Summary
פרוטוקול זה מתאר הליך explant משופר הכולל
Abstract
התפתחות קליפת מוח כרוך אינטראקציות מורכבות בין תאי עצב ואלמנטים שאינם עצביים בין תאים מבשרים, כלי דם, קרום מוח ומטריקס המשויך. משום שהם מספקים סביבה מתאימה organotypic, explants הפרוס קליפת המוח משמשים לעתים קרובות כדי לחקור אינטראקציות אלה ששולטים בהתמיינות והתפתחות עצביות. אמנם מועיל, מודל explant פרוסה יכול לסבול מחסרונות כוללים למינציה סלולרית חריגות והגירה. כאן אנו מדווחים מערכת כל חץ כדור מוחית explant ללימודים של התפתחות קליפת המוח הקדומה שיותר קל להכין מפרוסות ומופעי קליפת מוח הגירת organotypic עקבית ולמינציה. במערכת מודל זה, למינציה המוקדמת ודפוסי נדידה להמשיך כרגיל לתקופה של ימים במבחנה, לרבות תקופת פיצול preplate, במהלך ששכבת קליפת מוח פוטנציאלית שש צורות. אז פתחנו electroporation הרחם לשעבר (EUEP)גישה שמשיגה הצלחה ~ 80% במיקוד הביטוי של GFP לנוירונים בקליפת המוח המתפתחים המדיאלי הגבה.
כל מודל explant האונה עושה פיתוח נגיש עבור electroporation התערבות, תרופתית וגישות הדמיה חיות מוקדם קליפת המוח. שיטה זו מונעת ניתוח ההישרדות הנדרשת ברחם electroporation (IUEP) גישות תוך השיפור גם transfection ועקביות מיקוד Areal. שיטה זו תאפשר מחקרים ניסיוניים של שגשוג, נדידה והתמיינות של תאי עצב.
Introduction
צורות יונקי קליפת המוח באמצעות התפשטות, ההגירה ובידול המרוכז של נוירונים שנוצרו ברציפות. כל נוירון הוא נולד באזור חדרית (VZ) ונודד מVZ לאיזור ביניים (א.ת.), ויצר את צלחת קליפת המוח (CP) 1. כשהם עוברים דרך תחומים שונים של קליפת מוח, תאי העצב הנודד יציג את המצבים מרובים של הגירת 2,3 התלויים בסביבה התאית ומרכיבים תאיים אחרים (למשל גליה רדיאלי) בתוך הרקמה המתפתחת. נוירונים בקליפת מוח ואז לעצור את ההגירה בראש צלחת קליפת המוח להרכיב בתהליכים החופפים מעצר הגירה ועצבי 4 dendritogenesis.
התפתחות קליפת המוח היא שיזם בין ימים עובריים 11-13 (E11-13) 5 עד הקמתה של השכבה הקדמונית plexiform 6 או preplate (PP), שכבה של תאי עצב חלוץ שoverlies VZ. לעתידשכבת 6 נוירונים בקליפת מוח (כלומר נוירונים בקליפת המוח הראשונים שנולדו בVZ) ואז לכוון אותם בsomata דפוס סטריאוטיפי ולהתגבש לשכבה ברורה בתוך 7 PP. אירועים אלה לפצל preplate ל( שכבת עתיד קורטיקלי 1) שטחית שולית ואזור עמוק, שהאחרון המורכב של תאי קליפת המוח (שכבת subplate חולפת 7). תהליך זה, המכונה פיצול preplate, הוא אירוע מכונן בצמיחה העתידית של קליפת מוח 8.
מוטציות גנטיות רבות זוהו לשבש היבטים שונים של התפתחות קליפת המוח 9. התפתחות קליפת המוח יכולה גם להיות מושפעת לרעה על ידי חשיפה לרעלי ingested כמו קוק 10 ו 11 באלכוהול. בגלל מומים בקליפת המוח שמתעוררים במהלך פיתוח הם תורמים צפויים הפרעות נוירולוגיות (למשל אוטיזם, סכיזופרניה), חקירות אמפיריות של הפרעות להתפתחות קליפת מוח טבועותly החשוב. לכן חשיבות רבה להקמת גישות ללמוד פיתוח קליפת המוח שייאפשרו מבחנים מהירים של השפעות גנטיות או רעל אבל זה גם לשמור על אינטראקציות האפשריות בין הנוירונים מבדילים, סוגי תאים אחרים ומטריקס (ECM) בתקופה המוקדמת של התפתחות המוח 12 .
explants Slice 13 ספק מערכת כזו והיה בשימוש נרחב לפיתוח נוירון קורטיקלי assay 14-16. עם זאת, מבחנים פרוסים יכולים לסבול מהחסרון שההגירה ולמינציה עצבית יכולים להיות נורמלית 17 אולי בשל ניזק לתאי meningeal המקיפים את המוח ועוגן פיתוח רדיאלי גליה פיגום. כסיבי גליה רדיאליים הם מצע חשוב ל18 שיבוש הגירת נוירון קורטיקלי של lamina הבסיס של חיתוך עלול לשבש באופן מקומי ארכיטקטורת גלייה רדיאלי ולהוביל להגירת קליפת מוח שונה. בנוסף SLIמשטחי CED של explants מספקים אזור של תאים מתים שעשוי לשנות את ההרכב הרגיל של ECM באזורים אלה.
גישות מאוחרות יותר התמקדו הניתוח שלהם בתאים הנמצאים עמוק בפרוסה שמוקפות בסוגים מתאימים בריאים סלולריים וECM. עם זאת, במקרים מסוימים גם גישות חדשות אלו יכולות לדרוש שהפרוסה העבה התרבותית המקורית להיות cryo-נותחה או פרפין נותח לאחר קיבוע כך שהחלק הפנימי הנורמלי יחסית של הפרוסה נעשתה זמין לניתוח 19-21. שניהם vibratome המקורי חתך להכין את הפרוסות החיות לתרבות כמו גם cryosectioning הבא של פרוסות קבועות לניתוח דורש טיפול ומאמץ למבחנים אלה לעבודה.
כדי לספק גישה פשוטה, ללימודים משלימה של התפתחות קליפת מוח מוקדם, יש לנו גישות שונות an פרוס קיימות 13 כדי להקל על מחקרים של התפתחות קליפת מוח בשלב מוקדם. פתחנו WHמודל ole אונת explant דומה למודל קיים E14 כל אונה שמעורבות תרבויות רועדות ב 65 סיבובים לדקה וצמיחת organotypic מותר ל16-18 שעות 22,23. בגישה שלנו, explants אונה השלמה מונחים על קרום חדיר למחצה עם 13 באווירת תרבות חמצן גבוהה 21,24 להאריך צמיחת קליפת המוח organotypic עבור 48 שעות. גישה זו גם מאפשרת לelectroporation העקבי של פיתוח נוירונים בקליפת המוח. העוברים יוסרו מהרחם וelectroporated להציג את ה-DNA פלסמיד ולאחר מכן telencephalon מנותח. אונה כל מבודדת והניחה את הצד המדיאלי על מסנן קולגן מצופה. אז explant בתרבית לתקופה של 48 שעות, תקופה שכוללת פיצול preplate 8. בתקופת התרבות, L6 הנוירונים להתפתח ממבשרים 25 נוירון המובחן, ממוקם כראוי בתוך צלחת קליפת המוח. בכל תקופה זו מתפתחתנוירון מוקף ECM המתאים וסוגי תאים שיעמידו התא המתאים בגוף חי. שיטה זו כבר הוכיחה יקרה בפענוח האירועים התאיים העומדים בבסיס רעילות אתנול 26, 6 והיווצרות שכבת preplate פיצול 7,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Electroporations רחם אקס עם ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק פלסמיד
- פתרוני הזרקת DNA פלסמיד שהוכנו CAG-27-DNA eGFP המדולל לריכוז העבודה הסופי של 0.33 מ"ג / מ"ל בDDH 2 O. -Preps מקסי Endo-חינם Qiagen משמש כדי לטהר פלסמיד מחיידקים מותמרים. צבע ירוק מהיר ב~ 0.02% (w / v סופי) הוא הוסיף לתמיסת ה-DNA כנותב הזרקה.
- כדי להכין את אזור הניתוח, התיז על גבי ספסל ובמת מיקרוסקופ לנתח עם 70% אתנול ופתרון נגב יבש. רסס מספריים ומלקחיים כירורגית עם אתנול 70% לפני הנתיחה ולנגב יבשים.
- סכרי מתוזמן הריון שויצרי / ובסטר מוקרבים על E13 על ידי העביר לחדר מלא בCO 2 מצילינדר לחץ והסכר הוא פיקוח עד שכל התנועה שעצרה לדקות לפחות 1. לאחר קורבן על ידי 2 משאיפת CO העוברים יוסרו מן הרחם והניחו ב10 פתרון סנטימטר צלחת הפטר שהכיל קרח קר הנקס מאוזן מלוח (HBSS).
- זהירות לנתח כל עובר מהקרומים המקיפים extraembryonic ולשמור בHBSS קר כקרח.
- העבר כל עובר באופן פרטני למנה שנייה 10 סנטימטרי פטרי המכילה HBSS הקר. השתמש במזרק המילטון להזריק 2-3 μl של התערובת הירוקה DNA המהירה לתוך את החדר של האונה השמאלית של המוח, טיפול להזריק באזור מרחב נפרד מאזור קליפת המוח לקליפת מוח ניתוח בעתיד.
- לelectroporate, להחזיק את העובר בעדינות בעזרת מלקחיים וקלים למקם את ההנעה החיובית של האלקטרודה פינצטה על קו האמצע הגבה של הראש וקל למקם את ההנעה השלילית מתחת לסנטר העובר. Electroporations מושגות עם BTX830 electroporator המתוכנת לספק 5 30 פולסים V של 50 אלפיות משך, מופרדים על ידי מרווחי 950 msec. הגדרות אלה הן לBTX830 המודל. מערכות אחרות ניתן להשתמש על פי instructio של היצרןns.
2. הכנת Explant חצי כדור שלמה
- לאחר electroporation העוברים מוצבים בחזרה לHBSS קר כקרח. המוח מוסר באמצעות שני # 5 מלקחי תכשיטים להסיר את העור וגולגולת סחוסים מראש העובר. מלקחיים אז הוא החליק מתחת למוח כדי להסיר את המוח ללא פגע מהגולגולת. אונת electroporated (משמאל) לאחר מכן גזורה מרקמת המוח ובמצורפת אמצע המוח הוסרה. במהלך טיפול הליך הנתיחה נלקח לא לפגוע בקרומי המוח מונחים על האונה השמאלית של קליפת המוח.
- ברגע שנתח את כל עובר מועבר בHBSS באמצעות pipettor עם קצה חיתוך 1 מיליליטר פיפטה. האונה מסולקת בעדינות על גבי עלון תרבות קולגן מצופה. עד שישה explants אונה מסודרים צד המדיאלי על כל עלון מ"מ 24. HBSS לאחר ארגון העודף יוסר מלהוסיף ולאחר מכן להוסיף ממוקם לתוך 1 35 מ"מ גם של מנה גם 6. גם מכיל Exactly 2.7 מ"ל של תקשורת: תקשורת DMEM-F12 המכיל Glutamax והשלים עם 2% B-27, 1% G5 ו 1% פניצילין-דלקת. כמה טיפין של תקשורת מהיטב ניתן pipetted על גבי זה explant, אבל לא להוסיף מדיה בעודף של 2.7 מ"ל המקורי לטוב.
- לאחר explants הוצב על גבי מסנני קולגן המנה גם 6 המכילה את explants ממוקמת לתוך Billups רוטנברג (BR) קאמרי (שמכיל גם מנת humidifying של מים). תערובת של 95% חמצן / 5% / CO 2 גז הוא החדיר לתוך התא לדקות לפחות 1 לפני האיטום סוגר הקאמרי וניתוק צינור אספקת הגז 2 95% החמצן / 5% / CO. BR הקאמרי הועבר אז ל37 מעלות צלזיוס רקמות תרבות חממה ליתרת תקופת התרבות, 1-2 DIV.
3. קיבוע של רקמות Explant ליסטולוגיה
- במנדף להכין פתרון קיבעון פגאנו ידי g 8 solubilizing הראשון של paraformaldehyde ב100 מ"ל של שחוממה מראש (~ 80 & דהז; C) DDH 2 O. הוסף 1-3 טיפין המרוכזות NaOH לקדם solubilization ועדינות מערבבת. ברגע solubilized לערבב 8% פתרון paraformaldehyde 01:01 עם פתרון זה הוא סוכרוז 500 מ"מ, 100 המ"מ Hepes, 7.4 pH, 50 המ"מ MgCl 2, KCl mM 5 לריכוז סופי של paraformaldehyde 4% ב -250 50 המ"מ Hepes סוכרוז המ"מ , 25 המ"מ MgCl 2, 2.5 mM KCl, 7.4 pH.
- כדי לתקן את explants לחמם את פתרון תיקון פגאנו עד 37 ° C. סר במהירות מרבית DMEM/F12 מדיה מכל תרבות היטב ומוסיף 5 מ"ל של תקן פגאנו לכל באר של explants. הקפד לכסות את כל explant לחלוטין בתיקון. תקן עבור שעה 1 בRT. אל תסיר explants ממסנן לפני 1 השעה של קיבעון.
- לאחר הקיבוע להסיר את פתרון תיקון פגאנו ולהחליף עם פתרון פגאנו בלי מנה (250 מ"מ 50 Hepes סוכרוז מ"מ, 25 המ"מ MgCl 2, 2.5 המ"מ KCl, 7.4 pH). הוסף כמה טיפין של 10% יזידו הנתרן וחנות ב 4 ° C עד הטבעה.
4. הטבעה וSectioning ליסטולוגיה
- הכן 10% פתרון ג'לטין עור עגל בsolubilizing 10 גרם ג'לטין בעור העגל 100 מיליליטר מים חמימים (55-60 מעלות צלזיוס). הנח פתרון ג'לטין על פלטה להגדיר עד 60 ° C ומערבולת מעת לעת עד solubilized.
- יוצק כ 10 מ"ל של תמיסת הג'לטין 10% לתחתית צלחת פטרי 10 סנטימטרים ומאפשרים 30 דקות כדי לחזק. זה יהיה בצורה "כרית" להטבעה את explants. רפידות אלו יכולות להיות ימים שהוכנו מראש ומאוחסנות ב 4 ° C. השתמש בסרגל כדי לצייר רשת בתחתית צלחת הפטר ולהעביר explants הבודד לתוך כל תיבה של הרשת. הסר פתרון פגאנו שיורים והשימוש pipettor, לכסות כל explant עם פתרון ג'לטין חם 10% ולאפשר לביסוס. בנוסף לחדש איטי של פתרון ג'לטין עד שכל explant מוקף לחלוטין על ידי ג'לטין, נזהר שלא להמס את המשטח על ידי התוספת של מדי לחמם ג'לטין מדי בבת אחת. לאפשר לג'לטין להקשיח ל~ 1 שעה. ברגע שהקשיח individexplants רע"מ אפשר לחתוך בלוקים קטנים של ג'לטין. את הלוקים לפרסם-קבועים אז בפגאנו לתקן עבור 24-48 שעות לפני החתך עם vibratome.
- Explants בלוקי ג'לטין מוצב נורת חוש ריח ונותח במטוס העטרה בעובי מיקרומטר 100. הסעיפים נאספים ונשמרים בPBS + 0.1% יזידו הנתרן ב 4 ° C עד עיבוד immunohistochemical.
- איתור immunohistochemical מתבצע על ידי העברת חלקים לצלחת גם 24 (2-3 חלקים לטובים). נוגדן הבלוק הראשון הלא ספציפי מחייב על ידי הוספת 0.5 המ"ל PBST + B (PBS 0.5% + טריטון X 100 ו 2% BSA) לכל באר, שעות לדגור 1 עם טלטול עדין. אז הנוגדן הראשוני המתאים דילול בPBST + B ו -0.4 מ"ל לגם הוא הוסיף לדגירת הלילה בRT. העיקרי הוא שטף החוצה עם 3X PBS שוטף לפחות 10 דקות כל אחד. הנוגדן המשני ו2 מיקרוגרם / המ"ל Hoechst 33342 גרעיניים כתם לאחר מכן, בדילול PBST + B והדגימות מודגרת עבור 2 שעות בRTעם טלטול עדין. שלוש כביסות PBS (10 דקות כל אחד) ולאחר מכן מבוצעות הסעיפים הם רכובים על שקופיות באמצעות 90% גליצרול 50 mM טריס, pH7.4, תקשורת גוברת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המכרסם העוברית הקליפה מציגה שיפוע neurogenetic רוחבי לאורך כל תקופת ההתפתחות, שהניאוקורטקס כגון רוחב הוא יום כ 1 בוגר יותר מ 28 הניאוקורטקס המדיאלי הגבה. חלק הארי של שכבה 6 הנוירונים נוצרים כך (כלומר, תציג S-השלב הסופי שלהם) על E12 בקליפת מוח לרוחב (המכונה גם שדה 40 5) ובE13 בקליפה המדיאלי הגב (המכונה גם שדה 1 5). פיצול Preplate מתחיל כ 1 יום אחרי דור נוירון שכבה 6 וכך הוא יזם בקליפה החיצונית על E13 וקליפת המוח הגבה על E14. ללמוד פיצול preplate והייזום של פיתוח צלחת קליפת המוח, אנחנו שונים assay explant פרוסה 21,24 כך שאונות מוח כולו היו בתרבית בדרך כלל מE13 לE15 (איור 1).
בדקנו את הכדאיות של טכניקת explant קליפת המוח על ידי בחינת הצמיחה של explants אונה השלם derived מ( Eomes :: eGFP) עכברי Tg GSAT (איור 2). עכבר זן זה מכיל transgene שמדווח נוירונים בוגרים של שושלת קליפת המוח מעוררת 7,29,30. explants קליפת אונה השלם היו מוכן בE13, בנקודת זמן לפני preplate פיצול בהניאוקורטקס הגבה (איור 2 א). explants קליפת המוח מאותה ההמלטה היה ירידה קבועה ברצף על פני תקופה של 2 DIV ומעובד לניתוח היסטולוגית לאחר מכן. בנקודת זמן הניתוח הראשונית (DIV 0), פיצול preplate עדיין לא התרחש בשדה 1 (הניאוקורטקס הגבה; 2A דמויות, 2E). על ידי DIV 1 CP הוא לכאורה (התרשימים 2B, 2C, 2F, 2G), והיא ממשיכה לגדול עד 2 DIV (התרשימים 2D, 2H). כך השלם שexplants אונת תרבית תחילה בE13 תמיכה במשך ימי ההבשלה של קליפת המוח ובלוכד פיצול preplate בהניאוקורטקס הגבה.
כדי לאשר את הנורמהאל פיתוח היסטולוגית בהניאוקורטקס הגבה, אנו immunostained 2 explants DIV לproteoglycans כונדרואיטין סולפט (CSPGs), מרכיב תאי שגם סמן הוקם של PP ונגזרותיו MZ ו-SP 8,31,32. Immunostaining עבור CSPGs מגלה שתי להקות של CSPG immunoreactivity בקליפת המוח הגבתה המציין פיצול המתאים של PP לMZ ו-SP במהלך תקופה בתרבות חוץ גופייה (איורי 3A-3C). PP מחולק על ידי L6 נוירונים בקליפת מוח שידוע כי הם מבטאים את גורמי שעתוק Ctip2 וTbr1 7,33,34. דפוס immunostaining של סמנים אלה (איורי 3D-3F, 3G-I, בהתאמה) מאשר את הביטוי המתאים של גורמי השעתוק האלה במחסום שהוקם זה עתה. יחד ניתוחים אלה מאשרים התפתחות קליפת מוח מוקדם organotypic בexplants האונה השלם.
ברחם electroporations נעשה שימוש נרחבלבדיקה לתפקוד גן אוטונומי תא בקליפת המוח המתפתחת 35. לכן בדק האם electroporation יכול transfect הצלחת נוירונים במודל explant האונה השלם. החדר השמאלי של E13 עוברים שלמים הוזרקו 0.33 CAG-GFP פלסמיד מ"ג / מ"ל וelectroporated (ראה שיטות) כדי להציג את ה-DNA פלסמיד לתוך מבשרי נוירונים המרפדים את החלל לרוחב (איור 1 א). אחרי 2 DIV את explants בוטלו קבוע ומחולק לניתוח היסטולוגית. בנקודת זמן זו, תאים להביע GFP נצפו בכל האזורים בקליפת המוח על פני קיר המוחין (תרשימי 4A-4C). ביטוי של GFP יכול להיבחן ממבשרי נוירונים בVZ תוך תאים להביע GFP אינטנסיביים נצפו בא.ת. ושיתוק המוחין. חשוב מכך, מספר רבים של GFP + נוירונים נצפו בחלק העליון של המחסום יוצר עם דנדריטים ואקסונים המתעוררים. התאים יצרו שכבה נפרדת בממשק שבין המחסום וMZ indicatinהמעצר גרם מתאים הגירה ולמינציה (דמויים 4A-4C, חיצים). הדנדריטים הוארכו לMZ תוך האקסונים corticofugal לגדול מתחת למחסום ולא.ת. (תרשימי 4A-4C ו5, ראה גם S1 סרטים נוספים). מתחת לתאים המבדילים הם GFP + תאים בשלבים שונים של בשלות, כוללים נוירונים עם מורפולוגיה דו קוטבית, ובצד לסיבי גליה רדיאליים ומתחתם, נוירונים multipolar בא.ת. (4D-4F איורים). בנוסף, הדנדריטים הם נצפו הארכה לMZ בי reelin חלבון ECM הוא כראוי immunolocalized (תרשימי 4G-4i). תנאי electroporation וexplant כך לאפשר התפתחות תקינה של תאי עצב בקליפת המוח דרך השלבים מקדימים למעבר לנוירון נוירון הבחנה לא בוגר.
בזמן electroporation (E13) 100% מתאי העצב המיוצרים על ידי VZ neocortical הגב הם L6 הנוירונים, הנוירוניםשפצל את PP 5. electroporation המוצלח דורש שמבנים יוכנסו נוירונים במהלך 6 שעתי ערב, או בזמן, M-שלב של מחזור התא 36. הוא ציפה כי postmitotic המוקדם, GFP + נוירונים הבאים E13 electroporation בקליפה הגבי (שדה 1) צריך לאכלס את מחסום היוצרים. נוירונים כאלה היו נצפו (איור 4) מצביעים על כך שהפרוטוקול אמין יכול למקד L6 נוירונים בקליפת מוח ללימודי ההגירה וההתבגרות שלהם.
כדי להעריך את "שיעור ההצלחה" של הליך electroporation / explant נתחנו חקירה מתמשכת מהמעבדה שלנו. במסגרת מחקר זה, 21 גרים של explants הוכנו, סך של 248 עוברים electroporated (כמתואר לעיל) עם CAG-GFP, וexplant אונה אחת מכל עובר היה מוכן. מבין 248 explants המקורי, 195 (79%) נשפטו מתאימים להדמיה וניתוח. כמחצית מ53explants שלא יכול להיות מנותחים נכשל להביע GFP או היה ביטוי של GFP אי - ממוקד. ההפסדים שנותרו הוסברו על ידי צמיחת dysmorphic בשל explant ניתוק ממסנן התרבות, או בעיות הקשורות לעיבוד היסטולוגית. שיעור זה הצלחה של בערך 80% (איור 5) הפך את מערכת explant המתאימה למחקרים פרמקולוגיים 26, כמו גם הניתוח של מוטציות רצסיבי 7 שמשפיעים לרעה על התפתחות קליפת מוח בשלב מוקדם.
איור 1. ההליך כולו אונה explant עם electroporation הרחם לשעבר. A) E13 עוברי עכברים מוזרקים עם פתרון ה-DNA פלסמיד וelectroporated. מוחותיהם גזורים וצניעות הצטלבו sagitally. Electroporatedאז אונה ממוקמת בצד המדיאלי על קולגן מצופה מסנן ותרבית ל2 DIV. שני חצאים המוח ואז ניתן הדמיה חייה או קבועים ליסטולוגיה וניתוח הדמיה שלאחר מכן. ב ') תמונה של 10 explants הונח על שלושה מסננים בצלחת 6 היטב רקמת תרבות. C) המנה גם שש עם explants ממוקמת בסביבת חמצן גבוהה (95% O% 2/5 CO 2) בתוך Billups-רוטנברג חממה קאמרית, אשר לאחר מכן יוצב בתקן 37 מעלות צלזיוס רקמות תרבות חממה.
איור 2. צמיחת Organotypic צלחת קליפת המוח באונה השלם explants נגזר מהמלטה אחת של Eomes :: עוברי eGFP., E) סעיף עטרה ממוח ירידה קבועה בתחילת הכת תקופת יור (O DIV). שימו לב שPP קיים אך CP שיש עדיין לטופס. האות הירוקה מופקת על ידי ביטוי של GFP בתאי עצב מעוררים לא בשלים והכחולה הוא צבע Hoechst שמתייג את הגרעין של כל התאים. ב ', ו). צמיחת CP, מסומנת על ידי קווים מקווקווים, הוא נצפה על ידי 0.5 DIV ועליות ידי DIV 1 (ג וז) ו 2 DIV (לוחות D ו-H). שים לב לעובי המוגבר של ה-GFP להביע תחום תא בספירת לוחות, המציין את הריבוי ובידול של שושלת נוירון המעוררת בexplant. ברי היקף של 500 מיקרומטר (פנל) ו 50 מיקרומטר (הפנל H). קיצורים: CP, צלחת קליפת מוח; א.ת., בינוני אזור; MZ, אזור שולי; SP, Subplate; VZ, אזור חדרית.
/ 50271/50271fig3.jpg "/>
איור 3. פיצול Preplate בexplants אונה השלמה. AC) סולפט גליקן immunostaining כונדרויטין (CSPG) ממחיש את החלוקה (פיצול) של PP לMZ ו-SP. DF) הביטוי של גורם השעתוק Ctip2 במחסום שהוקם זה עתה. GI) ביטוי של Tbr1 גורם השעתוק במחסום שהוקם זה עתה. ברי קנה מידה הם 50 מיקרומטר בלוחות C, F, אני.
איור 4. ביטוי של GFP בexplants אונה השלמה לאחר electroporation E13 לשעבר רחם. AC) ביטוי של GFP לאחר 2 DIV. שים לב לשכבה של נוירונים בקליפת המוח ויוצרים בחלק העליון של CP (חיצים). DF) Nestin (אדום) immunoreactivity בקטע מexplant אונה שלמה. GH) immunoreactivity reelin (אדום) בסעיף הנגזר מexplant אונה שלמה. ברי היקף בלוחות C, F, ואני הם 50 מיקרומטר.
איור 5. השתנות במיקוד electroporations הרחם לשעבר לקליפה המדיאלי הגבה (שדה 1). עשרה עוברים מהמלטה אחת היו electroporated עם CAG-GFP ביטוי המבנה (0.33 מ"ג / מ"ל) והתרבותי כexplants אונה שלמה. AI) תשע מתוך 11 הראו explants ביטוי של ה-GFP בקליפה המדיאלי הגבה. למרות שהביטוי של GFP משתנה בין explants, בכל GFP explant הוא זוהה בכל השלושה האזורים בקליפת המוח (כלומר VZ, א.ת. וCP). סרגל קנה מידה הוא 50 מיקרומטר בפנל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש לנו שיפור ומוערך מודל ניסויי - explants אונה השלמה - למחקר על התפתחות קליפת מוח המוקדמת (E13-E15). המודל הוכיח שימושי לניתוח של הגירה ובידול של שושלת נוירון המעוררת שמהווה שכבה 6 של קליפת מוח 25,37. יתרונותיה העיקריים של המערכת הם: 1) צמיחת organotypic ל2 DIV, 2) פשטות של הכנה, ו3) גישה ניסויית לתאי העצב לelectroporation מניפולציה, תרופתיות והדמיה במהלך תחילת תקופה זו קריטית של התפתחות מוח. יש לנו להשתמש במערכת כדי לתעד הבדלים עדינים במורפולוגיה, הכיוון וצמיחת הדנדריטים של 6 נוירונים בקליפת מוח השכבה 7,38 בתקופת פיצול preplate.
הנוירונים המעוררים המאכלסים שכבה 6 מורכבים ברובם נוירונים ההקרנה corticothalamic המספקים הזנה הדדית להתלמוס הגבה 39,40 41. למרות שהנוירונים האלה הם פיסיולוגיים מיוחדים, תהליך יצירה, הגירה והתבגרות של שכבת תאי עצב 6 מניות תכונות בסיסיות עם כל הנוירונים המעוררים בשכבות 2-6 של הקליפה. באופן ספציפי, כל הנוירונים בקליפת המוח המעוררים נוצרים בVZ telencephalic הגבה, נודד דרך IZ כנוירונים multipolar, ולהבדיל בתוך 7 CP. ההבשלה של נוירונים בקליפת המוח המעוררים היא מונע על ידי סט ליבה של גורמי שעתוק הביעו רצף: Pax6, Tbr2, וTbr1 29. רצף זה משותף לכל הנוירונים המעוררים בשכבות 2-6 42 ואשרנו את הביטוי המתאים של Tbr1 במחסום שהוקם זה עתה (תרשימי 3G-3i). ניצול בגישה זו כדי לחקור את הפיתוח של 6 נוירונים בקליפת מוח שכבה צריכה כך לספק תובנה חיוניות להתפתחותו של נירוrons המהווה את כל השכבות בקליפת המוח.
explants אונה השלם להשלים גישות קיימות ללימודים של פיתוח נוירון קורטיקלי. מחקרים קודמים הועסקו גישת E14 כל אונת explant ללמוד פיתוח קליפת המוח לDIV 1 22,23. יש לנו שילוב explants אונה שלמה עם electroporation הרחם לשעבר לחקור 2 ימים של התפתחות קליפת מוח בתקופת ההיווצרות L6 ופיצול preplate. בניגוד לelectroporations הרחם בE13, שיעור ההצלחה של electroporations רחם לשעבר אחרי explant אונה השלמה הוא גבוה יותר: בידות שלנו אנו משיגים הצלחה ~ 80% במיקוד electroporation לtelencephalon הגבה. בנוסף, בelectroporations הרחם דורש ניתוח הישרדות ולקחת את המאמץ ניכר טכני יותר מאשר גישת הרחם לשעבר האונה השלמה. לבסוף, במחקרי רחם אינם מוכן מקובל תרופתי מדויקמניפולציות וגישות הדמיה. שליטה זמנית מדויקת במסירה או ההפעלה של סמים וסוכנים מולקולריים (וקטורי ביטוי, בונת השתקה, וכו ') בריכוזים מוגדרים מסופקת עם explants האונה השלמה, אך קשה יותר להשגה ברחם. לחיות ניטור אופטי של ההשפעות כתוצאה של מניפולציות כאלה, עם רזולוציה מרחבית בטווח מיקרון, הוא זמין עם EUEP, אבל לא IUEP. הדיוק הזה הוא סביר באופן משמעותי כדי לשפר את כוחו הפרשני של נתונים שנאספו מהניסויים המעורבים פיתוח ותפקוד של קליפת מוח. כך ללימודים של explants המוקדם קליפת מוח פיתוח השלם אונה יש יתרונות ברורים על פני ניסיוני גישת הרחם ב. בשלב זה, עם זאת, ללימודים של תאי עצב בקליפת מוח שכבה העליונים וניסויים הדורשים איסוף נתונים> 48 שעות, explants הפרוס וגישות ברחם יישארו עדיפים.
יש מספר דרישות קריטיות להצלחה של טכניקת explant אונה השלמה. ראשית, צמיחה של explant היא רגישה מאוד לשלמות המכאנית של קרומי המוח. ניזק פיזי לקרומי המוח (דקירות או דמעות כלומר) יהיה במינימום לשבש פיתוח מקומי של הקליפה הבסיסית. שנית, צמיחת explant רגישה להיקף הכולל של תקשורת בתוך התרבות גם: עם תקשורת יותר מדי את explants יהיה להתנתק מהמסנן ולפתח ארכיטקטורת CP מעוותת; עם תקשורת מעט מדי וexplants צפויים להתייבש ולחוות מוות של תאים מופרז . לבסוף, עם explants הטכניקה הנוכחית שתעדנו צמיחת קליפת מוח ל2 DIV. כאשר מתחילים בE13 חלון זמן התפתחותי זה, למרות שהודה בחקירה יקרה ערך רבה, מגביל את הניתוח לתקופה שלפני synaptogenesis ותקשורת העצבית הקנונית. למרות שנוירונים בקליפת המוח בE14.5 mRNAs רב המפורש קידוד חלבונים סינפטיים ("Target =" _blank w.genepaint.org "> www.genepaint.org), synaptogenesis אינו מתחיל עד ~ E15 בקליפה לרוחב, וsynaptogenesis זה מוגבל לpreplate תאים במקום שכבה 6 נוירונים 43. כמה שאלות קריטיות הנוגעות היווצרות סינפסה קליפת מוח ותפקוד ולכן הם לא כרגע מיעון עם מערכת explant אונה השלמה.
לסיכום הכנת explant אונה השלמה יכולה לשמש אמין ועקבי כדי לחקור פיתוח קליפת מוח בשלב מוקדם במודלי עכבר של מומים תורשתיים במוח. הטכניקה היא בקלות להתאמה לRNAi, shRNA, ומניפולציות מולקולריות ותרופתיות אחרות. כל explant האונה מתאים גם למחקרים שכלל חלבון מיושם רקומביננטי, תרופות ורעלים סביבתיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על מענקים מNINDS (NS066071) וNIAAA. (P50AA017823) לECO. המחברים מודים לד"ר רוברט קווין וצוות במחלקת המשאבים חיו מעבדה לטיפול בבעלי חיים. אנו מודים ג'דסון למונט לתמיכה טכנית, ניקול Belletier לסיוע כעמיתת מחקר לתואר ראשון קיץ (SURF). אנו מודים גם לד"ר דיוויד קמרון להערות ועריכות בגרסה קודמת של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 + GlutaMAX | GIBCO | 10565 | |
| G5 Supplement 100X | Invitrogen | 17503-012 | |
| B27 Serum-Free Suppl. 50X | Invitrogen | 1504-044 | |
| Pen / Strep Liquid 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| HBSS 500 ml | GIBCO | 14025 | |
| Culture insert collagen coated | Costar | 3492 | |
| Bovine skin gelatin | Sigma | G9382 | |
| H–chst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 7906 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Equipment | |||
| BTX 830 Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Tweezer electrodes 10mm | Harvard Apparatus | 450166 | |
| Incubator | Billups Rothenberg | MIC-101 | |
| Hamilton syringe (5uL) | Hamilton | 87930 | |
| Hamilton syringe needle | Hamilton | 7803-04 | Specify 1" and style 4 |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11251-10 | |
| Fine Scissors Tough Cut 9 cm | FST | 14058-09 |
References
- Rakic, P.
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J. Neurosci. 23, 9996-10001 (2003).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. , (2004).
- Olson, E. C., Kim, S., Walsh, C. A. Impaired neuronal positioning and dendritogenesis in the neocortex after cell-autonomous Dab1 suppression. J. Neurosci. 26, 1767-1775 (2006).
- Takahashi, T., Goto, T., Miyama, S., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Sequence of neuron origin and neocortical laminar fate: relation to cell cycle of origin in the developing murine cerebral wall. J. Neurosci. 19, 10357-10371 (1999).
- Marin-Padilla, M. Early prenatal ontogenesis of the cerebral cortex (neocortex) of the cat (Felis domestica). A Golgi study. I. The primordial neocortical organization. Z. Anat. Entwicklungsgesch. 134, 117-145 (1971).
- Nichols, A. J., Olson, E. C. Reelin promotes neuronal orientation and dendritogenesis during preplate splitting. Cerebral Cortex. 20, 2213-2223 (2010).
- Sheppard, A. M., Pearlman, A. L. Abnormal reorganization of preplate neurons and their associated extracellular matrix: an early manifestation of altered neocortical development in the reeler mutant mouse. J. Comp. Neurol. 378, 173-179 (1997).
- Manzini, M. C., Walsh, C. A. What disorders of cortical development tell us about the cortex: one plus one does not always make two. Current Opinion in Genetics & Development. 21, 333-339 (2011).
- Jones, L., Fischer, I., Levitt, P. Nonuniform alteration of dendritic development in the cerebral cortex following prenatal cocaine exposure. Cereb. Cortex. 6, 431-445 (1996).
- Olney, J. W. Fetal alcohol syndrome at the cellular level. Addict. Biol. 9, 137-149 (2004).
- Levitt, P., Reinoso, B., Jones, L. The critical impact of early cellular environment on neuronal development. Prev. Med. 27, 180-183 (1998).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- O'Rourke, N. A., Dailey, M. E., Smith, S. J., McConnell, S. K. Diverse migratory pathways in the developing cerebral cortex. Science. 258, 299-302 (1992).
- Elias, L. A., Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Gap junction adhesion is necessary for radial migration in the neocortex. Nature. 448, 901-907 (2007).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Muller, U. Reelin regulates cadherin function via Dab1/Rap1 to control neuronal migration and lamination in the neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gotz, M., Bolz, J. Formation and preservation of cortical layers in slice cultures. J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).
- Cameron, R. S., Rakic, P. Identification of membrane proteins that comprise the plasmalemmal junction between migrating neurons and radial glial cells. J Neurosci. 14, 3139-3155 (1994).
- Lizarraga, S. B., Coser, K. R., Sabbagh, M., Morrow, E. M. Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex. J. Vis. Exp. (63), e3621 (2012).
- Jossin, Y., Goffinet, A. M. Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth. Mol. Cell Biol. 27, 7113-7124 (2007).
- Jossin, Y., Ogawa, M., Metin, C., Tissir, F., Goffinet, A. M. Inhibition of SRC family kinases and non-classical protein kinases C induce a reeler-like malformation of cortical plate development. J. Neurosci. 23, 9953-9959 (2003).
- Kingsbury, M. A., Rehen, S. K., Contos, J. J., Higgins, C. M., Chun, J. Non-proliferative effects of lysophosphatidic acid enhance cortical growth and folding. Nat. Neurosci. 6, 1292-1299 (2003).
- Rehen, S. K., et al. A new method of embryonic culture for assessing global changes in brain organization. J. Neurosci. Methods. 158, 100-108 (2006).
- Jossin, Y., et al. The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 24, 514-521 (2004).
- O'Dell, R. S., et al. Layer 6 cortical neurons require Reelin-Dab1 signaling for cellular orientation, Golgi deployment, and directed neurite growth into the marginal zone. Neural. Dev. 7, 25 (2012).
- Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ethanol-induced disruption of Golgi apparatus morphology, primary neurite number and cellular orientation in developing cortical neurons. Alcohol. , (2012).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 16-22 (2004).
- Suter, B., Nowakowski, R. S., Bhide, P. G., Caviness, V. S. Navigating neocortical neurogenesis and neuronal specification: a positional information system encoded by neurogenetic gradients. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of The Society for Neuroscience. 27, 10777-10784 (2007).
- Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J. Neurosci. 25, 247-251 (2005).
- Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45, 208-217 (2007).
- Pearlman, A. L., Sheppard, A. M. Extracellular matrix in early cortical development. Prog. Brain Res. 108, 117-134 (1996).
- Milev, P., et al. Differential regulation of expression of hyaluronan-binding proteoglycans in developing brain: aggrecan, versican, neurocan, and brevican. Biochemical and Biophysical Research Communications. 247, 207-212 (1998).
- Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 16021-16026 (2008).
- McKenna, W. L., et al. Tbr1 and Fezf2 regulate alternate corticofugal neuronal identities during neocortical development. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 549-564 (2011).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J. Neurosci. 30, 7028-7036 (2010).
- Powrozek, T. A., Zhou, F. C. Effects of prenatal alcohol exposure on the development of the vibrissal somatosensory cortical barrel network. Brain Res. Dev. Brain Res. 155, 135-146 (2005).
- O'Dell, R., et al. Society for Neuroscience. , Washington D.C. (2011).
- Tombol, T., Hajdu, F., Somogyi, G. Identification of the Golgi picture of the layer VI cortic-geniculate projection neurons. Experimental Brain Research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation Cerebrale. 24, 107-110 (1975).
- Brumberg, J. C., Hamzei-Sichani, F., Yuste, R. Morphological and physiological characterization of layer VI corticofugal neurons of mouse primary visual cortex. Journal of Neurophysiology. 89, 2854-2867 (2003).
- Jones, E. G. Synchrony in the interconnected circuitry of the thalamus and cerebral cortex. Annals of the New York Academy of Sciences. 1157, 10-23 (2009).
- Kowalczyk, T., et al. Intermediate Neuronal Progenitors (Basal Progenitors) Produce Pyramidal-Projection Neurons for All Layers of Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. , (2009).
- Konig, N., Roch, G., Marty, R. The onset of synaptogenesis in rat temporal cortex. Anatomy and Embryology. 148, 73-87 (1975).
