Summary
Detta protokoll beskriver en förbättrad explantat förfarande som innebär
Abstract
Kortikal utveckling handlar komplexa interaktioner mellan nervceller och icke-neuronala element inklusive prekursorceller, blodkärl, hjärnhinnor och tillhörande extracellulär matrix. Eftersom de ger en lämplig organotypisk miljö, kortikala skiva explantaten ofta används för att undersöka interaktioner som styr neuronal differentiering och utveckling. Även välgörande, kan skivan explantat modell lider nackdelar inklusive avvikande cellulära laminering och migration. Här rapporterar vi ett helt cerebral-system halvklotet explantat för studier av tidig kortikal utveckling som är lättare att förbereda än kortikala skivor och visar konsekvent organotypisk migration och laminering. I detta modellsystem, tidig laminering och migrationsmönster fortsätta normalt för en period av två dagar in vitro, inräknat preplate delning, under vilken blivande kortikal lager sex former. Vi utvecklade då en ex utero elektroporering (EUEP)strategi som uppnår ~ 80% framgång i att rikta GFP uttryck för nervceller utvecklas i den dorsala mediala cortex.
Hela halvklotet explantat modellen gör tidig kortikal utveckling tillgänglig för elektroporering, farmakologisk behandling och levande metoder avbildning. Denna metod undviker överlevnad kirurgi krävs av i livmodern elektroporering (IUEP) tillvägagångssätt och samtidigt förbättra både transfektion och areal inriktning konsistens. Denna metod kommer att underlätta experimentella studier av neuronala tillväxt, migration och differentiering.
Introduction
De däggdjur hjärnbarken former genom samordnade tillväxt, migration och differentiering av successivt genererade neuroner. Varje neuron är född i den ventrikulära zonen (VZ) och migrerar från VZ in den mellanliggande zonen (IZ), som bildar den kortikala plattan (CP) 1. När de passerar genom olika kortikala områden, de migrerande nervceller uppvisar flera former av migration 2,3 som är beroende av den extracellulära miljön och andra cellulära element (t.ex. radial Glia) inom utveckling vävnaden. Kortikala neuroner arrestera sedan migration på toppen av formande kortikala plattan i de sammanfallande processer för neuronal migrering och gripande dendritogenesis 4.
Kortikal utveckling initieras mellan embryonala dagar 11-13 (E11-13) 5 genom etablering av ursprungliga plexiform lagret 6 eller preplate (PP), ett lager av pionjär nervceller som ligger över VZ. Blivandelager 6 kortikala neuroner (dvs. de första kortikala neuron födda i VZ) sedan inrikta sin somata i en stereotyp mönster och smälter samman till ett distinkt skikt i PP 7. Dessa händelser dela preplate i en ytlig marginell (framtida kortikal lager 1) och en djup zon, den senare består av plattmontering celler (övergående kortikal lager 7). Denna process, som kallas preplate delning, är en grundläggande händelse i framtida tillväxt av hjärnbarken 8.
Många genetiska mutationer har identifierats som stör olika aspekter av kortikal utveckling 9. Kortikal utveckling kan också påverkas negativt av exponering för intagna toxiner som kokain 10 och alkohol 11. Eftersom kortikala missbildningar som uppstår under utvecklingen är sannolikt bidrar till neurologiska sjukdomar (t.ex. autism, schizofreni), empiriska undersökningar av störningar till kortikalt utveckling är inneboendely viktigt. Det är därför av stor betydelse för att fastställa metoder för att studera kortikal utveckling som tillåter snabba analyser av genetiska eller toxin effekter men som också bevarar de möjliga interaktioner mellan differentiering nervceller, andra celltyper och extracellulär matrix (ECM) under denna tidiga period av hjärnans utveckling 12 .
Slice explantat 13 har tillhandahållit ett sådant system och har ofta använts för att analysera kortikal neuron utveckling 14-16. Emellertid kan slice analyser har den nackdelen att den neuronala migration och laminering kan vara onormal 17 möjligen på grund av skador på de meningeala celler som omger den växande hjärnan och förankra radiella gliaceller ställningen. Som radiella gliaceller fibrer är en viktig substrat för kortikal neuron migration 18 avbrott i basala lamina genom skärning kan lokalt störa radiell glia arkitektur och leda till förändrad kortikal migration. Dessutom SLICED ytor explantat tillhandahåller ett område av döda celler som kan ändra den normala sammansättningen av ECM i dessa områden.
Nyare försök har fokuserat sin analys på celler belägna djupt i segment som är omgivna av lämpliga friska celltyper och ECM. I vissa fall kan dessa nyare metoder kan kräva att den ursprungliga tjocka odlade skiva vara kryo-delad eller paraffin-delad efter fixering så att den relativt normal inre skivan görs tillgänglig för analys 19-21. Både den ursprungliga vibratome sektionering att förbereda levande segment för kultur samt den efterföljande cryosectioning fasta skivor för analys kräver vård och ansträngning för dessa analyser ska fungera.
För att ge en enkel, kompletterande strategi för studier av tidig kortikal utveckling har vi ändrat en befintlig skiva närmar 13 för att underlätta studier av tidig kortikal utveckling. Vi har utvecklat en whOle halvklotet explantat modell som liknar en befintlig E14 hela hemisfären modell som involverade skakar kulturer vid 65 varv per minut och får organotypisk tillväxt för 16-18 timmar 22,23. I vår metod, är hela hemisfären explantat placerades på semipermeabelt membran 13 med i en hög syre-kultur atmosfär 21,24 att sträcka organotypisk kortikal tillväxt under 48 timmar. Detta tillvägagångssätt möjliggör också konsekvent elektroporering utveckla kortikalneuroner. Embryona avlägsnas från livmodern och elektroporerades att introducera plasmid-DNA och telencefalon därefter dissekeras. Varje hemisfär isoleras och placeras mediala sidan nedåt på en kollagen-belagda filtret. Explantatet odlas sedan under en period av 48 timmar, en period som omfattar preplate uppdelning 8. Under kultur perioden L6 neuroner utvecklas från prekursor till differentierade neuron 25, rätt positionerad i kortikala plattan. Under hela denna period utvecklingsländernaneuron omges av lämplig ECM och celltyper som skulle möta motsvarande cell in vivo. Detta system har redan visat sig värdefulla i att dechiffrera de cellulära händelser som ligger till grund för etanol toxicitet 26, skikt 6 bildning och preplate dela 7,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ex utero-elektroporeringar med grönt fluorescerande protein expressionsplasmid
- Plasmid DNA injektionslösningar bereds med CAG-EGFP-DNA 27 späddes till den slutliga bearbetning koncentrationen 0,33 mg / ml i DDH 2 O. Qiagen Endo-Free Maxi-Preps används för att rena plasmiden från transformerade bakterier. Snabb grönt färgämne på ~ 0,02% (vikt / volym slutlig) sättes till DNA-lösningen som en injektion spårämne.
- För att förbereda operationsområdet, spraya ner bänk och dissekera mikroskop scenen med en 70% etanollösning och torka torrt. Spraya kirurgiska sax och pincett med 70% etanol före dissektion och torka torrt.
- Tidsinställda Gravida schweiziska / Webster dammar offras på E13 genom överföring till en kammare fylld med CO 2 från en trycksatt cylinder och dammen övervakas tills all rörelse har stannat i minst 1 minut. Efter avlivning av CO 2 inhalering embryona avlägsnas från livmodern och placeras ien 10 cm petriskål innehållande iskall Hanks balanserade saltlösning (HBSS).
- Försiktigt dissekera varje embryo från omgivande extraembryonic membranen och hålla iskalla HBSS.
- Överför varje embryo individuellt till en andra 10 cm petriskål innehållande kall HBSS. Använd en Hamilton spruta för att injicera 2-3 il av DNA snabbt gröna blandningen i kammaren den vänstra hjärnhalva, var noga med att injicera i en kortikal område rumsligt skild från den kortikala område för framtida analys.
- Att elektroporera håller embryot försiktigt med pincett och lätt placera positiva paddeln av pincettdelen elektroden på den dorsala mittlinjen på huvudet och lätt placera negativa paddeln under embryot hakan. Elektroporeringar uppnås med en BTX830 elektroporator programmerad att leverera fem 30 V pulser med 50 msek varaktighet, åtskilda av 950 ms intervall. Dessa inställningar är för BTX830 modellen. Andra system kan användas enligt tillverkarens ANVISNINGAns.
2. Hela halvklotet Explantation Förberedelser
- Efter elektroporering embryona placeras tillbaka i is-kall HBSS. Hjärnan tas bort med hjälp av två # 5 juvelerare pincett för att ta bort hud och brosk skallen från embryot huvudet. En tång skjuts sedan under hjärnan att avlägsna intakta hjärnan från skallen. De elektroporerade hemisfären (vänster) därefter dissekerades bort från hjärnan och bifogade mitten hjärnvävnad avlägsnas. Under hela dissektion proceduren försiktighet iakttas för att inte skada meningerna överliggande vänster kortikala halvklotet.
- När dissekerade varje embryo överförs i HBSS med en pipett med ett snitt 1 ml pipettspets. Den halvklotet försiktigt utvisas på en kollagen belagt kultur insats. Upp till sex halvklotet explantaten arrangerade mediala sidan nedåt på varje 24 mm insats. När arrangerade, överskott HBSS avlägsnas från insatsen och insatsen placeras sedan i en 35 mm brunn av en 6 brunnsskål. Brunnen innehåller EXActly 2,7 ml medium: DMEM-F12-medium innehållande Glutamax och kompletterat med 2% B-27, 1% G5 och 1% penicillin-Strep. Några droppar av mediet från brunnen kan pipetteras ovanpå varje explantat, men inte lägga till media som överstiger den ursprungliga 2,7 ml per brunn.
- När explantaten har placerats på Kollagen filtrerar 6 väl skål innehållande explantaten placeras i en Billups Rothenberg (BR) kammare (som också innehåller en fuktande maträtt vatten). En 95% / 5% syre / koldioxid 2 gasblandningen infunderas i kammaren under minst 1 minut innan täta kammaren stängd och koppla bort 95% / 5% syre / koldioxid 2 rör gasförsörjning. BR Kammaren placeras sedan i en 37 ° C vävnadsodlingsinkubator under återstoden av odlingsperioden, 1-2 DIV.
3. Fixering av explantvävnaden för histologi
- I ett dragskåp bereda Pagano fixeringslösning genom att först solubiliserande 8 g paraformaldehyd i 100 ml förvärmd (~ 80 & deg, C) DDH 2 O. Lägg 1-3 droppar koncentrerad NaOH för att främja solubilisering och försiktigt röra. När solubiliserade blanda 8% paraformaldehydlösning 1:1 med en lösning som är 500 mM sackaros, 100 mM Hepes, pH 7,4, 50 mM MgClj 2, 5 mM KCl för en slutlig koncentration av 4% paraformaldehyd i 250 50 mM sackaros mM Hepes , 25 mM MgClz 2, 2,5 mM KCl, pH 7,4.
- För att fixa explantaten värma Pagano fixa lösningen till 37 ° C. Snabbt ta bort de flesta av de DMEM/F12 mediet från varje odlingsbrunn och tillsätt 5 ml Pagano Fix till varje brunn av explantat. Se till att täcka varje explantat helt fix. Fix under 1 timme vid RT. Ta inte bort explantat från filtret före den 1 timme för fastsättning.
- Efter fixering bort Pagano fixa lösningen och ersätta med Pagano lösning utan fix (250 mM sackaros 50 mM Hepes, 25 mM MgClz, 2 2,5 mM KCl, pH 7,4). Tillsätt några droppar 10% natriumazid och förvara vid 4 ° C tills inbäddning.
4. Inbäddning och Sectioning för histologi
- Bered en 10% kalvskinn gelatinlösning genom solubilisering 10 g kalvskinn gelatin i 100 ml varmt vatten (55-60 ° C). Placera gelatinlösning på en varm platta inställd på 60 ° C och snurra periodiskt tills solubiliseras.
- Häll ca 10 ml av den 10% gelatinlösning i botten av en 10 cm petriskål och tillåta 30 minuter för att stelna. Detta kommer att utgöra en "pad" för inbäddning explantaten. Dessa dynor kan framställas dagar i förväg och lagrades vid 4 ° C. Använd en linjal för att rita ett rutnät på botten av petriskålen och överföra individuella explantat i varje låda nätet. Avlägsna kvarvarande Pagano lösning och med en pipett, täcker varje explantat med varmt 10% gelatinlösning och låt stelna. Återuppta långsam tillsättning av gelatinlösning tills varje explantat är helt omgiven av gelatin, noga med att inte smälta kudden genom tillsats av för mycket varm gelatin på en gång. Tillåt för gelatinet att hårdna under ~ 1 timme. När härdat individella explantat kan skäras i små block av gelatin. Blocken sedan lägga-fast i Pagano fixa till 24-48 timmar innan snittning med vibratome.
- Explantat i gelatin block är placerade luktloben upp och sektionerades i frontalplanet vid 100 um tjocklek. Sektionerna uppsamlas och lagras i PBS + 0,1% natriumazid vid 4 ° C tills immunohistokemisk bearbetning.
- Immunhistokemisk detektering utförs genom överföring av sektioner i en 24 brunnars platta (2-3 sektioner per brunn). Första blocket icke-specifik antikroppsbindning genom att tillsätta 0,5 ml PBST + B (PBS + 0,5% Triton X 100 och 2% BSA) till varje brunn, inkubera 1 timme med varsam skakning. Den lämpliga primära antikroppen späds sedan i PBST + B och 0,4 ml per brunn tillsätts för inkubering över natten vid RT. Den primära tvättas ut med 3X PBS tvättar minst 10 minuter vardera. Den sekundära antikroppen och 2 pg / ml Hoechst 33342 nukleär färgning därefter späds i PBST + B och proverna inkuberas under 2 timmar vid RTmed varsam skakning. Tre tvättar PBS (10 minuter vardera) utförs och därefter sektionerna är monterade på objektglas med användning av en 90% glycerol 50 mM Tris, pH 7,4, monteringsmedia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den embryonala gnagare cortex uppvisar en tvärgående neurogenetiska lutning under hela utvecklingsarbetet perioden, är sådan att laterala neocortex cirka 1 dag mognare än dorsal mediala neocortex 28. Huvuddelen av skiktet 6 neuroner således genereras (dvs. uppvisar sin slutliga S-fas) på E12 i laterala cortex (även kallad fält 40 5) och vid E13 i den dorsala mediala kortex (även kallad fält 1 5). Preplate delning börjar ca 1 dag efter lager 6 neuron generation och därmed initieras i den laterala cortex på E13 och den dorsala cortex på E14. Att studera preplate delning och initiering av kortikala plattan utveckling, modifierad vi en analys skiva explantation 21,24 så att hela hjärnhalvorna odlades vanligen från E13 till E15 (figur 1).
Vi testade livskraft kortikala explantatet tekniken genom att undersöka tillväxten av hela halvklotet explantat derived från TG (Eomes :: EGFP) gsat möss (Figur 2). Denna musstam innehåller en transgen som rapporterar omogna nervceller i excitatoriska kortikala härstamning 7,29,30. Hela halvklotet kortikala explantat framställdes vid E13, vid en tidpunkt före preplate uppdelning i den dorsala neocortex (figur 2A). Kortikala explantat från samma kull var droppe fixerades sekventiellt under en period av 2 DIV och bearbetades för efterföljande histologisk analys. Vid den inledande analysen tidpunkt (DIV 0), har preplate uppdelning ännu inte skett i fält 1 (Dorsal neocortex, figurerna 2A, 2E). Med 1 DIV CP framgår (figur 2B, 2C, 2F, 2G), och det fortsätter att växa upp till 2 DIV (figur 2d, 2H). Därmed hela halvklotet explantaten odlas initialt vid E13 stöd för två dagar mognaden av hjärnbarken och fångar preplate dela i rygg neocortex.
För att bekräfta normenal histologisk utveckling i rygg neocortex, immunofärgades vi 2 DIV explantat för kondroitinsulfat proteoglykaner (CSPGs), en extracellulär matrix komponenter som också är en etablerad markör för PP och dess derivat MZ och SP 8,31,32. Immunfärgning för CSPGs avslöjar två band av CSPG immunoreaktivitet i den dorsala cortex indikerar lämplig uppdelning av PP till MZ och SP under odling in vitro under (figurerna 3A-3C). PP delas av L6 kortikala nervceller som är kända för att uttrycka transkriptionsfaktorerna Ctip2 och Tbr1 7,33,34. Den immunfärgning mönstret i dessa markörer (figur 3D-3F, 3G-I respektive) bekräftar lämpligt sätt att uttrycka dessa transkriptionsfaktorer i det nybildade CP. Tillsammans dessa analyser bekräftar organotypisk tidig kortikal utveckling i hela halvklotet explantaten.
In utero elektroporeringar har använts i stor utsträckningatt analysera celler självständig genfunktion i utvecklingsländerna kortex 35. Vi testade därför om elektroporation framgångsrikt kunde transfektera nervceller i hela hemisfären explantat modell. Den vänstra ventrikeln av intakta E13 embryon injicerades med 0,33 mg / ml CAG-GFP-plasmiden och elektroporerades (se Metoder) att införa plasmid-DNA i de neuronala prekursorer som linje den laterala ventrikeln (Figur 1A). Efter 2 DIV explantaten tappades fast och sektionerades för histologisk analys. Vid denna tidpunkt, var GFP-uttryckande celler observerades i alla kortikala zoner över den cerebrala väggen (fig. 4A-4C). GFP-uttryck kunde observeras från neuronala prekursorer i VZ medan intensiva GFP uttryckande celler observerades i IZ och CP. Viktigare, har ett stort antal GFP + neuroner observeras vid toppen av den formande KP med nya dendriter och axoner. Cellerna har bildat ett diskret skikt vid gränsytan mellan CP och MZ indicating lämplig övergångsstrategi gripande och laminering (figurerna 4A-4C, pilar). Dendriterna utvidgats till MZ medan corticofugal axoner sträcker sig under CP och till IZ (figurerna 4A-4C och 5, Se även Kompletterande Movie S1). Nedanför differentierande cellerna GFP + celler i olika tillstånd av mognad, inklusive nervceller med en bipolär morfologi, sida vid sida med radiella gliaceller fibrer och nedanför dem, flerpoliga neuron i IZ (figur 4D-4F). Dessutom är dendriterna observeras sträcker sig in i MZ där ECM-proteinet Reelin är lämpligt immunolocalized (figurerna 4G-4I). De elektroporering och explantation förhållandena tillåter alltså normal utveckling av kortikala neuroner genom de olika stadierna i föregångare till migrera neuron till omogna differentierande neuron.
Vid tidpunkten för elektroporering (E13) 100% av neuronerna som produceras av de dorsala hjärnbarkens VZ är L6 neuroner, nervcellersom delar PP 5. Framgångsrik elektroporering kräver att konstruktioner införs i neuroner under 6 h omedelbart före, eller under, M-fas av cellcykeln 36. Det förväntas därför att den tidigaste postmitotiska, GFP + neuroner efter E13 elektroporering i rygg cortex (fält 1) bör fylla den formande CP. Sådana neuroner observerades (figur 4) som anger att protokollet tillförlitligt kan rikta L6 kortikalneuroner för studier av deras migration och mognad.
För att uppskatta "success rate" på elektroporering / explantatet förfarande analyserade vi en pågående utredning från vårt laboratorium. Under denna studie har 21 kullar explantat utarbetats, totalt 248 embryon elektroporerades (som beskrivet ovan) med CAG-GFP, och en enda halvklotet explantat från varje embryo framställdes. Av de ursprungliga 248 explantaten var 195 (79%) bedömdes lämplig för avbildning och analys. Ungefär hälften av de 53explantat som inte kunde analyseras inte uttrycka GFP eller hade mis-riktad GFP uttryck. De återstående förlusterna förklaras av dysmorphic tillväxt på grund av explantera lossnar från kultur filtret eller problem i samband med histologisk bearbetning. Denna framgång på cirka 80% (Figur 5) har gjort explantatet lämpligt för farmakologiska studier 26, samt analys av recessiva mutationer 7 som negativt påverkar tidig kortikal utveckling.
Figur 1. Hel halvklotet explantat förfarande med ex utero elektroporering. A) E13 musembryon injiceras med en plasmid-DNA-lösning och elektroporerades. Hjärnorna dissekerades och transekterades sagitally. De elektroporeradehalvklotet placeras sedan mediala sidan nedåt på en kollagen belagda filtret och odlades under 2 DIV. De hemisfärerna kan sedan avbildas levande eller fixerad för histologi och efterföljande bildanalys. B) En bild av 10 explantat placerade på tre filter i en sex väl vävnadsodlingsplatta. C) sex väl skålen med explantat placeras i en hög syremiljö (95% O 2/5% CO 2) inom en Billups-Rothenberg Inkubator kammare, som sedan placeras i en standard 37 ° C vävnadsodlingsinkubator.
Figur 2. Organotypisk tillväxt kortikala plattan i hela halvklotet explantaten härledda från en enda kull Eomes :: EGFP embryon. A, E) En koronalt avsnitt från en drop-fixerad hjärna i början av kulten ure perioden (O DIV). Observera att PP är närvarande men att CP har ännu inte bildas. Den gröna signalen producerad av GFP-uttryck i omogna excitatoriska neuroner och blått är Hoechst färgämne som märker kärnan i alla celler.. B, F) CP tillväxt, betecknad med streckade linjer, observeras med 0,5 DIV och ökar med 1 DIV (C och G) och 2 DIV (panelerna D och H). Notera den ökade tjockleken av GFP uttryckande cell domän i paneler AD, visar proliferationen och differentiering av den excitatoriska neuroner härstamning i explantatet. Scale bar är 500 ^ m (panel A) och 50 nm (panel H). Förkortningar: CP, kortikala plattan, IZ, mellanliggande zon, MZ, Marginell zon, SP, plattmontering, VZ, ventrikulär zon.
/ 50271/50271fig3.jpg "/>
Figur 3. Preplate dela i hela halvklotet explantaten. AC) Kondroitinsulfat proteoglykan (CSPG) immunfärgning illustrerar uppdelningen (uppdelning) av PP i MZ och SP. DF) Redovisning av transkriptionsfaktor Ctip2 i den nybildade CP. GI) Redovisning av transkriptionsfaktor Tbr1 i den nybildade CP. Skala barer är 50 um i paneler C, F, I.
Figur 4. GFP uttryck i hela halvklotet explantaten efter E13 ex utero elektroporering. AC) GFP uttryck efter 2 DIV. Notera skiktet av kortikala neuroner som bildar vid toppen av KP (pilar). DF) nestin (röd) immunoreactivhet i ett avsnitt från en hel hemisfär explantation. GH) Reelin (röd) immunoreaktivitet i ett avsnitt som härrör från en hel hemisfär explantation. Skala barer i paneler C, F, och jag är 50 um.
Figur 5. Variabilitet i inriktning ex utero elektroporeringar till rygg mediala cortex (fält 1). Elva embryon från en enda kull elektroporerades med CAG-GFP uttryck konstruktion (0,33 mg / ml) och odlades som hela halvklotet explantat.) AI Nio av elva explantat visade uttryck av GFP i rygg mediala cortex. Även GFP uttryck varierar mellan explantat, är i varje explantat GFP detekterades i alla tre kortikala områden (dvs. VZ, IZ och CP). Skala bar är 50 um i panel A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har förbättrat och utvärderat en experimentell modell - hela halvklotet explantaten - för att studera tidiga kortikal utveckling (E13-E15). Modellen har visat sig användbar för analys av migration och differentiering av den excitatoriska neuron härstamning som utgör lagret 6 av hjärnbarken 25,37. De principiella fördelarna med systemet är 1) organotypisk tillväxt för 2 DIV 2) enkelhet i framställning, och 3) experimentell tillgång till neuroner för elektroporering, farmakologisk manipulation och avbildning under denna tidiga, kritisk period av hjärnans utveckling. Vi har använt systemet för att dokumentera subtila skillnader i morfologi, orientering och dendritisk tillväxt av lager 6 kortikalneuroner 7,38 under perioden preplate delning.
De excitatoriska nervceller som befolkar lagret 6 är till stor del består av corticothalamic projektion nervceller som ger ömsesidig bidrag till dorsala thalamus 39,40 41. Även om dessa nervceller är fysiologiskt specialiserade, produktion, migration och mognad process lager 6 neuroner delar grundläggande funktioner med alla excitatoriska nervceller i lager 2-6 av cortex. Specifikt är alla kortikala excitatoriska nervceller genereras i rygg telencephalic VZ, vandra genom IZ som flerpoliga neuroner, och differentiera inom CP 7. Mognaden av excitatoriska kortikala neuroner drivs av en kärna av sekventiellt uttryckt transkriptionsfaktorer: Pax6, Tbr2 och Tbr1 29. Denna sekvens delas av alla exciterande neuroner i skikt 2-6 42 och vi bekräftade lämpligt uttryck av Tbr1 i det nybildade CP (fig. 3G-3I). Utnyttja denna metod för att undersöka utvecklingen av skiktet 6 kortikalneuroner bör därför ge viktiga insikter i utvecklingen av neuRons som utgör alla kortikala skikt.
Hela halvklotet explantat komplettera befintliga metoder för studier av kortikal neuron utveckling. Tidigare studier har använt en E14 hela tillvägagångssättet halvklotet explantation att studera kortikal utveckling för 1 DIV 22,23. Vi har kopplat hela halvklotet explantat med ex utero elektroporering att utreda 2 dagar av kortikal utveckling under L6 bildning och preplate delning. I motsats till in utero elektroporeringar på E13, är andelen framgångsrika ex utero-elektroporeringar följt av hela halvklot explantation högre: i våra händer vi uppnår ~ 80% framgång i att rikta elektroporering till den dorsala telencephalon. Dessutom, i livmodern elektroporeringar kräver en överlevnad kirurgi och ta betydligt mer teknisk ansträngning än hela hemisfären ex utero strategi. Slutligen, i livmodern studier inte är lätt mottagliga för exakt farmakologiskamanipulationer och metoder avbildning. Exakt temporal kontroll i leverans eller aktivering av läkemedel och molekylära ämnen (expressionsvektorer, ljuddämpning konstruktioner, etc) vid definierade koncentrationer är försedd med hela halvklotet explantaten, men är svårare att uppnå i livmodern. Live optisk övervakning av de resulterande effekterna av sådana manipulationer med rumslig upplösning i mikron, är lätt tillgänglig med EUEP, men inte IUEP. Sådan precision är sannolikt avsevärt förbättra tolkande makt data insamlade från experiment med kortikal utveckling och funktion. Således för studier av tidiga kortikala utveckling hela halvklotet explantat har tydliga experimentella fördelar jämfört med den i livmodern strategi. Vid denna tid, dock för studier av övre skiktet kortikala neuroner och experiment som kräver datainsamling> 48 timmar, explantat skiva och in utero metoder förblir föredra.
Det finns flera kritiska krav för framgång av hela hemisfären explantat teknik. Först, är tillväxten av explantatet mycket känslig för den mekaniska integriteten av meningerna. Fysisk skada på hjärnhinnorna (dvs. punkteringar eller tårar) kommer minst stör den lokala utvecklingen av den underliggande cortex. Andra är explantat tillväxten känslig för den totala volymen av media inom odlingsbrunn: med alltför mycket media explantaten kommer frigöras från filtret och utveckla förvrängd CP arkitektur, med alltför lite media och explantaten sannolikt att dehydratisera och uppleva överdriven celldöd . Slutligen, med nuvarande teknik explantaten vi har dokumenterat kortikal tillväxt för 2 DIV. Vid start på E13 denna utvecklings tidsfönster, även släppa många värdefulla undersökningar, begränsar analyser till en period före synaptogenes och kanoniska neuronal kommunikation. Även om de kortikala neuroner vid E14.5 uttrycker många mRNA kodande synaptiska proteiner (w.genepaint.org "target =" _blank "> www.genepaint.org), börjar synaptogenes inte förrän ~ E15 i sidled cortex, och denna synaptogenes är begränsad till preplate celler snarare än lager 6 nervceller 43. Vissa kritiska frågor om kortikal synaps bildning och funktion är därför för närvarande inte adresserbara med hela hemisfären explantat systemet.
Sammanfattningsvis hela hemisfären explantatet beredning kan användas tillförlitligt och konsekvent för att undersöka tidiga kortikal utveckling i musmodeller av ärftligt hjärnan missbildningar. Tekniken är lätt anpassas till RNAi, shRNA, och andra molekylära och farmakologiska manipulationer. Hela halvklotet explantation är också lämplig för studier tillämpas rekombinant protein, droger och miljögifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes bidrag från NINDS (NS066071) och NIAAA. (P50AA017823) ECO. Författarna tackar Dr Robert Quinn och personalen på avdelningen av försöksdjur resurser för djurvård. Vi tackar Judson Belmont för teknisk support, Nicole Belletier för hjälp som en sommar Grundutbildning Research Fellow (SURF). Vi tackar också Dr David Cameron för kommentarer och ändringar på en tidigare version av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 + GlutaMAX | GIBCO | 10565 | |
| G5 Supplement 100X | Invitrogen | 17503-012 | |
| B27 Serum-Free Suppl. 50X | Invitrogen | 1504-044 | |
| Pen / Strep Liquid 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| HBSS 500 ml | GIBCO | 14025 | |
| Culture insert collagen coated | Costar | 3492 | |
| Bovine skin gelatin | Sigma | G9382 | |
| H–chst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 7906 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Equipment | |||
| BTX 830 Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Tweezer electrodes 10mm | Harvard Apparatus | 450166 | |
| Incubator | Billups Rothenberg | MIC-101 | |
| Hamilton syringe (5uL) | Hamilton | 87930 | |
| Hamilton syringe needle | Hamilton | 7803-04 | Specify 1" and style 4 |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11251-10 | |
| Fine Scissors Tough Cut 9 cm | FST | 14058-09 |
References
- Rakic, P. Principles of neural cell migration. Experientia. 46, 882-891 (1990).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J. Neurosci. 23, 9996-10001 (2003).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. , (2004).
- Olson, E. C., Kim, S., Walsh, C. A. Impaired neuronal positioning and dendritogenesis in the neocortex after cell-autonomous Dab1 suppression. J. Neurosci. 26, 1767-1775 (2006).
- Takahashi, T., Goto, T., Miyama, S., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Sequence of neuron origin and neocortical laminar fate: relation to cell cycle of origin in the developing murine cerebral wall. J. Neurosci. 19, 10357-10371 (1999).
- Marin-Padilla, M. Early prenatal ontogenesis of the cerebral cortex (neocortex) of the cat (Felis domestica). A Golgi study. I. The primordial neocortical organization. Z. Anat. Entwicklungsgesch. 134, 117-145 (1971).
- Nichols, A. J., Olson, E. C. Reelin promotes neuronal orientation and dendritogenesis during preplate splitting. Cerebral Cortex. 20, 2213-2223 (2010).
- Sheppard, A. M., Pearlman, A. L. Abnormal reorganization of preplate neurons and their associated extracellular matrix: an early manifestation of altered neocortical development in the reeler mutant mouse. J. Comp. Neurol. 378, 173-179 (1997).
- Manzini, M. C., Walsh, C. A. What disorders of cortical development tell us about the cortex: one plus one does not always make two. Current Opinion in Genetics & Development. 21, 333-339 (2011).
- Jones, L., Fischer, I., Levitt, P. Nonuniform alteration of dendritic development in the cerebral cortex following prenatal cocaine exposure. Cereb. Cortex. 6, 431-445 (1996).
- Olney, J. W. Fetal alcohol syndrome at the cellular level. Addict. Biol. 9, 137-149 (2004).
- Levitt, P., Reinoso, B., Jones, L. The critical impact of early cellular environment on neuronal development. Prev. Med. 27, 180-183 (1998).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- O'Rourke, N. A., Dailey, M. E., Smith, S. J., McConnell, S. K. Diverse migratory pathways in the developing cerebral cortex. Science. 258, 299-302 (1992).
- Elias, L. A., Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Gap junction adhesion is necessary for radial migration in the neocortex. Nature. 448, 901-907 (2007).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Muller, U. Reelin regulates cadherin function via Dab1/Rap1 to control neuronal migration and lamination in the neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gotz, M., Bolz, J. Formation and preservation of cortical layers in slice cultures. J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).
- Cameron, R. S., Rakic, P. Identification of membrane proteins that comprise the plasmalemmal junction between migrating neurons and radial glial cells. J Neurosci. 14, 3139-3155 (1994).
- Lizarraga, S. B., Coser, K. R., Sabbagh, M., Morrow, E. M. Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex. J. Vis. Exp. (63), e3621 (2012).
- Jossin, Y., Goffinet, A. M. Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth. Mol. Cell Biol. 27, 7113-7124 (2007).
- Jossin, Y., Ogawa, M., Metin, C., Tissir, F., Goffinet, A. M. Inhibition of SRC family kinases and non-classical protein kinases C induce a reeler-like malformation of cortical plate development. J. Neurosci. 23, 9953-9959 (2003).
- Kingsbury, M. A., Rehen, S. K., Contos, J. J., Higgins, C. M., Chun, J. Non-proliferative effects of lysophosphatidic acid enhance cortical growth and folding. Nat. Neurosci. 6, 1292-1299 (2003).
- Rehen, S. K., et al. A new method of embryonic culture for assessing global changes in brain organization. J. Neurosci. Methods. 158, 100-108 (2006).
- Jossin, Y., et al. The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 24, 514-521 (2004).
- O'Dell, R. S., et al. Layer 6 cortical neurons require Reelin-Dab1 signaling for cellular orientation, Golgi deployment, and directed neurite growth into the marginal zone. Neural. Dev. 7, 25 (2012).
- Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ethanol-induced disruption of Golgi apparatus morphology, primary neurite number and cellular orientation in developing cortical neurons. Alcohol. , (2012).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 16-22 (2004).
- Suter, B., Nowakowski, R. S., Bhide, P. G., Caviness, V. S. Navigating neocortical neurogenesis and neuronal specification: a positional information system encoded by neurogenetic gradients. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of The Society for Neuroscience. 27, 10777-10784 (2007).
- Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J. Neurosci. 25, 247-251 (2005).
- Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45, 208-217 (2007).
- Pearlman, A. L., Sheppard, A. M. Extracellular matrix in early cortical development. Prog. Brain Res. 108, 117-134 (1996).
- Milev, P., et al. Differential regulation of expression of hyaluronan-binding proteoglycans in developing brain: aggrecan, versican, neurocan, and brevican. Biochemical and Biophysical Research Communications. 247, 207-212 (1998).
- Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 16021-16026 (2008).
- McKenna, W. L., et al. Tbr1 and Fezf2 regulate alternate corticofugal neuronal identities during neocortical development. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 549-564 (2011).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J. Neurosci. 30, 7028-7036 (2010).
- Powrozek, T. A., Zhou, F. C. Effects of prenatal alcohol exposure on the development of the vibrissal somatosensory cortical barrel network. Brain Res. Dev. Brain Res. 155, 135-146 (2005).
- O'Dell, R., et al. Society for Neuroscience. , Washington D.C. (2011).
- Tombol, T., Hajdu, F., Somogyi, G. Identification of the Golgi picture of the layer VI cortic-geniculate projection neurons. Experimental Brain Research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation Cerebrale. 24, 107-110 (1975).
- Brumberg, J. C., Hamzei-Sichani, F., Yuste, R. Morphological and physiological characterization of layer VI corticofugal neurons of mouse primary visual cortex. Journal of Neurophysiology. 89, 2854-2867 (2003).
- Jones, E. G. Synchrony in the interconnected circuitry of the thalamus and cerebral cortex. Annals of the New York Academy of Sciences. 1157, 10-23 (2009).
- Kowalczyk, T., et al. Intermediate Neuronal Progenitors (Basal Progenitors) Produce Pyramidal-Projection Neurons for All Layers of Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. , (2009).
- Konig, N., Roch, G., Marty, R. The onset of synaptogenesis in rat temporal cortex. Anatomy and Embryology. 148, 73-87 (1975).
