Summary
We beschrijven protocollen voor onze muis graft arteriosclerois (GA) modellen die tussenkomst van een muis bloedvatsegment betrekken in een ontvanger van dezelfde inteeltstam. Door terugkruisen extra genetische veranderingen in het vat donor kan het model het effect van specifieke genen op GA beoordelen.
Abstract
Graft arteriosclerois (GA), ook wel allogreffevasculopathie is een pathologische laesie die zich ontwikkelt over maanden tot jaren in getransplanteerde organen gekenmerkt door diffuse, perifere stenose van het gehele transplantaat vaatstelsel. De meest kritische component van GA pathogenese is de proliferatie van gladde spier-achtige cellen in de intima. Wanneer een menselijke kransslagader segment wordt geplaatst in de infra-renale aorta van immunodeficiënte muizen, kan de Intimas te breiden in reactie op adoptief overgedragen humane T-cellen allogeen de slagader donor of exogeen humaan IFN-γ in de afwezigheid van menselijke T-cellen. Tussenplaatsing van een muis aorta van een stam naar een andere muis stam ontvanger beperkt als model voor chronische afstoting bij mensen omdat het acute celgemedieerde afstotingsreactie in dit muismodel volledig elimineert alle donor-afgeleide vasculaire cellen van het transplantaat binnen twee tot drie weken. We hebben recent ontwikkelde twee nieuwe mOuse modellen om deze problemen te omzeilen. Het eerste model betreft tussenkomst van een segment schip uit een mannelijke muis in een vrouwelijke ontvanger van dezelfde inteeltstam (C57BL/6J). Transplantaatafstoting in dit geval alleen gericht tegen kleine histocompatibility antigenen gecodeerd door het Y-chromosoom (aanwezig in de mannelijke maar niet de vrouwelijke) en afstotingsreactie die volgt voldoende lui om donor-afgeleide gladde spiercellen behouden gedurende enkele weken. Het tweede model is sprake tussenplaatsing van een slagader segment van een wildtype muis C57BL/6J donor in een gastheer muizen van dezelfde stam en geslacht de receptor mist IFN-γ gevolgd door toediening van muizen-IFN-γ (geleverd door infectie van de muis lever met een adenovirale vector. er geen afstoting in dit geval zowel de donor en ontvangende muizen van dezelfde stam en geslacht maar donor gladde spiercellen prolifereren in reactie op de cytokine terwijl gastheer-afgeleide cellen, ontbreekt receptor voorDit cytokine, niet reageren. Door terugkruisen extra genetische veranderingen in het vat donor kunnen beide modellen worden gebruikt om het effect van specifieke genen op GA progressie beoordelen. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen voor onze muis GA-modellen.
Introduction
Graft arteriosclerois (GA), ook wel allogreffevasculopathie is een pathologische laesie die zich ontwikkelt over maanden tot jaren in getransplanteerde organen gekenmerkt door diffuse, perifere stenose van het gehele transplantaat vaatstelsel 7. Vroeg stadium kan veroorzaken excentrieke en focale vernauwingen die zijn meer voor de hand in de slagaders, waardoor meer gelijkenis vertonen met vernauwingen gezien in conventionele atherosclerose. Het lumen verlies van het transplantaat vaartuigen resultaten van intimale uitzetting door infiltratie van gastheer T-cellen en macrofagen en vooral accumulatie van extracellulaire matrix en gladde spier-achtige cellen afkomstig van graft, host of beide 5, 13, 19, die onvoldoende wordt gecompenseerd door uiterlijke schip verbouwen. In cardiale allotransplantaten, de klinisch significante laesies die in de epicardiale en intramyocardiale kransslagaders. Uiteindelijk zal GA van de coronaire arteriën ischemisch hartfalen. GA is de belangrijkste oorzaak van late cardiale graft verlies. De stenose van GA stoppen bij de hechtdraad lijnen, sterk implicating de gastheer respons op graft alloantigenen in de pathogenese en leidt ons naar GA classificeren als een vorm van chronische afstoting 3. Echter, kunnen andere vormen van arteriële schade het risico van GA verhogen, hetzij door middel van het verhogen van de netto lasten van letsel of door intensivering en / of moduleren van de allo-respons. De endotheelcel (EC) bekleding van graft slagaders bewaard in menselijk GA en de oppervlakkige gebieden van de intima naast de EC voering is de plaats zwaarst geïnfiltreerd door gastheer-afgeleide IFN-γ-producerende T-cellen en macrofagen 11, in sommige patiënten GA wordt geassocieerd met de ontwikkeling van donor-specifieke alloantistoffen die binden aan graft EC 16 maar de vaartuigen leveren weinig bewijs van fibrinoïde necrose die karakteristiek acute antilichaam-gemedieerde afstoting 11.
De meest kritische component van GA pathogenese is deproliferatie van gladde spier-achtige cellen in de intima, of deze taak kan worden aangehouden, GA waarschijnlijk vooruitgang. Eerdere werk van onze groep had aangetoond dat Intimas van menselijke kransslagader segmenten geplaatst in de infra-renale aorta's van immunodeficiënte muizen uit te breiden in reactie op adoptief overgedragen menselijke T-cellen allogene aan de slagader donor en dat dit proces kan worden geremd door het neutraliseren van de menselijke IFN- γ 18. Verder exogene humane IFN-γ kan intimale veroorzaken (en mediale) vasculaire gladde spiercel (VSMC) proliferatie in deze arteriële grafts in de afwezigheid van menselijke T-cellen 15, 17. (Het is belangrijk op te merken dat de mens en muis IFN-γ niet oversteken species, het uitsluiten van indirecte effecten op de muis gastheer in deze experimentele systeem.) Deze gehumaniseerde muismodellen hebben het voordeel van recapituleren menselijke T-cel / vasculaire cel interacties en de intima laesies zijn grotendeels uit humaan (bijvoorbeeld graft-afgeleide cellen)zoals is waargenomen in klinische monsters, maar zij niet volledig de klinische situatie herhalen omdat ze voorbijgaan aan de rol van gastheer macrofagen en mogelijk andere celtypen betrokken bij klinische transplantatie laesies. Een conventionele muismodel van dit proces kunnen theoretisch probleem aanpakken, als aanvulling op de beperkingen van de gehumaniseerde model door met een compleet gastheerimmuunsysteem en die de extra voordeel dat de kracht van de muis genetische benaderingen worden toegepast GA. De twee meest gebruikte muismodellen betrekken heterotopische harttransplantatie en orthotopische slagader transplantatie 1. De letsels die zich ontwikkelen in de slagaders van heterotopische hart enten zijn grotendeels opgebouwd uit gastheercellen, waarschijnlijk van beenmerg herkomst, terwijl intima cellen van de bloedvaten in het menselijke hart enten zijn overwegend van graft oorsprong 5, 13, 19. Dit is een belangrijk onderscheid dat ons ertoe alternatieve muismodellen ontwikkelen. Tussenplaatsing vaneen muis aorta van een stam naar een andere muis stam ontvanger nog beperkter als een model voor chronische afstoting bij mensen omdat het acute celgemedieerde afstotingsreactie in dit muismodel volledig elimineert alle donor-afgeleide vasculaire cellen van het transplantaat binnen twee tot drie 19 weken. Bijgevolg is de volgende veranderingen gezien in de tussengelegen segment vaartuig zijn slechts een antwoord van gastheercellen die de ontcelde vaartuig scaffold zijn herbevolkt, waardoor een sterk artefact situatie van beperkt belang als een model voor de veranderingen in graft vaten die zich in de kliniek. We hebben recent ontwikkelde twee nieuwe muismodellen om deze problemen te omzeilen 21. Het eerste model betreft tussenkomst van een segment schip uit een mannelijke muis in een vrouwelijke ontvanger van dezelfde inteeltstam (C57BL/6J). Het tweede model gaat invoegen van een slagader segment van een wild-type C57BL/6J muis donor in een gastheer muis van dezelfde stam en het geslacht dat de rec ontbreekteptor voor IFN-γ (IFN-γR-KO) gevolgd door toediening van muizen-IFN-γ (geleverd door infectie van de muizenlever met een adenovirale vector. We beschrijven hier gedetailleerde protocols en voordelen van onze muis GA modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Muis transplantaat en syngeen graft transplantatiemodel
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de institutionele dieren verzorging en commissies gebruik van Yale University. Voor allotransplantaat model, werden segmenten van thoracale aorta van mannelijke, 4-5 weken oude WT (C57BL/6J) of IFN-γR-KO muizen geplaatst in de abdominale aorta van de vrouwelijke ontvanger, 8-12 weken oude WT met een end-to -end microchirurgische anastomose techniek (zie volgende voor details). Voor syngeen graft-model, werden segmenten van thoracale aorta's van mannelijke, 4-5 weken oude WT muizen geplaatst in de abdominale aorta's van mannelijke, 8-12 weken oude IFN-γR1-KO met behulp van een end-to-end microchirurgische anastomose techniek. Op 1 week na de operatie werden de dieren geïnoculeerd met iv Ad5.CMV-muizen-IFN-γ of Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) en 1 x 10 9 PFU. Serum muis IFN-γ-niveaus werden gemeten met ELISA (eBioscience) op 1 en 5 weken na toediening adenovirus. Bepaalde dieren kregen BrdU(Sigma-Aldrich) en 100 mg / kg sc gedurende 2 weken vóór opoffering.
End-to-end microchirurgische anastomose techniek (video zal worden genomen voor dit deel):
1. Donor Procedure
- Verdoven de donor muizen met intraperitoneale injecties van ketamine (50 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg).
- Na een adequate verdoving, plaatst de donor muizen onder de operationele microscoop bij X8-30 vergroting op een dienblad in een liggende positie, en gebruik jodium Prep Pad en Alcohol Prep Pad voor borstwand voorbereiding.
- Incise de voorste borstwand door de ribben en het middenrif aan het hart bloot te leggen.
- Open het rechter atrium, injecteer 10 ml heparine (100 U / ml) zoutoplossing in de linker ventrikel van de muizen met een 10-ml injectiespuit met een 25-gauge naald spoelen.
- Resectie van het hart en longen naar de gehele lengte van thoracale aorta bloot.
- Ontleden de thoracale aorta aandachtig naar de directe trauma, whil minimaliserene identificeren, afbinden en verdeel het hout takken met 11-0 hechtdraad in de buurt van de aorta.
- Zodra de thoracale aorta is vrij van het omringende weefsel, accijnzen de gehele thoracale aorta voor transplantatie.
- Spoel het afgesneden uiteinde van de donor aorta met heparine (100 U / ml) zoutoplossing, en opslaan in dezelfde oplossing op ijs (tot 6 uur) tot transplantatie.
2. Ontvanger Procedure
- Injecteer de ontvangende muizen met ip ketoprofen (5 mg / kg) voor analgesie en thenanesthetize de muizen met ip ketamine (50 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg). De ontvangende muizen zijn diep verdoofd binnen 10 minuten voor een duur van 60-90 minuten. Tijdens de operatie wordt het niveau van de anesthesie onderzocht om de 15 min door te knijpen in de buikwand of de voet met behulp van een tang. Indien het dier reageert op de schadelijke stimuli op elk moment tijdens de operatie een extra dosis ketamine en xylazine (1/4 of 1/3 origineel dosis) sc of im toegediend
- Na een adequate verdoving, afscheren het bont in de voorste buikwand met behulp van een elektrisch scheerapparaat, het reinigen van de huid met behulp van jodium Prep Pad en Alcohol Prep Pad, de ogen te bedekken met oogzalf. Tijdens de operatie wordt de volgende aseptische techniek worden toegepast voor de activiteiten, zoals het reinigen van de operatietafel met 10% bleekmiddel, dragen steriele handschoenen en met gesteriliseerde instrumenten voor microchirurgie (stoom-gesteriliseerde instrumenten voor het begin van de bewerking, dan heet glaskraal gesteriliseerd instrumenten tussen meerdere operaties, enz.).
- Plaats de ontvangende muizen onder de operationele microscoop bij een vergroting van X8-30 op een dienblad in een liggende positie.
- Incise de buikwand op de middellijn van xyphoid tot schaambeen, en verspreid de buikwand uit elkaar met behulp van een micro-oprolmechanisme aan de buikholte bloot te leggen.
- Trek de darmen superiorly en wikkel met gaas bevochtigd met een zoutoplossing. De ontvangende muizen raken gekoeld door het verlies van heat door veruiterlijkte darmen. Het is belangrijk dier warmte te handhaven. Echter, de verwarmende raad niet gebruikt tijdens de chirurgie als bescheiden onderkoeling van voordeel tijdens occlusie van de aorta bloedstroom en er inefficiënt warmteoverdracht afwezige bloeddoorstroming naar de onderste helft van de muizen lichaam voorkomen ruggenmergletsel.
- Verplaats de voortplantingsorganen inferiorly, wikkel de buik gebied van ontvangende muizen met zout-oplossing-bevochtigd gaas, en gebruik deze om het rectum trekken naar de rechterkant van de buik. De blootgestelde weefsels worden periodiek geïrrigeerd met zoutoplossing tijdens de transplantatie.
- Ontleden botweg een segment van de infrarenale aorta tussen de renale vat proximaal en aortabifurcatie distaal en scheiden van vena cava inferior (IVC) voorzichtig.
- Identificeren en afbinden alle van de kleine takken afkomstig van dit segment van de abdominale aorta met 11-0 Polyamide Monofilament hechtdraad.
- Cross-klem de geïsoleerde segment van eenbdominal aorta met twee vasculaire klemmen proximately 5 mm van elkaar, een aan elk uiteinde.
- Doorsnijden van de abdominale aorta tussen de klemmen met scherpe micro-schaar om de anastomotische sites te maken.
- Resectie een klein segment van de abdominale aorta (tot 0,4 mm in lengte) van het ene afgesneden uiteinde van de doorgesneden ontvanger aorta naar de donor aorta graft tegemoet.
- Spoel de aorta segmenten tussen de klemmen met behulp van heparine zoutoplossing om het resterende bloed te verwijderen. De aorta segmenten tussen klemmen en de donor aortaprothese wordt periodiek geïrrigeerd met gehepariniseerde (100 U / ml) zoutoplossing (tot 40 ml / kg) gedurende anastomose.
- Transect beide zijden van de donor aorta met scherpe micro-schaar om een segment transplantaat van 2,5 mm in de lengte voor transplantatie te creëren.
- Plaats de donor aortaprothese in de orthotope positie anastomose de donor de proximale en distale einde van de proximale en distale snijdende van abdominale aorta van de ontvanger, respectievelijk, met een eind-to-end model met 11-0 Polyamide Monofilament hechtdraad.
- Voor de continue hechtingen, plaatst het verblijf hechtingen op 3 en 9 uur posities in de eerste plaats. Tussen twee verblijf hechtingen aan elke kant van transplantaat, anastomose beide snijkanten in 3-4 steken met de running hechtingen, en bind de running hechtingen om hechtingen te verblijven met een dubbele knoop. Aangezien beide lagen sluiting continu zijn, wordt het risico van dehiscence toegenomen. De donor aortaprothese moeten in geschikte lengte proximale en distale snijdende van abdominale aorta van de ontvanger verbinden.
- Voor de onderbroken hechtingen, construeren vier anastomose op 3 en 9 uur posities in beide zijden van graft enerzijds en anastomose beide snijranden 3-4 steken tussen twee blijven hechtingen aan weerszijden van transplantaat.
- Laat de distale klem om de retrograde stroom in graft toestaan, identificeren het bloeden sites en maak extra steken binnen 3 minuten.
- Na het vaststellen van bevredigende hemostase, laat de proximale klem.
- Bevestig graft patency door de aanwezigheid van krachtige pulsaties in het transplantaat en het aangrenzende proximale segment van natief abdominale aorta, in het bijzonder in het distale aangrenzende segment van abdominale aorta en inferior mesenterica. Overweeg trombose in anastomosen als de pulsatie verminderen binnen enkele minuten na het herstel van de bloedstroom.
- Keer de darmen in de buikholte.
- Hechtdraad sluit de buikwand met 5-0 nylon hechtdraad in de spierlaag en huidlaag, respectievelijk.
- Plaats de ontvangende muizen in een schone kooi bovenop een verwarmingselement en wacht 1-2 uur gedurende de muizen herwinnen bewustzijn en herstellen van anesthesie. Het is belangrijk dier voldoende warmte behouden gedurende herstel. Houd de muizen in de warme en droge kooi voordat dier kielzog van anesthesie.
- Beoordeelt de motorische functie van de achterste ledematen na muizen herstel, en opnieuw op de tweede dag. Een succesvolle transplantatie operatie zal worden bevestigd if geen storing van achterpoten wordt waargenomen in ontvangende muizen op de tweede dag.
- Dien de ontvangende muizen met Ketoprofen in drinkwater (5 mg / kg / d = 27 ug / ml in drinkwater) gedurende 48 uur. Indien een ontvangende muizen last van pijn niet verlicht door de postoperatieve pijnstillers zoals blijkt uit het verlies van mobiliteit, niet de bruidegom, abnormale gebundelde houding, etc, zullen ze worden gedood. De dieren worden gedood op vooraf bepaalde eindpunten na 1-60 dagen.
Graft-analyse
Artery transplantaten in allograft werden verkregen bij 4 weken transplantaten in syngene transplantaat model waren 6 weken na operatie (5 weken na virale infectie) en geanalyseerd door standaard histologische technieken Elastica-van Gieson (EVG) kleuring, hematoxyline en eosine (HE) kleuring en immunofluorescentie kleuring. Foto's zijn gemaakt met behulp van een immunofluorescentie microscoop systeem (Zeiss). Cel telling van kernen omringd door positieve immunostaining was voerened onder hoge vergroting en nam het gemiddelde van 5 doorsneden voor elke graft. De ent gebied metingen van het lumen (binnen het endotheel), intima (tussen het endotheel en de interne elastische lamina, IEL), media (tussen IEL en externe elastische lamina, EEL), wanddikte (tussen het endotheel en externe elastische lamina) en totale houder (binnen de EEL) werden berekend uit 5 serial dwarsdoorsneden, 150 urn apart voor elk transplantaat, met behulp van computer-ondersteunde beeldanalyse en NIH Image 1.60 ( http://rsbweb.nih.gov/nih-image ).
Statistische analyse
Alle gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Tweezijdig, gepaarde t-toetsen en een twee-weg ANOVA-analyse werd uitgevoerd met behulp van het Prism software (GraphPad Software). Verschillen met p <0,05 werden als statistisch significant geven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Muis allograft arteriosclerose (GA) model: In dit model wordt een mannelijke donor aorta getransplanteerd in vrouwelijke ontvangende zodat de gastheer induceert alloreactieve T-cel-gemedieerde respons tegen een allo minor Y antigen (het mannelijk-specifieke minor histocompatibility antigen HY) uitgedrukt het transplantaat 12, en op zijn beurt T-cel-geproduceerde IFN-γ drives proliferatie van VSMC 20 zoals waargenomen in andere harttransplantatie modellen 2, 6, 8-10, 14. Een segment van de thoracale aorta van een donor man werd chirurgisch geplaatst in een abdominaal aorta van een vrouwelijke ontvanger, en de aorta werden geoogst op 4 weken na transplantatie (Figuur 1A). Histologische analyse van de slagader enten werd uitgevoerd door Elastica-van Gieson (EVG), H & E en immunostaining met VSMC marker SMA en pan-leukocyten marker CD45. Geen transplantaatafstoting waargenomen tussen C57BL/6J mannelijke muizen in de aorta transplantatie. Man naar vrouw transplantation geïnduceerde GA, gekenmerkt door infiltratie van leukocyten en neointima formatie met accumulatie van VSMC's (Figuur 1B). Om de rol van IFN-γ signalering in GA, aorta's van WT of IFN-γR-KO muizen te bepalen werden getransplanteerd naar WT vrouwelijke ontvanger. Deletie van IFN-γR in donor grafts vertoonden een verminderde infiltratie van leukocyten en neointima formatie met dalingen van SMA-positieve cellen in vergelijking met WT (niet getoond). Deze resultaten ondersteunen een belangrijke rol voor IFN-γ signalering in GA progressie zoals eerder waargenomen in gehumaniseerde muizen xenograft transplantatie model 4, 15, 17, 18.
IFN-γ-geïnduceerde graft arteriosclerose: Vastgesteld is dat IFN-γalone voldoende om neointima vorming te induceren in een gehumaniseerd muis GA model 15, 17. Hier vestigden wij een IFN-γ-gemedieerde muis syngeen graft arteriosclerose model. In dit model werden WT male aorta getransplanteerdin IFN-deficiënte γR-ontvangende muizen gevolgd door intraveneuze injectie van replicatie-deficiënt adenovirus dat codeert voor de muizen-IFN-γ transgen (Ad-IFN-γ) of control LacZ gen (Ad-LacZ) (Figuur 2A). Lever-infectie en lever transgene expressie van Ad-LacZ werd geverifieerd door X-gal kleuring in de Ad-LacZ groep, maar niet de Ad-IFN-γ groepen zoals eerder beschreven 17. Systemische expressie van IFN-γ in serum werd gedetecteerd op een niveau van 120-150 ng / ml op dag 3 en bewaard tot 5 weken in het Ad-IFN-γ, maar niet in de LacZ groep. Aorta's werden geoogst op 5 weken na injectie van adenovirus voor histologische analyse en morfometrische beoordeling van de slagader graft intima, media, lumen en vaartuig. Expressie van IFN-γ, maar niet LacZ controle geïnduceerde vorming van nieuwe intima. Geen duidelijke infiltratie van leukocyten werd waargenomen vergeleken met de allograft model (Figuur 2B). Deze gegevens zijn consistent met de eerdereopmerkingen gehumaniseerd muis xenograft model dat IFN-γ alleen voldoende is om neointima vorming 15, 17 induceren.
Figuur 1. Illustratie en het stelsel van de muis allotransplantaat slagader transplantatiemodel. A. Een illustratie van de allograft transplantatie procedure. Een segment van de donor mannelijke thoracale aorta werd chirurgisch geplaatst in abdominale aorta in een vrouwelijke ontvanger. Aorta's werden geoogst op 4 weken na transplantatie. Als controle werd een segment van mannelijke donor thoracale aorta chirurgisch geplaatst in de abdominale aorta in een mannelijke ontvanger. B. Histologische analyse van de slagader door enten Elastica-van Gieson (EVG), H & E en immunokleuring met anti-a-SMA en anti-CD45. Vertegenwoordiger microfoto worden getoond. Pijlpunten markeren de interne elastische lamina aan de intima van de media af te bakenen. Schaalbar: 50 mm. Geen graft arteriosclerose waargenomen bij de mannelijke aan mannelijke groep.
Figuur 2. IFN-γ-geïnduceerde syngene muis slagader transplantatiemodel. A. Een schema van de IFN-γ-geïnduceerde muis syngeen model. Mannelijke donor thoracale slagader werd ontleed en getransplanteerd in abdominale aorta bij mannelijke ontvanger IFN-γR KO muizen. Een week na de operatie, 1X10 9 pfu Ad-mIFN-γ of Ad-LacZ werd geïnjecteerd in ontvangende muizen via halsader. Serum werd verzameld op dag 3, 7 en 35 na injectie van virussen om IFN-γ meting. Transplantaten werden geoogst 6 weken voor morfometrische evaluatie. B. Histologische analyse van de slagader transplantaten door immunokleuring met anti-a-SMA en anti-CD45. Vertegenwoordiger microfoto worden getoond. Pijlpunten markeren de interne elastische lamina aan de intima van de media af te bakenen. Schaal bar: 50 mm. Geen graft arteriosclerose waargenomen in LacZ groep.
| Stap | Probleem | Mogelijke oorzaak | Oplossing |
| 2.17 | Ernstige bloedingen | Het verschil (afstand tussen twee steken) te groot is, met name onderbroken hechtingen. | De afstand tussen elke twee steken moet uniform tijdens anastomose. Voeg een steek op bloeden website. |
| Alleen de adventitia is gestikt. | Het identificeren en stikken van de gehele aorta | ||
| Geligeerde hout takken | Ligeren van het hout takken | ||
| Het gebruik van teveel heparine | Met maximaal 40 ml / kg heparine (100 U / ml) pekeloplossing het veld operatie irrigeren tijdens anastomose. | ||
| 2.19 | Trombose | Lumen is te smal op anastomotische terrein, in het bijzonder van continue hechtingen. | Vermijd anastomoserende teveel aorta bij elke steek. De aorta grootte van muis is zeer klein. Stikken teveel aorta tijdens anastomose veroorzaakt lumen smal en trombose zal echter stikken te weinig aortawand tot ernstige bloedingen. |
| De hechtdraad passeren aorta muur aan de andere kant. | Het identificeren van de aorta en vervolgens het maken steken. Als dat gebeurd is, moet de exploitant afgesneden van de hechtdraad knoop en re-steek op deze site. | ||
| Endotheelcellen zijn gewond tijdens anastomose. | Gebruik van het verblijf hechtingen voor anastomose. Niet in het bezit / knijp de hele arotic muur door teeekhoorntjesbrood voor anastomose. | ||
| Heparine wordt niet gebruikt tijdens anastomose. | De aorta grootte van muis is zeer klein. Het is heel gemakkelijk voor trombose vorming in de transplantaten na anastomose. Geven heparine het veld operatie irrigeren is zeer belangrijk voor het verminderen van trombose. Het slagingspercentage van het schip transplantatie in muizen is ongeveer 50% zonder gebruik van heparine en 95-100% bij gebruik van heparine. Indien de trombose binnen een paar minuten na het herstel van de bloedstroom, een alternatieve benadering van de trombose te verwijderen is met 30-50 ul heparinied zoutoplossing (100 U / ml) te injecteren in IVC. Niet injecteren te veel heparine alleen in geval van ernstige bloedingen. | ||
| 2.23 | Transplantatie is mislukt | Vertraagde bloedingen en trombose, of anderen | Het vaartuig transplantatie in muizen is erg moeilijk chirurgie voor de aorta grootte van muis is zeer klein. Er zijn drie belangrijke poigen voor de succesvolle operatie: 1) Zorg ervoor dat de aorta muren van gastheer en donor worden samen geanastomoseerd zonder duidelijk verschil, alleen in geval van ernstige bloeding, 2) houd genoeg lumen ruimte op anastomotische plaats, alleen in geval van trombose; 3) gebruiken heparine in een juiste dosering tijdens anastomose, alleen in geval van trombose en ernstige bloedingen. Naar aanleiding van dit protocol, het slagingspercentage voor de auteur is meer dan 95%. |
Tabel 1. Problemen oplossen tafel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven protocollen zijn gericht op de muis GA-modellen. De procedures kunnen worden toegepast op andere graft transplantatiemodellen. Deze modellen omvatten gehumaniseerd xenograft (dwz menselijke kransslagader segmenten geplaatst in de infra-renale aorta's van immunodeficiënte muizen) en acute afstoting muis GA-model (dat wil zeggen een muis aorta van het ene genetische zeef in een andere genetische ontvangende stam). Onze beschreven muismodellen zijn meer voor de menselijke GA letsels sluiten. Het eerste model betreft tussenkomst van een segment schip uit een mannelijke muis in een vrouwelijke ontvanger van dezelfde inteeltstam (C57BL/6J). Transplantaatafstoting in dit geval alleen gericht tegen kleine histocompatibility antigenen gecodeerd door het Y-chromosoom (aanwezig in de mannelijke maar niet de vrouwelijke) en afstotingsreactie die volgt voldoende lui om donor-afgeleide gladde spiercellen behouden gedurende enkele weken 2, 6 , 8-10, 12, 14. Het tweede model gaat invoegen van een slagader segment van een wildtype muis C57BL/6J donor in een gastheer muizen van dezelfde stam en geslacht dat de receptor voor IFN-γ (IFN-γR-KO) mist gevolgd door toediening van muizen-IFN-γ (geleverd door infectie van de muis lever met een adenovirale vector.) Geen afwijzing in dit geval zowel de donor en ontvangende muizen van dezelfde stam en geslacht maar donor gladde spiercellen prolifereren in reactie op de cytokine terwijl gastheer-afgeleide cellen, ontbreekt receptor voor dit cytokine, reageren niet 21. Bovendien, door het terugkruisen extra genetische veranderingen in het vat donor, beide modellen kunnen worden gebruikt om het effect van specifieke genen voor IFN-γ-driven proliferatie van gladde spiercellen en GA progressie beoordelen.
De rol van IFN-γ in muizen GA modellen niet goed vastgesteld. Onze twee muismodellen hebben de rol van IFN-γ geverifieerd muis GA. In het eerste model, is een mannelijke donor aorta getransplanteerd in vrouwelijke ontvangendezodat de gastheer induceert alloreactieve T-cel-gemedieerde allo-responsen tegen het mannelijk-specifieke minor histocompatibility antigen HY uitgedrukt op grafts 12. Inderdaad, WT (C57BL/6J) man naar C57BL/6J vrouwelijke transplantatie geïnduceerde GA, gekenmerkt door infiltratie van leukocyten en neointimavorming met VSMC accumulatie. In tegenstelling, man op man aorta transplantatie niet aanzet GA. We bepaalden de rol van IFN-γ signalering in vasculaire cellen door IFN-γR-KO als donor getransplanteerd transplantaat WT vrouwelijke ontvanger. Schrapping van IFN-γR in donor grafts afgestompt leukocytinfiltratie en VSMC accumulatie in de neointima. Daarom is de rol van IFN-γ in huidige muismodel is met het gehumaniseerde muis xenograft transplantatie model waarin IFN-γ signalering in graft is kritiek voor GA progressie 4, 15, 17, 18. We bepaald of IFN-γ alleen voldoende is om neointima vorming te induceren door het creëren van een IFN-γ-mediated muis syngeen graft arteriosclerose model. In dit model wordt een mannelijke aorta getransplanteerd in een mannelijke IFN-γR-KO ontvanger dier waarbij muizen-IFN-γ wordt vervolgens systemisch uitgedrukt door intraveneuze injectie van replicatie-deficiënt adenovirus dat codeert voor de muizen-IFN-γ transgen (Ad-IFN-γ ). We vonden dat expressie van IFN-γ, maar niet LacZ controle geïnduceerde vorming van nieuwe intima. In dit model wordt geen duidelijke infiltratie van leukocyten waargenomen vergeleken met de allograft model, consistent met de eerdere waarnemingen in een humane slagader-SCID muis transplantatiemodel waarin vasculaire IFN-γ signalering alleen voldoende is om neointima vorming te induceren in de afwezigheid van leukocyten 15, 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie R01 HL109420 naar WM en AHA 9320033N te LY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks) |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml) |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml) |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml) |
| Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) | CareFusion | AL4109 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | To prepare the anesthetic |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Microscope | Leica | MZ95 | |
| Micro Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5693 | |
| Spring Scissors | F.S.T | 15009-08 | To transect the aorta of donor or recipient |
| Extra Narrow Scissors | F.S.T | 14088-10 | |
| Needle Holder/Forceps | MICRINS | MI1542 | To hold the needle |
| Fine Forceps | F.S.T | 11254-20 | |
| Forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Forceps | F.S.T | 13011-12 | |
| LANCASTER Eye Speculum | Zepf Medical Instruments | 42-1209-07 | |
| Micro Vascular Clip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6472 | |
| Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5440 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture | AROSurgical Instruments Corporation | Cat #T4A10Q07 | 10-0 suture, Needle=70 microns |
| Black Monofilament Nylon Suture | Syneture (Covidien) |
SN-1956 | 6-0 suture |
| Non-Woven Songes | McKesson Corp. | Reorder No. 94442000 | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | REF 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 18G 1 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305196 | |
| 25G 7/8, Hypodermic Needle | BD | REF 305124 | |
| 27G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305109 | |
| 30G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305106 | |
| Hearting Pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
- George, J. F., Pinderski, L. J., Litovsky, S., Kirklin, J. K. Of mice and men: mouse models and the molecular mechanisms of post-transplant coronary artery disease. J. Heart Lung Transplant. 24, 2003-2014 (2005).
- Koulack, J., McAlister, V. C., MacAulay, M. A., Bitter-Suermann, H., MacDonald, A. S., Lee, T. D. Importance of minor histocompatibility antigens in the development of allograft arteriosclerosis. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 273-277 (1996).
- Libby, P., Pober, J. S.
- Lorber, M. I., Wilson, J. H., Robert, M. E., Schechner, J. S., Kirkiles, N., Qian, H. Y., Askenase, P. W., Tellides, G., Pober, J. S. Human allogeneic vascular rejection after arterial transplantation and peripheral lymphoid reconstitution in severe combined immunodeficient mice. Transplantation. 67, 897-903 (1999).
- Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
- Mitchell, R. N.
- Mitchell, R. N. Graft vascular disease: immune response meets the vessel wall. Annu Rev Pathol. 4, 19-47 (2009).
- Nagano, H., Libby, P., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Stinn, J. L., Becker, G., Tilney, N. L., Mitchell, R. N. Coronary arteriosclerosis after T-cell-mediated injury in transplanted mouse hearts: role of interferon-gamma. Am. J. Pathol. 152, 1187-1197 (1998).
- Nagano, H., Mitchell, R. N., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Tilney, N. L., Libby, P. Interferon-gamma deficiency prevents coronary arteriosclerosis but not myocardial rejection in transplanted mouse hearts. J. Clin. Invest. 100, 550-557 (1997).
- Raisanen-Sokolowski, A., Glysing-Jensen, T., Koglin, J., Russell, M. E. Reduced transplant arteriosclerosis in murine cardiac allografts placed in interferon-gamma knockout recipients. Am. J. Pathol. 152, 359-365 (1998).
- Salomon, R. N., Hughes, C. C. W., Schoen, F. J., Payne, D. D., Pober, J. S., Libby, P. Human Coronary Transplantation-Associated Arteriosclerosis - Evidence for a Chronic Immune Reaction to Activated Graft Endothelial Cells. Am. J. Pathol. 138, 791-798 (1991).
- Scott, D. M., Ehrmann, I. E., Ellis, P. S., Chandler, P. R., Simpson, E. Why do some females reject males? The molecular basis for male-specific graft rejection. J. Mol. Med. 75, 103-114 (1997).
- Shimizu, K., Sugiyama, S., Aikawa, M., Fukumoto, Y., Rabkin, E., Libby, P., Mitchell, R. N. Host bone-marrow cells are a source of donor intimal smooth- muscle-like cells in murine aortic transplant arteriopathy. Nat. Med. 7, 738-741 (2001).
- Tellides, G., Pober, J. S.
- Tellides, G., Tereb, D. A., Kirkiles-Smith, N. C., Kim, R. W., Wilson, J. H., Schechner, J. S., Lorber, M. I., Pober, J. S. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
- Vassalli, G., Gallino, A., Weis, M., von Scheidt, W., Kappenberger, L., von Segesser, L. K., Goy, J. J. Alloimmunity and nonimmunologic risk factors in cardiac allograft vasculopathy. Eur. Heart J. 24, 1180-1188 (2003).
- Wang, Y., Bai, Y., Qin, L., Zhang, P., Yi, T., Teesdale, S. A., Zhao, L., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ. Res. 101, 560-569 (2007).
- Wang, Y., Burns, W. R., Tang, P. C., Yi, T., Schechner, J. S., Zerwes, H. G., Sessa, W. C., Lorber, M. I., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma plays a nonredundant role in mediating T cell-dependent outward vascular remodeling of allogeneic human coronary arteries. Faseb J. 18, 606-608 (2004).
- Yacoub-Youssef, H., Marcheix, B., Calise, D., Thiers, J. C., Benoist, H., Blaes, N., Segui, B., Dambrin, C., Thomsen, M. Chronic vascular rejection: histologic comparison between two murine experimental models. Transplant. Proc. 37, 2886-2887 (2005).
- Yokota, T., Shimokado, K., Kosaka, C., Sasaguri, T., Masuda, J., Ogata, J. Mitogenic activity of interferon gamma on growth-arrested human vascular smooth muscle cells. Arterioscler. Thromb. 12, 1393-1401 (1992).
- Yu, L., Qin, L., Zhang, H., He, Y., Chen, H., Pober, J., Tellides, G., Min, W. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting IFN-γ-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Cir. Res. 109, 418-427 (2011).
