann auch eine verwirrende Variable in der Forschung, in der Entzündung oder empfindliche physiologische Reflexe sind wichtig.

Unser Labor hat die meisten der von anderen Forschern beschriebenen Techniken ausprobiert und fand sie nicht ausreichend für eine Vielzahl von Gründen. Tracheotomie ist zu traumatisch und induziert Blutungen und Entzündungen der Atemwege. Viel problematischer ist, dass es praktisch nicht wiederholt werden können. Viele relativ nicht-invasive Techniken, die eine bescheidene Investition in Ausrüstung erfordern, sind nicht zuverlässig genug. Andere Techniken erfordern teure Geräte, die schwierig, ohne zu wissen, ob das Gerät wird in einer bestimmten Anwendung arbeiten zu rechtfertigen ist. So haben wir versucht, eine nicht-traumatische Technik, die nicht mehr benötigt t entwickelnhan eine bescheidene Investition in Spezialausrüstung konnte schnell durchgeführt werden und zuverlässig, könnte bei chronischen Modellen wiederholt werden, und konnte in einer großen Anzahl von Tieren verwendet werden. Eine solche Technik Hier berichten wir.

Protocol

1. Vorbereitung der Tiere

1. Erhalten Mäuse, die älter als 8 Wochen und mehr als 20 g (kleiner Mäuse können von einem Fachmann intubiert werden) sind.
2. Anästhesie
   1. Injizieren Mäuse mit 20 mg / kg, jeweils, von Ketamin und Xylazin intraperitoneal als präanästhetische. (Diese Dosis reicht nicht aus, um die Maus komplett zu betäuben, aber erleichtert die sichere Übertragung, nach der Intubation, mechanische Belüftung.) Jedoch die Einstellung der Dosierungen können nach der Narkose Antwort in Absprache mit dem Tierarzt institutionellen erforderlich.)
   2. Induzieren Narkose bei Mäusen mit 3,5% Isofluran / Sauerstoff in einer Induktionskammer für 90-120 Sekunden.
   3. Beachten Sie die Atemfrequenz sorgfältig. Es sollte nach und nach auf nicht weniger als 45 bpm verlangsamen.

2. Vorbereitung zur Intubation

1. Entfernen Sie die Maus aus der Induktionskammer und Scruff fest.
2. Verwenden Sie gepolsterte feinen Pinzette nach Gently erweitern die Zunge aus dem Mund.
3. Pflegen Verlängerung der Zunge, indem die Zunge zwischen zwei Finger und Anwendung sanfter Gewalt.
4. Ziehen Sie die Maus auf dem Spekulum aus dem Otoskop mit einer vertikalen Bewegung.
5. Schauen Sie durch das Okular des Otoskop während Scruffing fest und ziehen Sie die Maus nach oben sanft mit der Zunge und das Genick.
6. Schauen Sie genau für die Stimmbänder. Sie sollten zu diesem Zeitpunkt leicht sichtbar sein. Die laryngis aditus (die Struktur der Kehlkopföffnung) sollte relativ weißen aussehen. Es sollte Bewegung der Schnüre mit jedem Atemzug sein. Wenn die Kabel nicht bewegen oder schlecht sichtbar, drehen Sie das Tier leicht und sanft den Hals überstrecken.
7. Mit der dominanten Hand, halten Sie die 20 G, 1 in Katheter, mit einem 1 cm Länge der PE10 Schlauch, der sich durch die Spitze des Katheters, wie ein Bleistift und legen Sie sie in die Seite des Speculum. Der PE-Schlauch dient als Sonde oder Bougie.
8. Richten Sie die PE10 tubing (Stilett) durch die Stimmbänder und vorab die 20 G-Katheter (Tubus) über den PE-Schlauch, bis der Hub ist auf der Ebene der unteren Schneidezähne. Entfernen Sie dieses Stilett schnell.
9. Nehmen Sie vorsichtig das Tier aus der Speculum und überprüfen Sie die Schlauchstelle, indem das Tier auf einem mechanischen Beatmungsgerät mit kontinuierlicher 2% Isofluran Vollnarkose während des Experiments zu erhalten. Visualisieren ausgeatmeten Luft (Blasen) gehen durch eine Falle, um PEEP Intubation bestätigen. Obwohl Ösophagusintubation kann in wenigen Blasen führen, wird es nicht so ausgeprägt oder als mit endotrachealer Intubation. Beachten Sie außerdem, eine Atemwegsdruck Verfolgung für negative Ausschläge (Abbildung 1). Diese bestätigen die richtige Platzierung der Röhre. Alternativ legen Sie eine kleine Menge Wasser in IV-Schlauch, und verbinden Sie es mit der ET-Tubus. Überprüfen der Bewegung zu und von der Maus mit ² Atmung. Im Fall von Ösophagus Intubation pruck Verfolgung deutlich höhere Drücke und keine negativen Ausschläge zeigen. Obwohl endexspiratorischen CO ₂ wäre hilfreich, technisch wäre dies sehr schwierig, da die kleinen Tidalvolumina (~ 200 ul) und die Ausrüstung zu tun, wäre dies sehr teuer werden. Die beschriebene einfache Verfahren sind völlig ausreichend und viel weniger teuer. Wenn Isofluran-Narkose nicht verfügbar ist, können alle Verfahren unter Verwendung von Ketamin 80-120 mg / kg Xylazin in Verbindung mit 10-20 mg / kg für die allgemeine Anästhesie durchgeführt werden.

3. Alternative Technik: Direkte Laryngoskopie mit dem Otoskop-Technik wird leicht für andere Zwecke verwendet, vor allem für Direkt Instillation von Studien Stoffe in die Lunge.

1. Induzieren Anästhesie in der Tiere mit Isofluran allein für dieses Verfahren bei 3,5% für 90 bis 120 sec in der Induktionskammer.
2. Scruff das Tier dicht an der Basis des Schädels und verlängern die Zunge sanftmit feinen Pinzette.
3. Halten Sie die Zunge sanft, ziehen Sie das Tier gerade auf dem Speculum (unveränderte), bis das Tier kann nicht weiter gezogen werden.
4. Die Stimmbänder können häufig durch diese Technik allein visualisiert werden, aber drehen Sie die Tier-und überstreckt den Hals, um sie in Großansicht zu bringen.
5. Voraus ein Gel-loading Pipette, die die Instillat auf die Stimmritze und die Flüssigkeit einzuflößen. Da der Spiegel macht eine Dichtung mit dem Hypopharynx die Maus Restflüssigkeit, die nicht durch die Schnüre nicht gehen abzusaugen. Dies ist leicht durch die rhonchorous prüft klingt die Maus macht jetzt beim Atmen, bis die Flüssigkeit vollständig in der Lunge verteilt.
6. Alternativ verbinden PE10 Schlauch auf eine 0,5 ml Spritze mit 50 ul von Flüssigkeit mit einer Luft Bolus hinter der Flüssigkeit. Schieben Sie den PE-Schlauch vorsichtig durch die Stimmbänder 0,5 cm und entladen den Inhalt langsam in die Atemwege. , Gelegentlich Trauma der unteren Atemwege auftritt u jedochsingen, diese Technik ohne eine bessere Lieferung der Probe.

Representative Results

Intubation mit dem obigen Verfahren ist zuverlässig und schnell. Die geeignete Platzierung des Endotrachealtubus ist am einfachsten durch die Beobachtung ausgeatmeten Gas aus dem Blasentaucht Ausatmungsglied verifizierter die des Beatmungskreislauf (in der Regel in einem PEEP-Falle) und negativen Auslenkungen auf einer Atemwegsdruck Verfolgung (Fig. 1). Die negativen Ausschläge auf Atemwegsdruck Verfolgung sind die zuverlässigsten. Andere haben die Bewegung einer kleinen Flüssigkeitströpfchen in intravenösen Schlauch an den exspiratorischen Beatmungsschaltung ² verbunden verwendet. Obwohl wir diese Technik nicht ausgiebig genutzt, sollte es ausreichen, um Schlauchstelle überprüfen. Ein erfahrener Bediener kann Mäuse mit dieser Methode etwa 90% der Zeit im ersten Durchgang zu intubieren. Für solche, die nicht das Röhrchen sofort entfernt wird, wird das Tier mit Isofluran-Narkose reinduziert, und die Anordnung erneut versucht. Wenn das Tier nach links an das Beatmungskreis im Falle eines ESO verbundenphageal Intubation, wird der Magen allmählich insufflieren Erzeugung hoher Beatmungsdrücke, Hypoxämie und letztlich zum Tod, wenn es keine Intervention. Wenn hohe Beatmungsdrücke werden ohne negative Atemanstrengungen beobachtet, muss das Tier sofort von dem Beatmungsgerät entfernt und extubiert werden. Allerdings, das Entfernen des Tieres, von dem Beatmungsgerät und das Entfernen des Endotrachealtubus leicht umkehren dies. In den letzten 300 Tierstudien erfordern Intubation intubiert ein erfahrener Betreiber 80% mit dem ersten Versuch und mehr als 95% nach dem zweiten Versuch. Alle Tiere wurden nach dem dritten Versuch von erfahrenem Personal intubiert. Die Zeit, um Mäuse zu intubieren bis zu 5 min nach dem präanästhetische, 90-120 Sek. Maus mit Isofluran zu induzieren, und 30 Sekunden zu identifizieren und zu intubieren tatsächlich die Atemwege. Wir haben festgestellt, dass die neuen Auszubildenden sollen lernen, zuerst die Stimmbänder visualisieren. Wenn sie erfolgreich eine vollständige Sicht auf die Stimmbänder zehn Mal demonstrieren, sind sie bereit to Ausbildung beginnen zu intubieren. Sobald Auszubildende haben erfolgreich 10 mal intubiert, wie von negativen Ausschläge auf einem Atemwegsdruck-Tracing in einer spontan atmenden Tier nachgewiesen, sind sie bereit, Studien an Versuchstieren durchzuführen. Allerdings wird ein Video-Training stark die Lernkurve beschleunigen. Nur unerfahrene Bediener veranAtemwegs Trauma durch diese Technik und Todesfälle von Tieren können in dieser Einstellung auftreten, während das Erlernen der Technik. Allerdings ist Verlust von Tieren mit einem erfahrenen Betreiber selten. Dies ist unsere Erfahrung aus mehr als 1.000 Tiere in den letzten 4 Jahren.

Eine 20 G-Katheter als Endotrachealtubus in Mäusen verwendet, weil es eine enge Dichtung mit den Atemwegen, so dass genaue Maßnahmen Atemwegsdruck und einen ausreichenden Durchmesser für Maßnahmen von Atemwegswiderstand. Doch mit der PE-Schlauch als Stilett oder Bougie kann der 20 G, leicht und zuverlässiger durch die Stimmbänder übergeben. Das in 1(2,5 cm) Länge des Katheters kann der Schlauch mit der Nabe an der unteren Schneidezähne für die Stabilität gelegt werden, aber ohne dass Trauma der unteren Atemwege oder Intubation der Hauptbronchus Bronchien.

Wir verwenden diese Technik, um Messungen der Atemwegswiderstand zu machen, führen Methacholin-Dosis-Wirkungs-Kurven (Abbildung 2), und Druck-Volumen-Verhältnisse in der Lunge (Abbildung 3) zu messen. Für alle diese Messungen müssen die Tiere vollständig gelähmt werden, um brauchbare, genaue Daten zu erhalten. Zu diesem Zweck haben wir Pancuroniumbromid als kostengünstige, nicht depolarisierenden Gelähmten in Nichtrück Experimente verwendet. Allerdings ist pancuronium nicht mehr verfügbar und können nicht auf Tiere, die wiederhergestellt werden soll wegen seiner langen Halbwertszeit verwendet werden. Deshalb haben wir zu Vecuronium (30 min) oder Rocuronium zur Lähmung aufgrund ihrer kürzeren Halbwertszeit umgeschaltet wird, bietet die Möglichkeit, wiederholte Messungen über die Zeit. Andere Forscher haben eingesetztSuccinylcholin als depolarisierende Gelähmten, aber seine Halbwertszeit ist zu kurz für die meisten unserer Experimente. Auch Succinylcholin kann die Freisetzung von Histamin ³ verursachen und daher eine potenzielle Störfaktoren variabel sein.

Wir haben auch für die Lieferung von Testsubstanzen in der Lunge auf der Basis einer Technik, die ursprünglich in Ratten durch Hastings ⁴ angegeben verwendet die direkte Laryngoskopie Technik ausführlich. Die meisten Untersuchungen haben Nasen Einträufeln für die Lieferung von Testsubstanzen auf die unteren Atemwege verwendet werden, da Mäuse sind obligate Nasen Verschnaufpausen und nasale Instillation ist einfach. Allerdings haben wir gefunden, die nasale Instillation Methode unzuverlässig für die quantitative Lieferung sein. Durch die Verwendung der direkten Laryngoskopie Technik, die wir haben festgestellt, dass quantitative Lieferung ist zuverlässiger und Verteilung in der Lunge ist gleichmäßiger. Unser Haupt Nutzung des Direkt Einträufeln Technik war es, die der i-Antigen unteren Atemwege liefernna Modell der allergischen Entzündung (Abbildung 4) und Empfindlichkeit der Atemwege (Abbildung 2). Wir haben auch über diese Methode geliefert anderen Testsubstanzen wie Zytokine und Drogen.

Abbildung 1. Atemwegsdruck Verfolgung. Die blaue Linie spiegelt die Atemwegsdruck und die rote Linie spiegelt das Atemvolumen Verfolgung in der Maus unmittelbar nach Intubation. Die negativen (nach unten) Auslenkungen des Druckkurve (schwarze Pfeile) zeigen die Erzeugung von negativen intrathorakalen Druck in der Maus (C57BL / 6, 24 g) durch spontane Atemanstrengung und zeigt die richtige Platzierung des Endotrachealtubus. Bitte klicken Sie hier, um v IEW eine größere Version dieser Zahl.

2. Atemwegswiderstand und Methacholin-Dosis-Antwort-Kurven. Mäuse (C57BL / 6) durch diese Technik intubiert können Maßnahmen der Atemwegswiderstand und bronchiale Reaktivität mit Verdopplungsdosen von Methacholin über Ultraschallzerstäuber zugezogen. In diesem repräsentativen Beispiel hat ein Kontrolltier eine minimale Reaktion auf 25 mg / ml Ovalbumin und herausgefordert Maus demonstriert hyperresponsiveness Methacholin Methacholin auf. Diese Messungen werden mit Mäusen mit einer 20-G-Katheter intubiert und sind nicht von denen in einem tracheostomierten Maus gemacht.

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3. Druck-Volumen-Kurve. Dies ist ein Vertreter Druck-Volumen-Kurve in einem 20 g-Maus, die mit einer 20-G intravenösen Katheter, mit pancuronium gelähmt wurde intubiert und mechanisch beatmet. Sie zeigt, dass der Katheter nicht auslaufen bis zu 30 cm H ₂ O-Druck und kann daher verwendet werden, um genaue Messungen zu Druck-Volumen-Beziehungen in der Maus zu machen.

4. Ovalbumin Modell der allergischen Entzündung. Dies ist ein Vertreter Hämatoxylin und Eosin gefärbt Abschnitt Mauslunge, die immunisiert und mit Ovalbumin hat. Es zeigt die Wirkung von generali Einträufeln von ovalbumin über die direkte Laryngoskopie Verfahren (Vergrößerung 4X) verabreicht.

Discussion

In diesem Bericht beschreiben wir eine einfache, zuverlässige Technik, um Mäuse, die nichttrauma ist und wiederholt in der gleichen Tier verwendet werden intubieren. Diese Technik kann mit einfachen Labor-und medizinische Geräte, die für eine bescheidene Summe gekauft werden können, durchgeführt werden. Die Technik der direkten Laryngoskopie, die ursprünglich von Hastings und Kollegen ⁴ angegeben, können auch für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, vor allem aber, um genau zu liefern Testsubstanzen auf den unteren Atemwege. Wir haben diese Technik besser als die von anderen Forschern bis heute berichtet aufgrund seiner Leichtigkeit, Geschwindigkeit, Einfachheit, Zuverlässigkeit, geringe Kosten, und das Potenzial für wiederholte Messungen gefunden.

Techniken, um Mäuse zu intubieren sind nicht neu. Einer der frühesten Berichte verwendet Durchleuchtung der Trachea durch orale Intubation mit einer 24 G-Katheter ^5. Allerdings hat diese Studie und andere ^6,7 nicht genügend Informationen, um die tec replizierenhnique in unserem Labor. Kürzlich andere Forscher haben dieses Durchleuchtungstechnik mit mehr Erfolg ^8,9 verwendet. Die erste detaillierte Studie von Brown und Kollegen berichteten über eine Studie, in der Maus, auf einem 45 ° Rückwand aufgehängt hatten ihre Luftröhre durchleuchtet und ihre Luftröhre oral mit PE90 Schlauch unter direkter Sicht mit einem hergestellt Laryngoskopblatt ¹⁰ intubiert. Diese Technik hat sich als schwierig zu replizieren und daher nicht ausführlich genutzt erwiesen. Zusätzliche Berichte beschreiben die Verwendung von starren Lichtrohre oder Faseroptiken, um die Zuverlässigkeit der Verfahren zu verbessern. Vergari und Kollegen ^11,12 verwendet ein starres Arthroskop 1,7 mm Außendurchmesser, um die Stimmbänder visualisieren und legte dann einen Führungsdraht durch die Stimmritze. Die Autoren berichten, 100% Erfolg mit dieser Technik, die sie mit spezialisierten und teuren Geräten durchgeführt. Die Kosten für diese chirurgische Geräte scheint unerschwinglich für einen breiten Einsatz in Mäusen. Weitere Techniken sind mit einem Operationsmikroskop und 2f Führungsdraht ¹³ entwickelt worden. Diese Technik ist ähnlich zu verlieren, aber die Verwendung eines Operationsmikroskops und somit bevorzugen wir die Verwendung von einem Otoskop, die wesentlich weniger kostspielig ist.

Fiberoptische Intubation Techniken wurden auch mit einem relativ preiswerten Batterie betrieben faseroptische Quelle ¹⁴ ausgewiesen. Wir haben versucht, dieses LWL-Technik zu verwenden, aber das Licht weniger als sinnvoll, weil es keine entsprechenden LWL-Visualisierung Kanal gefunden. MacDonald und Kollegen verwendeten ein mächtiger Halogen-Lichtquelle und berichtete Erfolg in einer kleinen Probe. Sie waren in der Lage, immer wieder messen Atemwegswiderstand ¹⁵ auch. Wiederholte Messungen der Atemwiderstand zu verschiedenen Zeitpunkten wurde von anderen ¹⁶ gemeldet. Zhao et al. Verwendet einen Rück Technik durch Punktion der Trachea und zum Zuführen eines Führungsdrahtes durch den hypo-und Mund-Rachenraum ^17. In jüngerer Singer, et al. Haben selektive Intubation des linken Hauptbronchus bei der Maus unter Verwendung eines Operationsmikroskops und Fluoroskopie, um den Ort des Katheters ¹⁸ zu dokumentieren. Sie dann verwendet diese Methode, um Testsubstanzen selektiv in die Lunge zu vermitteln. Dies jedoch einmal nicht eine Methode, die ohne großen Aufwand und sehr technische Ausbildung verwendet werden könnte. Darüber hinaus wäre auch eine Durchleuchtung Strahlungsgefahr der Studie hinzuzufügen.

Zusammenfassend ist die direkte Laryngoskopie von Mäusen mit einer pädiatrischen Otoskop eine wertvolle Technik für die Intubation, wiederholte Intubation und Testsubstanz Lieferung ohne Intubation. Wir finden, diese Technik überlegen Tracheotomie und zuvor berichtet Methoden der nicht-invasiven Durchführung Intubation bei Mäusen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Operating Otoscope Head	Welch Allyn	21700	$188.98
Otoscope Handle	Welch Allyn	71000	$112.20
Reuseable Speculum	Welch Allyn	22002	$3.98
Fine Forceps	Miltex	18-779	$107.18
Small clamp stand to hold otoscope
Isoflurane Vaporizer (multiple circuit with vacuum waste gas handling)	Summit Medical		$3,000
Flexivent (Animal Ventilator)	SCIREQ		$35,000
Intravenous catheter (20 G, 1 in)	BD	381233	$9.62
Polyethylene tubing (PE10) (0.011 in I.D., 0.024 in O.D.) 100 ft	Intramedic, Clay-Adams	427401	$115.70
Ketamine 100 mg/ml (10 ml bottle)	Butler	23061	$10.00
Xylazine (100 ml bottle)	Vedco	24105	$20.00
Isoflurane (250 ml bottle)			$15.00
Vecuronium bromide 10 mg/10 ml	Pfizer	NDC 0069-0094-01	$15.00