Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

Zusammenfassung

Die Kombination von Chromatinimmunpräzipitation und ultra-Sequenzierung mit hohem Durchsatz (Chip-seq) zu identifizieren und abzubilden Protein-DNA-Wechselwirkungen in einem bestimmten Gewebe oder Zelllinie. Skizziert ist, wie man eine hohe Qualität ChIP Vorlage für anschließende Sequenzierung mit Erfahrung mit dem Transkriptionsfaktor TCF7L2 als Beispiel zu generieren.

Zusammenfassung

ChIP-Sequenzierung (ChIP-seq) Methoden direkt anbieten Ganzgenom Deckung, wo die Kombination Chromatinimmunpräzipitation (Chip) und massiv parallele Sequenzierung genutzt werden, um das Repertoire der Säuger-DNA-Sequenzen, die von Transkriptionsfaktoren in vivo gebunden zu identifizieren. "Next-Generation" Genom-Sequenzierung Technologien bieten 1-2 Größenordnungen Anstieg in Höhe von Sequenz, die sein können kostengünstig im Vergleich zu älteren Technologien erzeugt so dass für ChIP-seq Methoden, um direkt zur Verfügung Ganzgenom Abdeckung für wirksame Profilierung von Säugetieren Protein-DNA-Wechselwirkungen.

Für eine erfolgreiche ChIP-seq Ansätze, muss man erzeugen hochwertige ChIP DNA-Vorlage, um die besten Ergebnisse zu erhalten Sequenzierung. Die Beschreibung ist um Erfahrungen mit dem Proteinprodukt des Gens am stärksten in der Pathogenese von Diabetes Typ 2, nämlich der Transkriptionsfaktor Transkriptionsfaktor 7-like 2 (TCF7L2 gebracht basierend). Dieser Faktor ist auch in verschiedenen Tumoren in Verbindung gebracht.

Skizziert ist wie man qualitativ hochwertige ChIP DNA-Vorlage aus dem kolorektalen Karzinom Zelllinie HCT116 abgeleitet zu erzeugen, um eine hochauflösende Kartendarstellung durch Sequenzierung der Gene von TCF7L2 gebunden bestimmen zu bauen, geben weitere Einblicke in seine wichtige Rolle in der Pathogenese von komplexen Merkmalen.

Einleitung

Seit vielen Jahren hat es einen unerfüllten Bedarf, um den Satz von Genen, gebunden und durch ein bestimmtes Protein genomweiter, insbesondere in den Transkriptionsfaktor reguliert Klasse zu identifizieren.

Odom et al. ¹ verwendet Chromatinimmunpräzipitation (Chip) mit Promoter Microarrays systematisch zu identifizieren, die Gene von vorgegebenen Transkriptionsfaktoren in der menschlichen Leber und Pankreas-Inseln besetzt kombiniert. Anschließend entwickelte Johnson et al. ² eine groß angelegte Chromatinimmunpräzipitation Assay auf direkte Ultra Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (ChIP-seq), um umfasse....

Protokoll

Ein. Querverbindung Chromatin

1. Wachsen Zellen in 100x20mm Zellkulturschalen. Die Menge der Zellen können von 1 bis 10 Millionen Zellen pro Schale je nach Zelltyp reichen. Etwa 2 Millionen Zellen ist ausreichend für eine Immunpräzipitation.
2. Querverbindung Zellen in 1% Formaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Schaukelstuhl.
3. Quench Vernetzung durch Zugabe einer Endkonzentration von 125 mM Glycin und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur gerührt.
4. Waschen der Zellen mit 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) zweimal, dekantieren PBS, und fügen Sie 0,2 ml PBS.
5. Ernten Sie die Zellen mit einem Kunststoff Z....

Ergebnisse

Sobald das Chromatin wurde mit Ultraschall behandelt wurde, und wurden mit RNase und Proteinase behandelt, sollten die Proben auf der 2% igen Agarosegel aufgetrennt ein Abstrich mit der Masse der DNA, die in der gewünschten Größe. Wenn mehrere Zyklen geprüft, ist eine allmähliche Abnahme in der Größe der Anzahl von Zyklen erhöht (Abbildung 2) zu sehen.

Nach Abschluss der Immunopräzipitation des Protokolls ist die Anreicherung kann entweder durch PCR oder Echtzeit-PCR überprü.......

Diskussion

Es ist nun möglich, die Durchführung einer genomweiten Profil von Protein-DNA-Wechselwirkungen Assoziation mit ChIP-seq, wie bereits vor kurzem mit anderen Transkriptionsfaktoren ^2,3 demonstriert. Der Schlüssel zu einer erfolgreichen Sequenzierung Ergebnis ist die Erzeugung eines hochwertigen Chromatinimmunpräzipitation DNA-Vorlage.

Sobald die DNA-Matrize erzeugt wurde und festgestellt, angemessen angereichert werden, kann man dann nehmen Sie es in der Bibliothek Vorbereitung für .......

Materialien

Positivkontroll-Primersequenzen (TCF7L2-1)


Negativkontroll-Primersequenzen (CTRL-1)

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
QIAquick PCR-Aufreinigungskit	Qiagen	28104
EZ-ChIP-Kit	Millipore	17-371
GoTaq Hot Start Polymerase	Promega	M5001
Misonix Sonicator	Qsonica	XL-2000
NanoDrop 1000 Spektralphotometer	Thermo-Scientific<

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