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Medicine

마우스의 기관 내 삽관 Published: April 5, 2014 doi: 10.3791/50269
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 3, 1,2
1Medical and Research Services, VA San Diego Healthcare System, 2Department of Medicine, University of California, San Diego, 3School of Medicine, University of California, San Diego

Summary

우리는 2.0 mm 검경과 이경을 사용하여 직접 후두경을 통해 마우스에서 기관 내 삽관을위한 간단하고 신뢰할 수있는, 그리고 상대적으로 저렴한 방법을 개발했습니다. 이 기술은 atraumatic이고 만성 실험에서 반복 측정에 사용될 수있다. 우리는 우수한 기관 절개 또는 이전에 비수술 적 방법을보고 찾을 수 있습니다.

Abstract

마우스는 야생형 및 유전자 변형 모두는 현재 생물 의학 연구의 주요 포유류의 모델입니다. 삽관 및 기계적 환기 깊은 마취 또는 폐 기능의 측정에 따라 수술을 필요로 전체 동물 실험을 위해 필요합니다. 기관 절개술은 기계 환기를 허용하는이 마우스에서기도 삽관을위한 표준이다. Orotracheal 삽관 때문에 상당한 기술적 어려움이나 고도의 전문과 고가의 장비에 대한 요구 사항의보고되었지만 성공적으로 많은 연구에 사용되지 않았습니다. 여기서 우리는 2.0 mm 검경 장착 이경을 사용하여 기관 내 튜브로 20 G 정맥 카테터를 사용하여 직접 후두경의 기술을보고합니다. 우리는 삽관과 생쥐의 폐 기능의 정확한 평가를 수행하기 위해 광범위하고 안정적​​으로이 기술을 사용하고 있습니다. 이 기술은 경험이 풍부한 손에 본질적으로 동물 손실, 안전 입증했다. 또한,이 기술만성 모델 마우스의 반복 된 연구에 사용할 수 있습니다.

Introduction

실험실 마우스 생물학 한테 진찰 Pathobiology의 주요 포유류의 모델로 거의 모든 종을 대신하게했다. 실험실 마우스는 명확하고 광범위하게 인간의 질병의 모델로서 가치가있을 것으로 나타났다 인간 생물학 및 질병에 대한 우리의 이해의 발전에 귀중한 입증 된 가장 작은 포유류의 종입니다. 짧은 임신 기간의 시간과 실질적으로 낮은 비용으로는 생물 의학 연구에서 일반적인 도구로 널 (null)과 형질 전환 마우스의 개발과 연구를 허용했다. 그러나, 평균 실험실 마우스 (20 ~ 25 g)을의 크기는 결과적으로 연구자에 큰 포유 동물 종을 연구, 생리 학적 또는 외과 적 기반 연구에 자신의 연구를 제한하고있다. 이 연구에 마우스를 사용하는 장애는 깊은 마취 생리적 측정 또는 광범위한 수술을 허용하는 삽관 기술로 발생하는 어려움이다. 기관 절개 1 TE 표준으로 사용되었다필요하기 때문에이 기술과 겸손 기술을 수행하는보다 쉽게​​ 대신 삽관의 chnique. 그러나, 기관 절개술은 만성 또는 복구 수술 연구에 도움이되지 않습니다; 따라서, 급성 실험에 한한다. 기관 절개술은 또한 염증이나 민감한 생리적 반사 신경이 중요 한 연구에서 교란 변수가 될 수 있습니다.

우리 연구실은 다른 연구자에 의해 설명 된 기술의 대부분을 시도하고 여러 가지 이유로 그 불충분 함을 발견했습니다. 기관 절개도이다 외상성 출혈 및기도 염증을 유도한다. 훨씬 더 문제가 그것에서 실질적으로 반복 될 수 있다는 것이다. 장비 겸손한 투자를 필요로하는 많은 상대적으로 비 침습적 기술은 충분히 신뢰할 수 없습니다. 다른 기술은 장비가 특정 응용 프로그램에서 작동하는지 몰라도 정당화하기 어려운 고가의 장비를 필요로합니다. 따라서, 우리는 더 이상 t을 요구하지 않는 비 외상성 기술을 개발하기 위해 노력한 특수 장비의 소극적인 투자는 빠르게 달성 될 수 있고, 안정적으로, 만성 모델에서 반복 될 수 있고, 많은 수의 동물에서 사용될 수있다. 여기에서 우리는 이러한 기술을보고합니다.

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Protocol

1. 동물 준비

  1. (작은 마우스는 전문가에 의해 삽관 할 수있다) 8 주 이내에 세 이상 20g 생쥐를 얻습니다.
  2. 마취
    1. 복강 preanesthetic으로 케타민과 자일 라진 20 ㎎ / ㎏, 각, 생쥐를 주입한다. (이 용량은 완전히 마우스를 마취하기에 충분하지만, 기계 환기에 삽관 후 안전한 전송을 용이하게한다.) 그러나, 투여 량의 조정 기관의 수의사와 협의하여 마취 반응에 따라 필요할 수 있습니다.)
    2. 90 ~ 120 초 동안 유도 챔버에서 3.5 % 이소 플루 란 / 산소와 마우스에서 마취를 유도한다.
    3. 주의 깊게 호흡을 관찰합니다. 그것은 이하 45 이상 BPM에 점진적으로 둔화 될 전망.

2. 삽관을위한 준비

  1. 유도 챔버에서 마우스를 제거하고 단단하게 목덜미.
  2. 신사에 쿠션 미세 집게를 사용하여LY 입에서 혀를 확장합니다.
  3. 두 손가락 사이에 혀를 잡고 부드러운 힘을 주면 혀의 확장을 유지한다.
  4. 상하 운동과 이경의 검경에 마우스를 위로 당기십시오.
  5. 단단히 scruffing 동안 이경의 눈을 통해보고 혀와 목덜미에 부드럽게 마우스를 올려.
  6. 성대 살펴보십시오. 그들은이 시간에 쉽게 볼 수 있어야합니다. laryngis의 aditus (후두 구멍의 구조)는 상대적으로 흰색을 찾아야한다. 각각의 호흡과 코드의 움직임이 있어야합니다. 코드가 이동하지 않거나 불완전하게 시각화하는 경우, 약간 동물을 회전하고 부드럽게 목을 hyperextend.
  7. 지배적 인 손으로 연필처럼, 카테터의 끝을 관통 PE10 튜브의 1cm 길이로, 카테터에 20 G, 1을 누른 상태에서 검경의 측면에 삽입합니다. PE 튜브는 탐침이나 소식 자 역할을합니다.
  8. PE10의 TUBI 직접NG 성대를 통해 (탐침)와 허브까지 PE 튜브에 20 G 카테터 (기관 내 튜브를) 진행은 아래 앞니의 수준에 있습니다. 빨리이 탐침을 제거합니다.
  9. 조심스럽게 검경 떨어져 동물을 가지고 실험을하는 동안 전신 마취를 유지하기 위해 연속 2 % 이소 플루 란 (isoflurane)와 인공 호흡기에 동물을 배치하여 튜브의 위치를​​ 확인합니다. 삽관을 확인하는 PEEP 트랩을 통과 만료 된 공기 (기포)를 시각화. 식도 삽관 몇 거품이 발생할 수 있지만, 그와 같은 발음 또는 기관 내 삽관과 같은 일치하지 않을 수 있습니다. 또한, 음의 굴절을위한기도 압력 추적 (그림 1)을 관찰한다. 이 튜브의 적절한 배치를 확인합니다. 대안 적으로, IV 튜빙에 소량의 물을 배치하고는 ET 튜브에 연결한다. 호흡 2 마우스와의 움직임을 확인. 식도 삽관, P의 경우ressure 추적은 상당히 높은 압력과 부정적인 편향을 발표 할 예정이다. 기말 CO 2가 도움이 될 것입니다 있지만, 기술적으로이 작은 갯벌 볼륨 (~ 200 μL)이 매우 비쌀 할 수있는 장비 주어 매우 어려울 것입니다. 설명하는 간단한 기술은 완전히 충분하고 훨씬 저렴합니다. 이소 플루 란 마취를 사용할 수없는 경우, 모든 절차가 일반적인 마취 자일 라진 20 ㎎ / kg과 함께 케타민 80-120 ㎎ / kg을 사용하여 수행 될 수있다.

3. 대체 기술 : 직접 후두경 이경 기술로는 주로 폐에 연구 물질의 직접 떨어 뜨림에, 다른 목적을 위해 쉬움 사용됩니다.

  1. 유도 챔버에서 90 ~ 120 초 동안 3.5 %에서이 절차에 혼자 이소 플루 란과 동물의 마취를 유도한다.
  2. 단단히 두개골의 기지에서 동물의 목덜미에 부드럽게 혀를 연장미세 집게로.
  3. 동물이 더 뽑아 할 수 없을 때까지 부드럽게 혀를 잡고 똑바로 검경에 수정되지 않은 동물을 잡아 당깁니다.
  4. 성대는 단독으로이 기술에 의해 가장 자주 시각화하지만, 동물 및 전체보기로 그들을 가져 하이퍼 확장 목을 회전 할 수 있습니다.
  5. 성문에 instillate를 포함하는 겔로드 피펫을 사전 유체를 주입. 검경은 하인두와 씰을 만들고 있기 때문에 마우스가 코드를 통해 이동하지 않는 잔여 액체를 대기음됩니다. 이것은 쉽게 rhonchorous 의해 확인이 호흡 할 때 유체가 폐에 완전히 분산 될 때까지 마우스를 지금 만드는 소리.
  6. 대안 적으로, 액체 뒤에서 공기 러스와 유체의 50 μl를 함유하는 0.5 ㎖ 주사기에 PE10 튜브를 연결한다. 0.5 cm의 성대를 통해주의 깊게 PE 튜브를 사전 천천히기도에 내용을 방출. 그러나, 하부기도에 가끔 외상은 U 발생샘플을 더 잘 전달하지 않고이 기술을 노래.

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Representative Results

위의 기술을 가진 삽관 법은 안정적이고 빠르다. 기관 내 튜브의 적절한 배치는 쉽게의 침수 호기 사지에서 배출 가스 버블 링을 관찰에 의해 확인 된 인공 호흡기 회로 (일반적으로 PEEP 트랩에서) (그림 1)를 추적기도 압력에 부정적인 편향의. 기도 압력 추적에 부정적인 편향은 가장 신뢰할 수 있습니다. 기타 호기 인공 호흡기 회로 (2)에 연결 정맥 튜브의 작은 액체 방울의 움직임을 사용했습니다. 우리는이 기술을 광범위 사용하지 않지만, 그것은 튜브의 위치를​​ 확인하기에 충분해야한다. 경험이 연산자는 첫 번째 패스에이 방법에게 시간의 약 90 %를 사용하여 마우스를 삽관 할 수 있습니다. 관은 즉시 제거하고, 실패하는 사람들을 위해, 동물은 이소 플루 란 마취 reinduced 및 배치가 다시 시도됩니다. 동물은 ESO의 경우 인공 호흡기 회로에 접속두면어떠한 간섭도없는 경우 phageal 삽관, 위장 서서히 insufflate 높은 피크기도 압력, 저산소 혈증, 및 궁극적으로 죽음을 생성하는 것이다. 높은 피크기도 압력이 음의 흡기 노력을하지 않고 관찰하는 경우, 동물은 즉시 인공 호흡기 제거 및 extubated해야합니다. 그러나 인공 호흡기에서 동물을 제거하고 기관 내 튜브를 제거하면 쉽게 반전. 삽관을 필요로 지난 300 동물 연구 기간 동안 숙련 된 운영자는 두 번째 시도에 의해 초기 시도 및 95 % 이상으로 80 %를 삽관. 모든 동물은 경험을 가진 사람의 세 번째 시도에서 삽관 하였다. 마우스를 삽관하는 데 걸리는 시간은 이소 플루 란으로 마우스를 유도하는 preanesthetic, 90 ~ 120 초 동안 5 분, 30 초 확인하고 실제로기도 삽관에에 달려있다. 우리는 새로운 연수생 먼저 성대를 시각화하는 법을 배워야한다는 것을 발견했다. 성공적 성대 10 회 전체보기를 입증 할 수 있다면, 그들은 준비가 t이다O 삽관 훈련을 시작합니다. 연수생이 성공적으로 10 회를 삽관 한 후, 자발적으로 호흡 동물 추적을기도 압력에 부정적인 편향에 의해 입증, 그들은 실험 동물의 연구를 수행 할 수 있습니다. 그러나, 트레이닝 영상은 크게 학습 곡선을 가속화 할 것이다. 단지 경험이 연산자는이 기술에 의해기도의 외상을 유도하고 기술을 배우면서 동물의 죽음은이 설정에 발생할 수 있습니다. 그러나, 경험이 풍부한 연산자와 동물의 손실이 거의 없습니다. 이것은 지난 40 년 동안 1,000 명 이상의 동물에서 우리의 경험이다.

이 때문에기도 압력의 정확한 측정을 가능하게기도하면 확실한 밀봉을하게하고기도 저항의 측정을위한 충분한 직경 때문에 20 G 카테터는 쥐의 기관 내 튜브로 사용됩니다. 그러나, 탐침이나 소식 자로서 PE 튜브를 사용하여 20 G는 성대를 통해보다 쉽고 안정적​​으로 전달할 수 있습니다. 1카테터 (2.5 cm)의 길이는 튜브 안정성 하부 앞니에서 허브로 배치 할 수 있지만, 하부기도에 외상을 유발하거나 mainstem 기관지를 삽관없이.

우리는기도 저항의 측정을 수행한다 (그림 2) 메타 콜린 용량 - 반응 곡선을 수행하고, 폐의 압력 - 볼륨 관계 (그림 3)을 측정하기 위해이 방법을 사용합니다. 이러한 측정의 모든 동물은 완전히 쓸모있는, 정확한 데이터를 얻기 위해 마비해야합니다. 이 목적을 위해 우리는 nonrecovery 실험에서 저렴 nondepolarizing 마비로 pancuronium 브로마이드를 사용했습니다. 그러나, pancuronium은 더 이상 사용할 수 없습니다 때문에 긴 반감기의 복구하려는 동물에 사용할 수 없습니다. 따라서, 우리는 시간이 지남에 따라 반복 측정 할 수있는 옵션을 제공하기 때문에 자신의 짧은 반감기의 vecuronium (30 분) 또는 마비에 대한 rocuronium로 전환했다. 다른 연구자들은 사용했다탈분극 마비로 석시 닐 콜린, 그러나 그것의 반감기는 실험의 대부분 너무 짧은되었습니다. 또한 석시 닐 콜린 히스타민 3을 일으킬 수 있으므로 잠재적 교란 변수가 될 것입니다.

우리는 또한 원래 헤이스팅스에 의해 쥐에보고 된 기술을 기반으로 폐에 시험 물질의 전달을 위해 광범위하게 직접 후두경 기술을 사용했다. 마우스가 의무를 코 브리더하고 코 점안이 쉽기 때문에 대부분의 연구는 낮은 호흡기에 시험 물질의 전달을위한 코 점안을 사용했습니다. 그러나, 우리는 코 점안 방법은 정량 배달을 위해 신뢰할 수없는 것으로 나타났습니다. 우리는 양적 배송이 폐에 더 신뢰성 및 유통 것으로 나타났습니다 직접 후두경 기술을 사용하여 균일입니다. 직접 점안 기술의 우리의 주요 사용하기도 전에 항원을 제공 할 수있다알레르기 염증의 NA 모델 (그림 4)과기도 과민성 (그림 2). 우리는 또한이 방법을 통해 이러한 사이토 카인 및 의약품 등의 시험 물질을 전달했다.

그림 1
그림 1.기도 압력 추적. 파란색 선은기도 압력을 반영하고 빨간색 선은 바로 삽관 후 마우스에서 추적 호흡량을 반영한다. 압력 곡선 (검은 색 화살표)의 음 (하향) 편향은 자연 호흡 노력에 의해 마우스에 부정적인 흉부 압력 (C57BL / 6, 24g)의 생성을 표시하고 기관 내 튜브의 적절한 배치를 나타냅니다. V하려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 국제 교육 주간.

그림 2
그림 2.기도 저항 및 메타 콜린 용량 - 반응 곡선. 마우스 (C57BL / 6) 기술에 의해 삽관 초음파 분무기를 통해 전달 메타의 두 배 용량을 사용하여기도 저항 및 기관지 반응성의 조치를받을 수 있습니다. 이 대표 예에서, 제어 동물 ㎖ 및 알부민 예방 접종 및 마우스가 메타 콜린에 과민 반응을 보여줍니다 도전 25 ㎎ / 최대 메타 할 최소한의 응답을 갖는다. 이러한 측정은 20 G 카테터와 삽관 마우스로 만든 tracheostomized 마우스를 만든 것과 구별된다.

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그림 3. 압력 볼륨 곡선.이 pancuronium으로 마비 20 G 정맥 카테터와 삽관 된 20g 마우스의 대표적인 압력 볼륨 곡선, 기계적 환기. 이는 카테터 30 센티미터 H 2 O 압력까지 누출되지 않기 때문에, 마우스의 정확한 측정 압력 볼륨의 관계를 확인하기 위해 사용될 수 있음을 보여준다.

그림 4
그림 4. 알레르기 염증의 오발 부민 모델.이 대표 헤 마톡 실린 및 예방 접종 및 난백 알부민에 도전 한 마우스의 폐의 스테인드 섹션을 에오신입니다. 그것은 ovalbu 점적의 일반화 된 결과를 보여줍니다분은 직접 후두경 검사 방법 (배율 4 배)를 통해 관리.

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Discussion

이 보고서에서 우리는 비 외상성과 같은 동물에서 반복적으로 사용할 수있는 마우스를 삽관하는 간단하고 신뢰할 수있는 기술을 설명합니다. 이 기술은 겸손한 합계 구입하실 수 있습니다 간단한 실험실이나 의료 장비를 수행 할 수 있습니다. 원래 스팅 및 동료 (4)에 의해보고 된 직접적인 후두경의 기술은, 다양한 용도로도 이용 될 수 있지만 주로 정확하게 하부 호흡기에 시험 물질을 전달하는. 때문에 우리는 반복 측정에 대한 편의성, 속도, 단순성, 신뢰성, 낮은 비용, 잠재적 인 날짜에 다른 연구자에 의해보고 된 우수한이 기술을 발견했다.

마우스를 삽관하는 기술은 새로운 것이 아니다. 초기 보고서 중 하나는, 기관의 사용 transillumination 24 G 카테터 5 경구 삽관 하였다. 그러나,이 연구 및 기타 6,7 TEC를 복제 할 수있는 충분한 정보를 제공하지 않았다우리의 실험실에서 hnique. 최근에 다른 수사관은 큰 성공 8,9와이 transillumination 기술을 사용했다. 브라운과 동료에 의해 ​​최초의 상세한 연구는 생쥐, 45 ° 뒤 일시 중단, 자신의 tracheas이 transilluminated했고, 자신의 기관이 제작 후두경 블레이드 (10)를 사용하여 직접 시각화에서 PE90 튜브 경구 삽관하는 연구 결과를보고했다. 이 기술은 복제가 어렵고, 따라서 광범위하게 이용되지 않은 입증되었다. 추가 보고서는 기술의 신뢰성을 향상시키기 위해 강성 광학 스코프 또는 광통신의 사용을 설명한다. Vergari 및 동료 (11, 12)은 성대를 시각화하는 외부 직경 단단한 관절 경 1.7 mm를 사용하고 성문을 통해 가이드 와이어를 배치했다. 저자는 전문적이고 고가의 장비로 수행이 기술 100 % 성공을보고합니다. 이 수술 장비의 비용은 생쥐에서 널리 사용 금지 보인다. 추가 기술은 운영 현미경과 2 층의 가이드 와이어 (13)를 사용하여 개발되었다. 이 기술은 우리 유사하지만 운영 현미경의 사용을 필요로하고, 따라서 우리는 실질적으로 저렴 이경의 사용을 선호.

광섬유 삽관 기술은 상대적으로 저렴한 배터리 전원을 사용하는 광섬유 소스 (14)를 사용하여보고 된 바있다. 우리는이 광섬유 기술을 사용하려했으나, 이에 해당하는 광섬유 시각화 채널이 없기 때문에 유용보다 광을 덜 발견했다. 맥도날드와 동료는 더 강력한 할로겐 광원을 사용하고 작은 샘플에서의 성공을보고했다. 그들은 반복적으로 또한기도 저항 (15)을 측정 할 수 있었다. 상이한 시점에서기도 저항의 반복 측정이 다른 (16)에 의해보고되었다. 자오 등은. 기관을 천공하고, 우울을 통해 가이드 와이어를 공급하여 역행 기술을 사용O-및 구강 인두 17. 최근에 가수, 등.는 카테터 (18)의 위치를 문서화하기 위해 운영 현미경과 형광 투시법을 사용하여 마우스를 왼쪽 mainstem 기관지의 선택적 삽관을 수행했습니다. 그런 다음 폐에 선택적으로 시험 물질을 주입하기 위해이 방법을 사용했다. 그러나, 이것은 다시 상당한 비용과 고도의 기술 교육을하지 않고 사용할 수있는 방법이 될하지 않을 것입니다. 또한, 투시는 연구에 방사선 위험을 추가합니다.

요약하면, 소아 이경을 사용하여 마우스를 직접 후두경은 기관 내 삽관을위한 가치있는 기술, 반복 삽관 및 삽관없이 시험 물질의 전달입니다. 우리는 기관 절개술이 기술은 우수한 찾아 이전에 간접적으로 마우스에서 기관 내 삽관 법을 수행하는 방법을보고했다.

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

베테랑 담당 부서에서 메리트 그랜트와 건강의 국립 연구소의 NHLBI에서 T32-HL098062 그랜트는이 작업을 지원했다. 우리는 기꺼이 랜돌프 H. Hasting, MD, 박사의 조언을 인정하고자하는 그리고 조언과 VA 샌디에고 헬스 케어 시스템의 수의학 단위의 지원.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operating Otoscope Head Welch Allyn 21700 $188.98
Otoscope Handle Welch Allyn 71000 $112.20
Reuseable Speculum Welch Allyn 22002 $3.98
Fine Forceps Miltex 18-779 $107.18
Small clamp stand to hold otoscope
Isoflurane Vaporizer (multiple circuit with vacuum waste gas handling) Summit Medical $3,000
Flexivent (Animal Ventilator) SCIREQ $35,000
Intravenous catheter (20 G, 1 in) BD 381233 $9.62
Polyethylene tubing (PE10) (0.011 in I.D., 0.024 in O.D.) 100 ft Intramedic, Clay-Adams 427401 $115.70
Ketamine 100 mg/ml (10 ml bottle) Butler 23061 $10.00
Xylazine (100 ml bottle) Vedco 24105 $20.00
Isoflurane (250 ml bottle) $15.00
Vecuronium bromide 10 mg/10 ml Pfizer NDC 0069-0094-01 $15.00

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References

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의학 제 86 폐 생리학 기관 내 삽관 후두경,기도 저항 삽관 법
마우스의 기관 내 삽관<em&gt;를 통해</em이경 사용&gt; 직접 후두경
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Thomas, J. L., Dumouchel, J., Li,… More

Thomas, J. L., Dumouchel, J., Li, J., Magat, J., Balitzer, D., Bigby, T. D. Endotracheal Intubation in Mice via Direct Laryngoscopy Using an Otoscope. J. Vis. Exp. (86), e50269, doi:10.3791/50269 (2014).

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