Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Explantat Verfahren, das umfasst
Abstract
Kortikalen Entwicklung beinhaltet komplexe Interaktionen zwischen Neuronen und nicht-neuronalen Elemente, einschließlich Vorläuferzellen, Blutgefäße, Hirnhäute und die damit verbundenen extrazellulären Matrix. Weil sie eine geeignete organotypischen Umfeld zu schaffen, sind kortikale Schicht Explantate oft verwendet, um die Wechselwirkungen, die neuronale Differenzierung und Entwicklung steuern zu untersuchen. Obwohl von Vorteil, kann die Scheibe Explantat-Modell von Nachteilen einschließlich aberrante zelluläre Laminieren und Migration leiden. Hier berichten wir über eine ganze Gehirnhälfte Explantat für Studien der frühen kortikalen Entwicklung, die einfacher herzustellen als kortikale Scheiben und zeigt konsistente organotypischen Migration und Laminierung. In diesem Modellsystem, frühe Laminierung und Migrationsmuster der Regel über eine Zeitspanne von zwei Tagen in vitro, einschließlich der Dauer der Vorbeschichtungszyklus Splitting, bei denen Interessenten Rindenschicht sechs Formen. Wir entwickelten eine ex utero Elektroporation (EUEP)Ansatz, ~ 80% Erfolg bei der Ausrichtung der GFP-Expression zu Neuronen entwickeln im dorsalen medialen Kortikalis erreicht.
Die ganze Hemisphäre Explantat Modell macht frühen kortikalen Entwicklung zugänglich für die Elektroporation, pharmakologische Intervention und Live-Bildgebung. Dieses Verfahren vermeidet die Überlebensrate Chirurgie in utero Elektroporation (IUEP) erforderlich ist, während Ansätze Verbesserung sowohl Transfektion und Flächendichte Targeting Konsistenz. Dieses Verfahren erleichtert experimentelle Untersuchungen von neuronalen Proliferation, Migration und Differenzierung.
Introduction
Die Säugerzellen Großhirnrinde Formen durch den abgestimmten Proliferation, Migration und Differenzierung von nacheinander erzeugten Neuronen. Jedes Neuron in der ventrikulären Zone (VZ) geboren und wandert von der VZ in die Zwischenzone (IZ), Bilden des kortikalen Platte (CP) ein. Als sie durch die verschiedenen kortikalen Bereichen passieren, zeigen die Migration Neuronen mehrere Modi der Migration 2,3, die auf die extrazelluläre Umgebung und andere zelluläre Elemente (zB radiale Gliazellen) innerhalb des sich entwickelnden Gewebes ab. Kortikalen Neuronen dann verhaften Migration an der Spitze der bildenden kortikalen Platte in den zusammenfallenden Prozesse der neuronalen Migration Verhaftung und dendritogenesis 4.
Kortikalen Entwicklung zwischen embryonalen Tag 11-13 (E11-13) 5 durch die Einrichtung des Ur plexiformen Schicht 6 oder Vorbeschichtungszyklus (PP), eine Schicht des Pioniers Neuronen, die über der VZ eingeleitet. ProspektivSchicht 6 kortikalen Neuronen (dh die ersten kortikalen Neuronen im VZ geboren), dann orientieren ihre Somata in einem stereotypen Muster und verbinden sich zu einer deutlichen Schicht innerhalb des PP 7. Diese Ereignisse spaltete die Vorbeschichtungszyklus in eine oberflächliche marginal (zukünftige kortikale Schicht 1) und einer tiefen Zone, die letztere Plattenaufbau Zellen (transiente kortikale Schicht 7) zusammen. Dieser Vorgang, genannt Vorbeschichtungszyklus Spaltung, ist ein grundlegendes Ereignis in der Zukunft Wachstum der Großhirnrinde 8.
Viele genetische Mutationen identifiziert worden, die stören, die verschiedenen Aspekte der kortikalen Entwicklung 9. Kortikalen Entwicklung kann sich auch negativ durch die Exposition gegenüber aufgenommenen Gifte wie Kokain 10 und Alkohol 11 beeinflusst werden. Da kortikalen Fehlbildungen, die während der Entwicklung entstehen wahrscheinlich Beitragszahler neurologischen Erkrankungen (zB Autismus, Schizophrenie), sind empirische Untersuchungen von Störungen auf kortikalen Entwicklung inhärentenders wichtig. Es ist daher von großer Bedeutung, um Ansätze zu etablieren, um kortikalen Entwicklung, die eine schnelle Tests von genetischen oder Toxin Effekte erlauben die aber auch die Erhaltung der möglichen Wechselwirkungen zwischen differenzierenden Neuronen, andere Zelltypen und der extrazellulären Matrix (ECM) in dieser frühen Phase der Entwicklung des Gehirns 12 studierst .
Scheibe Explantate 13 haben ein solches System zur Verfügung gestellt und sind weit Assay kortikalen Neuronen Entwicklung 14-16 verwendet. Allerdings kann Slice Assays unter dem Nachteil, dass neuronale Migration und Laminierung kann als abnormal 17 möglicherweise durch die Zellen, die den meningealen entwickelnden Gehirns und der radiale Anker glialen Stützgerüst umgeben beschädigen leiden. Als radiale Gliafasern ein wichtiger Substrat für kortikale Neuronen Migration 18 Störung der Basallamina durch Schneiden sind lokal zu stören radialen Gliazellen Architektur und führen zu veränderten kortikalen Migration. Neben der SLIced Oberflächen Explantate stellt einen Bereich aus toten Zellen, die den normalen Zusammensetzung der ECM in diesen Bereichen verändert werden kann.
Neuere Ansätze haben ihre Analyse auf Zellen tief in der Scheibe, die durch geeignete gesunde Zelltypen und ECM umgeben befinden konzentriert. Jedoch kann in einigen Fällen diese neueren Ansätze können erfordern, dass die ursprüngliche Dicke kultivierten Slice Kryo-oder Paraffin-Schnitt geschnitten werden nach Fixierung, so daß die relativ normal Inneren der Scheibe zur Verfügung gestellt wird zur Analyse 19-21. Sowohl der ursprüngliche Vibratom Schneiden, um die Live-Scheiben für Kultur sowie der anschließenden Kryoschneiden von festen Scheiben für die Analyse vorzubereiten erfordern Sorgfalt und Mühe für diese Assays zu arbeiten.
Um einen einfachen, ergänzenden Ansatz für Studien der frühen kortikalen Entwicklung, haben wir modifiziert eine bestehende Scheibe Ansätze 13 Studien der frühen kortikalen Entwicklung zu erleichtern. Wir haben eine wh entwickeltole Hemisphäre Explantat-Modell ähnlich einem bestehenden E14 ganzen Hemisphäre Modell, das geschüttelte Kulturen bei 65 Umdrehungen pro Minute und erlaubt organotypischen Wachstum für 16-18 Stunden 22,23 involviert. In unserem Ansatz werden ganzen Hemisphäre Explantate auf semipermeable Membran 13 mit einem hohen Sauerstoff-Atmosphäre Kultur 21,24 angeordnet, um organotypischen kortikalen Wachstum für 48 Stunden verlängern. Dieser Ansatz ermöglicht eine konsistente Elektroporation entwickelt kortikalen Neuronen. Die Embryonen werden aus der Gebärmutter entfernt und elektroporiert, Plasmid-DNA einzuführen und die Telencephalon wird dann seziert. Jede Hemisphäre wird isoliert und medialen Seite nach unten auf eine Kollagen-beschichtete Filter. Das Explantat wird dann für einen Zeitraum von 48 Stunden, eine Periode, die Vorbeschichtungszyklus Aufspaltung 8 umfasst kultiviert. Während der Anzucht, entwickeln L6 Neuronen aus Vorläuferzellen zu unterscheiden Neuron 25, richtig positioniert in der kortikalen Platte. Während dieser Zeit ist die Entwicklung vonNeuron wird durch die entsprechende ECM und Zelltypen, die die entsprechende Zelle in vivo zu konfrontieren würde umgeben. Dieses System hat sich bereits in der Entschlüsselung der zellulären Vorgänge, die Ethanol Toxizität 26, Schicht 6 Bildung und Vorbeschichtungszyklus Aufspaltung 7,25 zugrunde wertvoll.
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Protocol
1. Ex utero Elektroporationen mit Green Fluorescent Protein Expression Plasmid
- Plasmid-DNA werden mit Injektionslösungen CAG-eGFP DNA 27 verdünnt, um die endgültige Arbeitskonzentration von 0,33 mg / ml in ddH 2 O zubereitet Endo-Free Qiagen Maxi-Präparationen verwendet werden, um das Plasmid aus den transformierten Bakterien zu reinigen. Schnelle grünen Farbstoff bei ~ 0,02% (w / v endgültige) mit der DNA-Lösung als Injektion Tracer zugegeben.
- Um den OP-Bereich vorzubereiten, abspritzen Labor-und Binokular Bühne mit einer 70% igen Ethanol-Lösung und trocken wischen. Sprühen chirurgische Scheren und Zangen mit 70% Ethanol vor Dissektion und trocken wischen.
- Timed Schwangere Swiss / Webster Dämme auf E13 durch Überführung in eine Kammer mit CO 2 aus einer Druckflasche gefüllt und der Damm wird überwacht geopfert, bis alle Bewegung für mindestens 1 min gestoppt wurde. Nach der Tötung durch CO 2-Inhalation werden die Embryonen aus dem Uterus entfernt und ineine 10 cm Petrischale mit eiskaltem Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS).
- Sorgfältig sezieren jeden Embryo aus den umliegenden extraembryonalen Membranen und halten in eiskaltem HBSS.
- Übertragen jedes Embryo einzeln mit einem zweiten 10 cm Petrischale mit kaltem HBSS. Verwenden einer Hamilton-Spritze auf 2-3 ul der DNA schnell Grünmischung in den Ventrikel des linken Großhirnhemisphäre injizieren, wobei darauf zu in einer kortikalen Bereich räumlich getrennt von dem kortikalen Bereich für zukünftige Analysen injizieren.
- Um elektroporieren, halten den Embryo vorsichtig mit Pinzette und leicht zu platzieren die positive Paddel des Pinzette Elektrode auf der dorsalen Mittellinie des Kopfes zu platzieren und leicht die negative Paddel unterhalb des Embryos Kinn. Elektroporationen mit einem BTX830 Elektroporator programmiert zu fünf 30 V Impulse von 50 ms Dauer von 950 ms Intervalle getrennt liefern erreicht. Diese Einstellungen sind für die BTX830 Modell. Andere Systeme können nach Herstellerangaben instructio verwendet werdenns.
2. Whole Hemisphäre Explantatherstellung
- Nach der Elektroporation werden die Embryonen wieder in eiskaltem HBSS platziert. Das Gehirn wird entfernt, indem zwei # 5 Juwelier Zange, um die Haut und knorpeligen Schädels aus dem Embryo Kopf zu entfernen. Eine Pinzette wird dann rutschte unterhalb des Gehirns, um das intakte Gehirn aus dem Schädel zu entfernen. Das elektroporierte Halbkugel (links) wird dann von dem Gehirn seziert und die angeschlossenen mittleres Hirngewebe entfernt wird. Während der Dissektion Verfahren wird darauf geachtet, nicht zu beschädigen die Hirnhäute, die über dem linken kortikalen Hemisphäre.
- Sobald seziert jeder Embryo in HBSS mit einer Pipette mit einem Schnitt 1 ml Pipettenspitze übertragen wird. Die Halbkugel wird vorsichtig auf ein Kollagen beschichteten Kulturplatten Einsatz vertrieben. Bis zu sechs Hemisphäre Explantate medialen Seite angeordneten sich auf jeweils 24 mm Einsatz. Einmal angeordnet, überschüssiges HBSS wird von dem Einsatz entfernt und der Einsatz wird dann in eine 35-mm-Well einer 6-Well-Schale gegeben. Der Brunnen enthält exactly 2,7 ml Medium: DMEM-F12 Medium mit Glutamax und ergänzt mit 2% B-27, 1% G5 und 1% Penicillin-Strep. Ein paar Tropfen der Medien aus dem Brunnen können übereinander Explantat pipettiert werden, aber nicht hinzufügen media über der ursprünglichen 2,7 ml pro Vertiefung.
- Sobald die Explantate auf Collagen Filter platziert wurden die 6 Well-Platte, welche die Explantate in eine Billups Rothenberg (BR) Kammer (das auch eine Schale mit Wasser befeuchtet) platziert. A 95% / 5% Sauerstoff / CO 2-Gasmischung in die Kammer für mindestens 1 min vor Abdichten der Kammer geschlossen und Abklemmen der 95% / 5% Sauerstoff / CO 2 Gaszufuhrrohr infundiert. Das BR Kammer wird dann in einem 37 ° C Inkubator für Gewebekultur den Rest der Kulturperiode, 1-2 DIV platziert.
3. Fixierung Explantatgewebe für die Histologie
- In einem Abzug vorbereiten Pagano Fixierung Lösung erster machende 8 g Paraformaldehyd in 100 ml vorgewärmtes (~ 80 & deg; C) ddH 2 O. Fügen Sie 1-3 Tropfen konzentrierte NaOH die Solubilisierung zu fördern und vorsichtig umrühren. Sobald solubilisiert mischen 8% Paraformaldehydlösung 1:1 mit einer Lösung, die 500 mM Saccharose, 100 mM Hepes, pH 7,4, 50 mM MgCl 2, 5 mM KCl für eine Endkonzentration von 4% Paraformaldehyd in 250 mM Saccharose 50 mM Hepes ist , 25 mM MgCl 2, 2,5 mM KCl, pH 7,4.
- Um dies zu beheben die Explantate erwärmen Pagano fix Lösung auf 37 ° C. Schnelles Entfernen meisten DMEM/F12 Medien aus jeder Kultur gut und 5 ml Pagano Fix zu jeder Vertiefung der Explantate. Achten Sie darauf, jedes Explantat vollständig bedecken in fix. Fix für 1 Stunde bei RT. Entfernen Sie nicht Explantate aus dem Filter vor 1 Stunde der Fixierung.
- Nach der Fixierung entfernen Pagano fix Lösung und ersetzen Pagano Lösung ohne fix (250 mM Saccharose 50 mM Hepes, 25 mM MgCl 2, 2,5 mM KCl, pH 7,4). Fügen Sie ein paar Tropfen 10% Natriumazid und bei 4 ° C bis Einbettung.
4. Einbettung und Sectioning für die Histologie
- Eine 10% ige Kalbshaut Gelatinelösung durch Solubilisieren 10 g Kalbshaut Gelatine in 100 ml warmem Wasser (55-60 ° C). Zeigen Gelatinelösung auf einer Heizplatte auf 60 ° C und wirbeln in regelmäßigen Abständen, bis solubilisiert.
- Gießen etwa 10 ml der 10% igen Gelatine-Lösung in den Boden einer 10 cm-Petrischale und erlauben 30 min zu verfestigen. Dadurch wird ein "pad" für die Einbettung der Explantate bilden. Diese Pads können vorbereitete Tage im Voraus und bei 4 ° C. Verwenden Sie ein Lineal, um ein Raster auf dem Boden der Petrischale zu ziehen und zu übertragen einzelnen Explantate in jedem Feld des Gitters. Rückstände von Pagano Lösung und mit einer Pipette auf jede Explantat mit warmen 10% igen Gelatinelösung und lassen sich zu verfestigen. Fortsetzen langsame Zugabe von Gelatinelösung, bis jede Explantat vollständig von Gelatine umgeben, dabei nicht um das Kissen durch die Zugabe von zu viel erwärmen Gelatine sofort schmilzt. Lassen Sie für die Gelatine zu härten für ~ 1 Stunde. Nach Aushärtung der einzelUAL Explantate können in kleine Blöcke von Gelatine geschnitten werden. Die Blöcke werden dann in Pagano-fixiert verfassen fix für 24-48 Stunden vor dem Schneiden mit einem Vibratom.
- Explantate in Gelatine Blöcke Riechkolben positioniert und geschnitten in der koronalen Ebene bei 100 mu m Dicke. Die Abschnitte werden gesammelt und in PBS + 0,1% Natriumazid bei 4 ° C bis immunhistochemische Verarbeitung. Gespeicherten
- Immunhistochemischen Nachweis erfolgt durch die Übertragung Abschnitten in eine 24-Well-Platte (2-3 Abschnitte pro Well) durchgeführt. Erster Block unspezifische Antikörperbindung durch Zugabe von 0,5 ml PBST + B (PBS + 0,5% Triton X 100 und 2% BSA) in jede Vertiefung, inkubieren 1 h unter leichtem Schütteln. Die entsprechenden primären Antikörper wird dann in PBST + B verdünnt und 0,4 ml pro Vertiefung wird für eine Inkubation über Nacht bei RT zugegeben. Der primäre erfolgt mit PBS 3X wäscht und für mindestens 10 min gewaschen. Der sekundäre Antikörper und 2 ug / ml Hoechst 33342 Nuklearfarbstoff werden dann in PBST + B verdünnt und die Proben werden für 2 h bei RT inkubiertunter leichtem Schütteln. Drei Wäschen PBS (10 min jeweils) werden durchgeführt und dann werden die Schnitte auf Objektträger unter Verwendung eines 90% Glycerin 50 mM Tris, pH 7,4, Eindeckmitteln montiert.
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Representative Results
Die embryonale Nager Cortex weist eine quer neurogenetischen Gradienten in der Entwicklungsphase ist, so dass seitliche Neocortex ungefähr 1 Tag reifer als dorsalen medialen Neocortex 28. Die Masse der Schicht 6 Neuronen so erzeugte (dh weisen ihre endgültige S-Phase) auf E12 in seitlichen Kortex (auch als Feld 40 5) und bei E13 in der dorsalen medialen Kortex (auch als Feld 1 5). Vorbeschichtungszyklus Aufspaltung beginnt etwa 1 Tag nach Layer 6 Neuron Generation und wird somit in der lateralen Kortex auf E13 und der dorsalen Kortex auf E14 initiiert. Um Vorbeschichtungszyklus Aufspaltung und die Einleitung Kortikalplatte Entwicklung zu analysieren, modifizierten wir eine Scheibe Explantat Assay 21,24 derart, daß gesamten Großhirnhemisphären typischerweise wurden aus E13 bis E15 (Abbildung 1) kultiviert.
Wir testeten die Lebensfähigkeit des kortikalen Explantat-Technik durch die Untersuchung das Wachstum von ganzen Hemisphäre Explantate derived von Tg (Eomes :: eGFP) gsat Mäusen (Abbildung 2). Diese Maus Stamm enthält ein Transgen, unreifen Neuronen des erregenden kortikalen Linie 7,29,30 berichtet. Ganzen Hemisphäre kortikalen Explantate wurden bei E13 hergestellt, zu einem Zeitpunkt vor dem Spalten in der dorsalen Neokortex (2A) Vorbeschichtungszyklus. Kortikalen Explantate aus einem Wurf waren Drop sequentiell über einen Zeitraum von 2 DIV fixiert und für die anschließende histologische Analyse. Bei der ersten Analyse Zeitpunkt (DIV 0), hat Vorbeschichtungszyklus Aufspaltung noch nicht in Feld 1 (; 2A, 2E Dorsal Neokortex) aufgetreten. Mit 1 DIV der CP ist offensichtlich (2B, 2C, 2F, 2G), und es wächst weiter bis zu 2 DIV (Figuren 2D, 2H). Somit wird der gesamte Hemisphäre Explantate anfänglich E13 Träger für zwei Tage der Reifung der Großhirnrinde kultiviert und erfasst Vorbeschichtungszyklus Aufspaltung im dorsalen Neocortex.
Norm bestätigenal histologische Entwicklung im dorsalen Neocortex, immungefärbt wir 2 DIV Explantate für Chondroitinsulfat-Proteoglycane (CSPGs), einen Bestandteil der extrazellulären Matrix, der auch ein etablierten Marker des PP und ihren Derivaten der MZ und SP 8,31,32. Immunfärbung auf CSPGs zeigt zwei Banden von CSPG Immunreaktivität im dorsalen Cortex anzeigt entsprechende Aufteilung des PP in MZ und SP während der in vitro-Kultur Periode (3A bis 3C). Die PP wird durch L6 kortikalen Neuronen, die bekanntermaßen die Transkriptionsfaktoren Ctip2 und Tbr1 7,33,34 auszudrücken aufgeteilt sind. Die Immunfärbung Muster dieser Marker (Figuren 3D-3F, 3G-I bezeichnet) bestätigt die entsprechenden Expression dieser Transkriptionsfaktoren in der neu gegründeten CP. Zusammen bilden diese Analysen bestätigen organotypischen frühen kortikalen Entwicklung in der gesamten Hemisphäre Explantate.
In utero Elektroporationen wurden ausgiebig genutztzur Untersuchung auf zellautonomen Genfunktion in den Entwicklungsländern Cortex 35. Wir haben daher untersucht, ob Elektroporation konnte erfolgreich transfizieren Neuronen in der ganzen Hemisphäre Explantat-Modell. Der linke Ventrikel des intakten E13 Embryonen wurden mit 0,33 mg / ml CAG-GFP-Plasmid und elektroporierten (siehe Methoden) injiziert, um die Plasmid-DNA in die neuronalen Vorläuferzellen einzuführen, die sich am lateralen Ventrikel (1A). Nach 2 DIV wurden die Explantate fiel festen und geschnitten für die histologische Analyse. Zu diesem Zeitpunkt wurden GFP-exprimierenden Zellen in allen kortikale Zonen über den cerebralen Wand (4A-4C) beobachtet. GFP-Expression konnte von neuronalen Vorläufern in dem VZ beobachtet werden, während intensiv GFP-exprimierenden Zellen in dem IZ und CP beobachtet wurden. Wichtig ist, wurden zahlreiche GFP + Neuronen an der Oberseite des formgebenden CP mit Schwellen Dendriten und Axonen beobachtet. Die Zellen haben eine diskrete Schicht an der Grenzfläche zwischen dem CP und MZ indicatin gebildetg entsprechende Migration Verhaftung und Laminierung (4A-4C, Pfeile). Die Dendriten in den MZ verlängert, während corticofugal Axone unterhalb der CP und in die IZ (4A-4C und 5, siehe auch Supplemental Film S1) erstrecken. Unterhalb der Differenzierung von Zellen seien GFP +-Zellen in verschiedenen Stadien der Reife, einschließlich Neuronen mit einer bipolaren Morphologie, gegenübergestellt, um eine radiale Gliafasern und unter ihnen, multipolaren Neuronen in der IZ (Abb. 4D-4F). Darüber hinaus werden die Dendriten beobachtet sich in die MZ wo die ECM-Protein Reelin liegt zweckmäßigerweise immunolocalized (Figuren 4G-4I). Die Elektroporation und Explantat Bedingungen erlauben somit normale Entwicklung der kortikalen Neuronen durch die Stufen der Vorstufe zu migrieren Neuron zu unreifen Differenzieren Neurons.
Zum Zeitpunkt der Elektroporation (E13) 100% der Neuronen der dorsalen neokortikalen VZ hergestellten L6 Neuronen, die Neuronendas spaltete die PP 5. Erfolgreiche Elektroporation erfordert, dass Konstrukte in Neuronen während der 6 h eingebracht unmittelbar vor oder während, M-Phase des Zellzyklus 36. Es wird daher erwartet, dass die frühesten postmitotischen, GFP + Neuronen nach E13 Elektroporation im dorsalen Kortex (Feld 1) sollte die Bildung CP bevölkern. Solche Neuronen beobachtet (Abbildung 4), die anzeigt, dass das Protokoll zuverlässig gezielt L6 kortikalen Neuronen für Studien ihrer Migration und Reifung.
Um die "Erfolgsquote" der Elektroporation / Explantat Prozedur zu schätzen analysierten wir eine laufende Untersuchung aus unserem Labor. Im Zuge dieser Untersuchung wurden 21 Würfe von Explantaten vorbereitet, insgesamt 248 Embryonen elektroporiert wurden (wie oben beschrieben) mit CAG-GFP und eine einzelne Halbkugel Explantat von jedem Embryo wurde hergestellt. Von den ursprünglich 248 Explantaten wurden 195 (79%) beurteilt geeignet zur Bildgebung und Analyse. Etwa die Hälfte der 53Explantate, die konnte nicht analysiert werden konnte GFP exprimieren oder hatten mis gezielte GFP-Expression. Die verbleibenden Verluste wurden durch dysmorphic Wachstum durch Loslösung von der Kultur-Filter, oder Probleme mit histologischen Verarbeitung verbunden Explantation erläutert. Diese Erfolgsquote von etwa 80% (Abb. 5) die Explantat geeignet für pharmakologische Untersuchungen 26 sowie die Analyse der rezessive Mutationen 7 negativ beeinflussende frühen kortikalen Entwicklung gerendert.
Abbildung 1. Ganze Hemisphäre Explantat Verfahren mit ex utero Elektroporation. A) E13 Maus-Embryonen mit einer Plasmid-DNA-Lösung injiziert und elektroporiert. Die Gehirne werden seziert und durchtrennt sagittal. Das elektroporierteHalbkugel werden dann medialen Seite nach unten auf ein Kollagen beschichteten Filter und kultiviert 2 DIV. Die Halbkugeln können dann abgebildet live oder für die Histologie und anschließende bildgebenden Analyse fixiert. B) Ein Foto von 10 Explantate auf drei Filtern in einem sechs gut Gewebekulturschale. C) Die sechs gut Schale mit Explantate in einem hohen Sauerstoff-Umgebung platziert (95% O 2/5% CO 2) innerhalb eines Billups-Rothenberg Inkubator Kammer, die dann in einer Standard-37 ° C Gewebekultur-Inkubator platziert ist.
Abbildung 2. Organotypische Wachstum der kortikalen Platte in ganzen Hemisphäre Explantaten aus einem einzigen Wurf Eomes :: eGFP Embryonen gewonnen. A, E) A Frontalschnitt aus einer Dropdown-festen Gehirn zu Beginn des Kults ure Periode (O DIV). Beachten Sie, dass die PP vorhanden ist, aber, dass CP ist noch nicht zu bilden. Die grüne Signal wird durch die GFP-Expression in den unreifen exzitatorischen Neuronen und der blaue Farbstoff Hoechst ist, die den Kern von allen Zellen markiert. B, F). CP Wachstum, durch gestrichelte Linien dargestellt, um 0,5 DIV und um 1 DIV (C und G) und 2 DIV (Platten D und H) beobachtet. Beachte die erhöhte Dicke des GFP exprimierenden Zelle Domäne in Tafeln AD, welche die Proliferation und Differenzierung des exzitatorischen Neurons Linie im Explantat. Maßstabsbalken sind 500 um (Panel A) und 50 um (Tafel H). Abkürzungen: CP, Kortikale Plate; IZ, Intermediate Zone; MZ, Marginal Zone; SP, Plattenanschluss, VZ, ventrikuläre Zone.
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Abbildung 3. Vorbeschichtungszyklus Aufspaltung in ganzen Hemisphäre Explantate. AC) Chondroitinsulfat-Proteoglykan (CSPG) Immunfärbung veranschaulicht die Aufteilung (Splitting) der PP in der MZ und SP. DF) Expression des Transkriptionsfaktors Ctip2 in der neu gegründeten CP. GI) Expression der Transkriptionsfaktor Tbr1 in der neu gegründeten CP. Maßstabsbalken sind 50 &mgr; Platten C, F, I.
Abbildung 4. GFP-Expression in ganzen Hemisphäre Explantaten nach E13 ex utero Elektroporation. AC) GFP-Expression nach 2 DIV. Beachten Sie die Ebene der kortikalen Neuronen bilden im oberen Bereich des CP (Pfeile). DF) Nestin (rot) immunoreactivkeit in einem Abschnitt von einer ganzen Hemisphäre Explantat. GH) Reelin (rot) Immunreaktivität in einem Ausschnitt aus einer ganzen Hemisphäre Explantat abgeleitet. Maßstabsbalken in Platten C, F, und ich sind 50 um.
Abbildung 5. Variabilität bei der Ausrichtung der ex utero Elektroporationen nach dorsal medialen Kortex (Feld 1). Elf Embryonen aus einem Wurf wurden mit dem CAG-GFP-Expression Konstrukt (0,33 mg / ml) und kultiviert als ganze Hemisphäre Explantate elektroporiert. AI) Neun von elf Explantate zeigten Expression von GFP in dorsalen medialen Kortex. Obwohl GFP-Expression variiert zwischen Explantate, wird in jedem Explantat GFP in allen drei kortikale Zonen (dh VZ, IZ und CP) detektiert. Maßstab ist 50 um in Panel A.
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Discussion
Wir haben verbessert und ausgewertet eines experimentellen Modells - ganzen Hemisphäre Explantate - zur Untersuchung der frühen Entwicklung kortikalen (E13-E15). Das Modell hat sich für die Analyse der Migration und Differenzierung des exzitatorischen Neurons Linie, die Schicht 6 aus der Großhirnrinde 25,37 bildet nützlich. Die prinzipiellen Vorteile des Systems sind: 1) organotypischen Wachstum für 2 DIV, 2) Einfachheit der Zubereitung, und 3) experimentellen Zugang zu den Neuronen für die Elektroporation, pharmakologische Manipulation und Bildgebung während dieser frühen, kritischen Phase der Entwicklung des Gehirns. Wir haben das System verwendet, um feine Unterschiede in der Morphologie, Orientierung und dendritischen Wachstum der Schicht 6 kortikalen Neuronen 7,38 während der Vorbeschichtungszyklus Aufspaltung dokumentieren.
Die erregenden Neuronen, die Schicht 6 bevölkern, sind weitgehend aus corticothalamic Projektion Neuronen, die gegenseitigen Input liefern zur dorsalen Thalamus 39,40 zusammengesetzt 41. Obwohl diese Neuronen physiologisch sind spezialisiert, die Generation, Migration und Reifung der Schicht 6 Neuronen Aktie Basisinformationen mit allen exzitatorischen Neuronen in Schichten 2-6 des Kortex. Insbesondere alle kortikalen exzitatorischen Neuronen im dorsalen telencephalen VZ erzeugt werden, durch die IZ als multipolaren Neuronen Migration und Differenzierung innerhalb des CP 7. Pax6, tbr2 und Tbr1 29: Die Reifung des erregenden kortikalen Neuronen wird durch einen Kern Satz von sequentiell ausgedrückt Transkriptionsfaktoren angetrieben. Diese Sequenz wird von allen exzitatorischen Neuronen in Schichten 2-6 42 geteilt und wir bestätigten die entsprechenden Ausdruck Tbr1 in der neu gegründeten CP (Abbildungen 3G-3I). Mit Hilfe dieses Ansatzes auf die Entwicklung der Schicht 6 kortikalen Neuronen untersuchen sollte damit die wesentliche Einblicke in die Entwicklung der neurons, die alle kortikalen Schichten darstellen.
Ganze Hemisphäre Explantate Ergänzung bestehender Ansätze zur Untersuchung von kortikalen Neuronen Entwicklung. Frühere Studien haben bereits E14 ganzen Hemisphäre Explantat Ansatz zur kortikalen Entwicklung für 1 DIV 22,23 studieren beschäftigt. Wir haben ganze Hemisphäre Explantate mit ex utero Elektroporation gekoppelt zu 2 Tage der kortikalen Entwicklung während der L6 Bildung und Vorbeschichtungszyklus Aufspaltung untersuchen. Im Gegensatz zu in utero Elektroporationen bei E13, ist die Erfolgsquote der ex utero Elektroporationen durch ganze Hemisphäre Explantat gefolgt höher: in unseren Händen erreichen wir ~ 80% Erfolg bei der Ausrichtung der Elektroporation zur dorsalen Telencephalon. Zusätzlich in utero Elektroporationen erfordern einen Überlebensvorteil Chirurgie und nehmen wesentlich mehr technischen Aufwand als die ganze Hemisphäre ex utero Ansatz. Schließlich, in utero Studien sind nicht leicht zugänglich, präzise pharmakologischeManipulationen und bildgebenden Verfahren. Genaue zeitliche Steuerung der Entladung oder Aktivierung von Drogen und molekularen Substanzen (Expressionsvektoren, Silencing-Konstrukte, etc) bei definierten Konzentrationen mit den ganzen Hemisphäre Explantate bereitgestellt, aber schwieriger ist, die in utero erreichen. Leben optische Überwachung der resultierenden Wirkungen solcher Manipulationen mit Ortsauflösung im Mikrometerbereich, leicht verfügbar ist mit EUEP, aber nicht IUEP. Diese Präzision ist wahrscheinlich wesentlich verbessern die Deutungsmacht von Daten aus Experimenten mit kortikalen Entwicklung und Funktion gesammelt. So für Studien der frühen kortikalen Entwicklung ganze Hemisphäre Explantate besitzen deutliche experimentelle Vorteile gegenüber der in utero Ansatz. Zu diesem Zeitpunkt wird jedoch für Studien der oberen Schicht kortikale Neuronen und Experimente erfordern Datensammlung> 48 h, Scheibe Explantate und in utero Ansätze bleiben bevorzugt.
Es gibt mehrere kritische Voraussetzungen für den Erfolg der gesamten Hemisphäre Explantat-Technik. Erstens ist das Wachstum des Explantats sehr empfindlich auf die mechanische Integrität der Hirnhaut. Physische Schäden an der Hirnhäute (dh Löcher oder Risse) wird auf ein Minimum zu stören lokale Entwicklung des zugrunde liegenden Kortex. Zweitens ist Explantat Wachstum empfindlich auf das Gesamtvolumen des Mediums innerhalb der Kultur gut: mit zuviel Medien die Explantate werden von dem Filter zu lösen und zu entwickeln verzerrten CP Architektur; mit zu wenig Medien und den Explantaten dürften dehydratisieren und Erfahrungen übermäßige Zelltod . Schließlich mit den aktuellen Technik Explantate wir kortikalen Wachstum für 2 DIV dokumentiert. Beim Start am E13 Diese Entwicklung Zeitfenster, obwohl zuzugeben viele wertvolle Untersuchungen beschränkt Analysen auf einen Zeitraum vor Synaptogenese und kanonischen neuronale Kommunikation. Obwohl die kortikalen Neuronen an E14.5 ausdrückliche vielen mRNAs kodieren synaptischen Proteinen (w.genepaint.org "target =" _blank "> www.genepaint.org), hat Synaptogenese erst ~ E15 beginnen in der lateralen Kortex, und dies Synaptogenese beschränkt sich auf Zellen anstatt Schicht 6 Neuronen 43 Vorbeschichtungszyklus. Einige kritische Fragen kortikalen Synapsen Bildung und Funktion sind daher derzeit nicht adressierbare mit der ganzen Hemisphäre Explantat System.
Abschließend die ganze Hemisphäre Explantat Vorbereitung kann zuverlässig und konsequent genutzt werden, um frühen kortikalen Entwicklung in Mausmodellen der vererbbaren Hirnfehlbildungen untersuchen. Die Technik ist leicht an RNAi, shRNA, und andere molekulare und pharmakologische Manipulationen. Das gesamte Hemisphäre Explantat eignet sich auch für Studien mit angewendet rekombinanten Proteins, Drogen und Umweltgifte.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde Zuschüsse aus NINDS (NS066071) und der NIAAA unterstützt. (P50AA017823) an ECO. Die Autoren danken Dr. Robert Quinn und das Personal in der Abteilung für Versuchstierkunde Ressourcen für Tierpflege. Wir danken Judson Belmont für den technischen Support, Nicole Belletier für die Unterstützung als Sommer Undergraduate Research Fellow (SURF). Wir danken auch Dr. David Cameron für Kommentare und Änderungen auf eine frühere Version des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 + GlutaMAX | GIBCO | 10565 | |
| G5 Supplement 100X | Invitrogen | 17503-012 | |
| B27 Serum-Free Suppl. 50X | Invitrogen | 1504-044 | |
| Pen / Strep Liquid 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| HBSS 500 ml | GIBCO | 14025 | |
| Culture insert collagen coated | Costar | 3492 | |
| Bovine skin gelatin | Sigma | G9382 | |
| H–chst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 7906 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Equipment | |||
| BTX 830 Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Tweezer electrodes 10mm | Harvard Apparatus | 450166 | |
| Incubator | Billups Rothenberg | MIC-101 | |
| Hamilton syringe (5uL) | Hamilton | 87930 | |
| Hamilton syringe needle | Hamilton | 7803-04 | Specify 1" and style 4 |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11251-10 | |
| Fine Scissors Tough Cut 9 cm | FST | 14058-09 |
References
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