Summary
私たちは、マウスのグラフトarteriosclerois（GA）は、同じ近交系のレシピエントにマウスの血管セグメントの介在を含むモデルのプロトコルを記述します。血管ドナーへの追加の遺伝的変化を交配することにより、モデルがGA上の特定の遺伝子の効果を評価することができる。
Abstract
また、同種移植片血管障害呼ば移植arteriosclerois（GA）は、全体のグラフト血管ツリーの拡散、周方向の狭窄によって特徴付け移植臓器に数ヶ月から数年にわたって開発して病的な病変である。 GAの病因の最も重要なコンポーネントは、内膜内の平滑筋様細胞の増殖です。ヒト冠状動脈セグメントは、免疫不全マウスの大動脈の腎外に介在されたとき、intimasは、ヒトT細胞の非存在下における動脈ドナー又は外因性ヒトIFN-γの同種養子移入ヒトT細胞に応じて拡大するかもしれない。このマウスモデルにおける急性細胞媒介性拒絶反応が完全に二から三内移植片からのすべてのドナー由来血管細胞を排除するため、別のマウス系統の受信者に1株からマウスの大動脈の介在は、ヒトにおける慢性拒絶反応のモデルとして限定されている週間。我々は最近、二つの新しいMを開発したこれらの問題を回避するためのモデルをウーズ。最初のモデルは、雄マウスから同じ近交系（C57BL/6J）のメスのレシピエントに血管セグメントの介在を必要とする。この場合の移植片拒絶は、Y染色体（男性に存在しますが、女性ではない）と、数週間のためにドナー由来の平滑筋細胞を維持するために十分に無痛ですすさまじいという拒絶反応によってコードマイナー組織適合抗原に対してのみ向けられている。番目のモデルは、マウスIFN-γ（マウスの感染を介して配信を投与続いIFN-γの受容体を欠い同じ系統、性別のホストマウスに野生型C57BL/6Jマウスドナーから動脈セグメントを介在関与アデノウイルスベクターとの肝臓は、ドナーとレシピエントマウスの両方が同じ系統及び性別であるが、宿主由来の細胞の受容体を欠損しながらドナー平滑筋細胞のサイトカインに応答して増殖、この場合には拒絶反応がありませんこのサイトカインは、応答しています。血管ドナーへの追加の遺伝的変化を交配することにより、両方のモデルは、GAの進行に対する特定の遺伝子の効果を評価するために使用することができる。ここで、私たちはマウスGAモデルの詳細なプロトコルを記述します。
Introduction
また、同種移植片血管障害と呼ばれる移植arteriosclerois（GA）は、全体のグラフト血管の木7の拡散、円周狭窄によって特徴付け移植臓器に数ヶ月から数年にわたって開発して病理学的病変である。初期段階では、このように、より密接に、従来のアテローム性動脈硬化症で見られる狭窄に似ている、動脈でより明白である偏心と焦点狭窄を引き起こす可能性があります。による宿主T細胞およびマクロファージの浸潤、特に細胞外マトリックスおよび平滑筋細胞様細胞由来の移植片の蓄積内膜の膨張から血管グラフト結果の内腔損失が不十分補償されるホストまたは両方5、13、19、外側の血管リモデリングによって。心臓同種移植片では、ほとんどの臨床的に重要な病変は、心外膜と心筋内冠動脈のものさ。最終的には、冠状動脈のGAは、虚血性心不全の原因となります。 GAは後半心臓GRの主要な原因である船尾損失。 GAの狭窄が強く、その病因に移植同種抗原に対する宿主応答が関与し、慢性拒絶3の形態としてGAを分類するために私たちをリードして、縫合線で停止。しかし、動脈損傷の他の形態は、傷害の正味の負担を増やすことを介して、または激化、および/または同種免疫応答を調節するのいずれかによって、GAのリスクを高める可能性があります。移植片動脈の内皮細胞（EC）裏地は、EC裏地に人間GAと隣接内膜の最も表面的な地域で保存されている最も重く宿主由来のIFN-γ産生T細胞およびマクロファージ11で潜入サイトです。で一部の患者は、GA、グラフトEC 16に結合するが、血管が急性抗体媒介性拒絶11の特徴であるフィブリノイド壊死の少し証拠を示すドナー固有同種抗体の開発に関連付けられています。
GAの病因の最も重要なコンポーネントですスムースの増殖筋様内膜内の細胞には、このプロセスが逮捕されることができれば、GAは進行することはほとんどありません。我々のグループからの以前の研究では、免疫不全マウスの外腎大動脈に介在ヒト冠状動脈セグメントのintimasこのプロセスは、ヒトIFNを中和することによって阻害されることを動脈ドナー同種養子移入ヒトT細胞に応答して展開していることを示していたγ18。さらに外因ヒトIFN-γはヒトT細胞15、17が存在しない場合に、これらの動脈移植片における内膜（および内側）血管平滑筋細胞（VSMC）増殖を引き起こす可能性があります。 （これは、注意することは重要だとヒトとマウスのIFN-γは、この実験系でマウスホスト上の間接的な影響を除外、種を越えていない）これらのヒト化マウスモデルはヒトT細胞/血管細胞の相互作用をrecapitulatingの利点を持っており、内膜病変は、主に、人間（ つまり移植片由来）細胞で構成されているとしては、臨床検体で観察されているが、彼らは、臨床移植病変に関わる宿主マクロファージおよびおそらく他の細胞型の役割を無視するので、彼らは、完全な臨床状況を要約するしないでください。このプロセスの従来のマウスモデルは、理論的に完全な宿主の免疫系に関与し、マウス遺伝子アプローチの電力をGAに適用することができるという追加の利点を提供することにより、ヒト化モデルの限界を補完し、この問題に対処することができる。二つの最も広く使用されているマウスモデルは、異所性心臓移植と同所移植動脈1を含む。人間の心臓移植片における動脈の内膜細胞が移植片の起源5、13、19の主であるのに対し異心移植片の動脈で開発病変は主として、骨髄由来の可能性が宿主細胞で構成されています。これは、別のマウスモデルを開発するために私たちをリードしてきた重要な違いです。の介在このマウスモデルにおける急性細胞媒介性拒絶反応が完全に二から三内移植片からのすべてのドナー由来血管細胞を排除するため、別のマウス系統の受信者に1株から、マウスの大動脈は、ヒトにおける慢性拒絶反応のモデルとして、さらに限られている週間19。その結果、介在血管セグメントで見られ、その後の変更は、診療所で発生する移植血管の変化のモデルとして限定された関連性の高い人為的な状況を作成、もっぱら脱細胞血管の足場を再作成している宿主細胞の応答である。我々は最近、これらの問題21を回避するために、2つの新しいマウスモデルを開発しました。最初のモデルは、雄マウスから同じ近交系（C57BL/6J）のメスのレシピエントに血管セグメントの介在を必要とする。第二のモデルは視聴を欠い同じ系統、性別のホストマウスに野生型C57BL/6Jマウスドナーから動脈セグメントを介在関与用eptor IFN-γ（IFN-γR-KO）は、マウスを投与続いIFN-γ（アデノウイルスベクターを用いたマウス肝臓の感染を介して配信。ここでは、詳細なプロトコルと私たちのマウスGAモデルの利点を説明します。
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Protocol
マウス同種移植と同系移植移植モデル
すべての動物実験は、エール大学の制度の動物のケアと使用委員会によって承認された。同種移植モデルでは、男性、4-5週齢のWT（C57BL/6J）またはIFN-γR-KOマウスから胸部大動脈のセグメントは、エンド·ツーを使って8-12週齢のWT、女性レシピエントの腹部大動脈に介在していたエンド顕微吻合技術（詳細は次を参照してください）。同系移植モデルでは、男性、4-5週齢のWTマウスから胸部大動脈のセグメントが男性の腹部大動脈に介在していた、古い8-12週IFN-γR1-KOは、エンドツーエンド顕微吻合技術を使用して。術後1週間では、動物は1×10 9 PFUでAd5.CMVマウスIFN-γまたはAd5.CMV-LacZを（Qbiogene）を静脈接種した。血清マウスIFN-γレベルが1でELISA（eBioscience社）により測定し、5週間アデノウイルス投与後。特定の動物はBrdUのを受け犠牲の前に2週間（Sigma-Aldrich社）で100 mg / kgを皮下。
エンドツーエンド顕微吻合法（ビデオはこの部分のために取られます）：
1。ドナー手順
- ケタミン（50 mg / kg体重）およびキシラジン（10 mg / kg体重）の腹腔内注射でドナーマウスを麻酔。
- 十分な麻酔を確保した後、仰臥位にトレイにX8-30倍率で手術用顕微鏡下でドナーマウスを置き、胸壁の準備のためにヨウ素準備パッドとアルコール準備パッドを使用しています。
- 心臓を露出するために肋骨と横隔膜を通して前胸壁を切開。
- 右心房を開き、25ゲージの針を10 mlのシリンジを使用してマウスをフラッシュするために左心室にヘパリン化（100 U / ml）の生理食塩溶液10mlを注入。
- 胸部大動脈の全長を露出させる心臓や肺を切除。
- 薬用、直接的な外傷を最小限にするために慎重に胸部大動脈を解剖電子識別、結紮および大動脈近く11-0縫合糸を使用した木材の枝を分ける。
- 一度胸部大動脈は、周囲の組織、移植のための消費税全体の胸部大動脈から自由である。
- （100 U / ml）のヘパリン加生理食塩水でドナー大動脈の切り口をフラッシュして、移植まで氷上で同じソリューション（最大6時間）に保管してください。
2。受信者の手順
- 鎮痛は、ipケトプロフェン（5 mg / kg体重）をレシピエントマウスを注入し、腹腔ケタミン（50 mg / kg体重）およびキシラジン（10 mg / kg体重）をマウスにthenanesthetize。レシピエントマウスは、60〜90分の間、10分以内に深く麻酔する。手術中に、麻酔のレベルは、鉗子を用いて前腹壁や足をつまんで15分毎に評価される。動物が手術中にいつでも有害な刺激に反応した場合、ケタミンおよびキシラジン（1/4または1/3元の用量）の追加の用量は、皮下又はイムによって投与される
- 十分な麻酔を確保した後、電気シェーバーを使用して前腹壁にファーを剃り落とす、、ヨウプレップパッドとアルコール準備パッドを使用して肌をきれいに眼軟膏を使用して目をカバーしています。手術中に、以下の無菌技術は、10％漂白剤で手術台を清掃滅菌手袋を着用し、滅菌したマイクロサージェリーの楽器を（操作の開始のための蒸気滅菌器具、その後ホットガラスビーズ滅菌使用を含め、業務に使用されます複数の操作など）の間での楽器。
- 仰臥位にトレイにX8-30の倍率で手術用顕微鏡下でレシピエントマウスを置きます。
- xyphoidから恥骨まで正中線で腹壁を切開し、腹腔を露出するために、マイクロリトラクターを使用して離れて腹壁を広げた。
- 上方に腸を撤回し、ガーゼで包んでは食塩水で湿らせた。レシピエントマウスは、HEAの損失によって冷やさなる外部化された腸を通してトン。これは、動物の暖かさを維持することが重要である。控えめな低体温症は、大動脈の血流の閉塞、ならびにマウス本体の下半分に欠けて血流に非効率的な熱伝達がある時に脊髄損傷の予防に有益であるしかし、加熱板が手術中に使用されない。
- 、下方に生殖器官を動かして生理食塩水ソリューション湿らせたガーゼでレシピエントマウスの腹部領域をラップし、腹部の右側に直腸を撤回するためにそれを使用。露出した組織は、移植時に生理食塩水で定期的に灌漑される。
- 遠ぶっきらぼう腎近位血管と大動脈分岐間大動脈大動脈のセグメントを分析し、慎重に下大静脈（IVC）から分離。
- 11-0ポリアミドモノフィラメント縫合糸を使用した腹部大動脈のこのセグメントから発信小さな枝をすべて特定し、結紮。
- のクロスクランプ孤立セグメント離れて近接5ミリメートル、各端に1つの2血管のクランプを使用しbdominal大動脈。
- 吻合サイトを作成する鋭いマイクロハサミを使用してクランプ間の腹部大動脈を横断する。
- ドナーの大動脈移植片を収容するために切開レシピエント大動脈のワンカット端から腹部大動脈（最長0.4ミリメートル）の小さなセグメントを切除。
- 残留している血液を除去しヘパリン加生理食塩水を用いて大動脈のクランプ間のセグメントを洗い流す。クランプとドナー大動脈移植の間に大動脈セグメントは、吻合時にヘパリン化（100 U / ml）を食塩水（最大40ミリリットル/キログラム）で定期的に灌漑されています。
- 移植のために、長さ2.5mmのセグメント移植片を作成するために鋭利なマイクロはさみでドナー大動脈の両面を横断する。
- エンドtと共に、それぞれ、腹部大動脈の受信者の近位端および遠位切断端にドナー移植片の近位端および遠位端を吻合、同所の位置にドナー大動脈グラフトを配置11-0ポリアミドモノフィラメント縫合糸を使用してOエンドパターン。
- 連続縫合のために、滞在3での縫合糸とまず9時の位置に配置します。グラフトの各側に2ステー縫合、吻合ランニング縫合糸を使用して3-4ステッチの両方でカットエッジ間、ダブルノットで縫合糸を滞在する実行縫合糸を結ぶ。閉鎖の両方の層が連続しているので、裂開のリスクが増大する。ドナーの大動脈グラフト腹部大動脈の受信者の近位および遠位の切断端を接続するために適切な長さにする必要があります。
- 中断された縫合糸は、3で4吻合を構築し、まず、移植片の両側で9時の位置、および移植片の各側に2滞在縫合の間に3-4のステッチの両方のカットエッジを吻合。
- 移植への逆流を可能にするために遠位クランプを解除し、出血部位を同定し、3分以内に追加のステッチを作る。
- 十分な止血を把握した後、近位クランプを解放。
- 腹部大動脈と下腸間膜動脈の遠隣接セグメントに、特に移植における活発な脈動とネイティブ腹部大動脈の近位隣接セグメントの存在によって、グラフト開存性を確認してください。脈動は、血流の回復後、数分以内に減少する場合、吻合部位に血栓症を考えてみましょう。
- 腹腔内に腸を返します。
- それぞれ、筋層と皮膚層に5-0ナイロン縫合糸を用いて腹壁を閉じて縫合する。
- 加熱パッドの上にきれいなケージにレシピエントマウスを置き、意識を取り戻すと、麻酔から回復するためにマウスで1〜2時間待ちます。これは、リカバリ中に動物の適切な暖かさを維持することが重要である。麻酔から動物ウェイク前に暖かく、乾燥したケージにマウスを保管してください。
- マウスの回復後、再び第二日目に後肢の運動機能を評価する。成功した移植手術が確認される私fの後肢のない機能不全は、第二日目のレシピエントマウスで観察されていません。
- 48時間のために飲料水にケトプロフェン（5 mg / kg体重/ D = 27 UG / mlの飲料水で）とレシピエントマウスを管理します。新郎、異常束ね姿勢などへの移動性、失敗の損失によって証明されるように任意のレシピエントマウスは術後の鎮痛薬で単調な痛みに苦しんでいる場合、それらは安楽死されます。動物は1-60日後に事前定義されたエンドポイントで安楽死されます。
移植分析
同種移植片の動脈移植片は（5週間ウイルス感染後）6週間術後だっ同系移植モデルで4週間と移植で調達とエラスチカ-ワンギーソン（EVG）染色、ヘマトキシリンおよびエオシン（HE）のための標準的な組織学的手法により解析した染色および免疫蛍光染色。写真は免疫蛍光顕微鏡システム（ツァイス）を用いて撮影した。正の免疫染色に囲ま核の細胞計数は実行だった高倍率下でのエドとは、それぞれの移植のために5断面から平均した。管腔のグラフト面積測定（内皮以内）、内膜（内皮と内弾性板との間には、IEL）、メディア（IELと外弾性板との間に、EEL）、壁厚（内皮と外弾性板との間）全体容器（EEL以内）コンピュータ支援画像解析とNIHイメージ1.60（使用して、それぞれの移植のために離れて5連続断面、150μmのから計算されたhttp://rsbweb.nih.gov/nih-imageを ）。
統計分析
全てのデータは平均±SEMとして表される。両側検定、対応のあるtテスト、双方向ANOVA分析をPrismソフトウェア·プログラム（グラフパッド·ソフトウェア）を用いて行った。 P <0.05との差が統計的有意性を示すと考えられた。
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Representative Results
マウス同種移植片動脈硬化（GA）モデル ：このモデルでは、男性ドナー大動脈は、ホストが上に発現マイナーY抗原（男性特有のマイナー組織適合抗原HY）に対するアロ反応性T細胞媒介同種免疫応答を誘導するように、女性レシピエントに移植する移植12、ひいてはT細胞IFN-γを産生ドライブ他の同種移植モデル2、6で観察されたように血管平滑筋細胞増殖20、8-10、14。ドナーの男性から胸部大動脈のセグメントは、外科的にメスの受信者の腹部大動脈に介在され、大動脈を4週間後に移植（ 図1A）で収穫した。動脈移植片の組織学的分析はエラスチカ-ワンギーソン（EVG）、H＆Eによって行われ、血管平滑筋細胞マーカーSMAと汎白血球マーカーCD45による免疫染色された。いいえ移植片拒絶は、大動脈移植におけるC57BL/6J雄マウス間で認められなかった。女性transplantatオス白血球とVSMCの蓄積（ 図1B）と新生内膜形成の浸潤を特徴とイオン誘発GA、。 WTまたはIFN-γR-KOマウスからGA、大動脈におけるIFN-γシグナル伝達の役割を決定するためにはWT女性レシピエントに移植された。ドナー移植片におけるIFN-γRの欠失（図示せず）WTと比較して、SMA陽性細胞が減少して白血球および新生内膜形成の減少浸潤を示した。以前にヒト化マウス異種移植モデル4、15、17、18で観察されたように、これらの結果は、GAの進行中のIFN-γシグナル伝達のために重要な役割をサポートしています。
IFN-γグラフト動脈硬化症 ：これは、IFN-γaloneヒト化マウスモデルGA 15,17の新生内膜形成を誘導するのに十分であることが確立されている。ここでは、IFN-γ-媒介マウス同系移植片動脈硬化モデルを確立した。このモデルでは、WTの男性の大動脈は、移植したマウスIFN-γ導入遺伝子（AD-IFN-γ）、またはコントロールのLacZ遺伝子（AD-LacZのを）（ 図2A）をコードする複製欠損アデノウイルスの静脈注射が続くIFN-γR欠損レシピエントマウスに。のAd-LacZを肝感染と肝導入遺伝子の発現は、AD-LacZのグループ内にX-gal染色により確認したがないようのAd-IFN-γのグループが以前に17を説明した。血清中のIFN-γの全身式は3日目に120から150 ngの/ mlののレベルで検出とAd-IFN-γはなくLacZの群では5週間まで保持された。大動脈は、5週間組織学的分析と動脈移植片内膜、メディア、ルーメンと血管領域の形態学的評価のためのアデノウイルスの注射後に収穫した。の発現はIFN-γはなく、LacZを制御、誘導された新生内膜形成。白血球の浸潤は明らかな同種移植片モデル（ 図2B）と比較して検出されなかった。これらのデータは、前回と一致している単独でIFN-γは、新生内膜形成15,17を誘導するのに十分であることをヒト化マウス異種移植モデルでの観測。
図1。イラストレーションとマウスの同種移植片の動脈移植モデルのスキーム。同種移植手順のA.は実例。ドナーの男性の胸部大動脈のセグメントは、外科的にメスの受信者に腹大動脈に介在していた。大動脈は、4週後、移植時に採取した。対照として、男性ドナー胸部大動脈のセグメントは、外科的に男性レシピエントにおける腹部大動脈に介在していた。Bは 。抗-SMAと抗CD45とエラスチカ-ワンギーソン（EVG）、H＆Eと免疫染色によって動脈移植片の組織学的分析。代表的な顕微鏡写真が示されている。矢じりは、メディアから内膜の輪郭を描くための内部弾性板をマーク。スケールバー：50ミリメートル。いいえ移植片動脈硬化症は、男性グループに男性に見られなかった。
図2。 IFN-、γ-誘発マウス同系動脈移植モデル。 A. IFN-γ誘発マウス同系モデルのスキーム。男性ドナー胸動脈を雄受け手IFN-γRKOマウスで解剖し、腹部大動脈に移植されました。一週間後の手術は、1×10 9 PFUのAd-mIFN-γまたはAd-LacZのは、頸静脈を介したレシピエントマウスに注入した。血清3日目、7および35 IFN-γ測定のためのウイルスの注射後に回収した。グラフトは、形態学的評価のために6週間採取した。Bは 。抗α-SMAと抗CD45と免疫染色によって動脈移植片の組織学的分析。代表的な顕微鏡写真が示されている。矢じりは、メディアから内膜の輪郭を描くための内部弾性板をマーク。スケールBAR：50ミリメートル。いいえ移植片動脈硬化は、LacZの群では認められなかった。
| 手順 | 問題 | 考えられる理由 | ソリューション |
| 2.17 | 重度の出血 | ギャップ（2針間の距離）が中断された縫合糸特に、大きすぎる。 | 毎2針間の距離は、吻合時に均一である必要があります。 サイトを出血に一つのステッチを追加。 |
| 唯一の外膜がステッチされています。 | 全体の大動脈壁の識別とステッチ | ||
| ライゲーションされなかった木材の枝 | 木材の枝を結紮 | ||
| あまりにもヘパリンを使用する | 4までの使用0ミリリットル/ kgのヘパリン化（100 U / ml）を吻合中に手術フィールドを灌漑するために食塩水。 | ||
| 2.19 | 血栓症 | 管腔は、縫合糸の連続特に、吻合部位に狭すぎる。 | 各ステッチであまりにも多くの大動脈壁を吻合することは避けてください。 マウスの大動脈の大きさは非常に小さい。吻合時にステッチするには余りにも多くの大動脈壁は、しかし、ステッチにあまりに少ない大動脈壁は重度の出血になり、内腔が狭く、血栓症が発生します。 |
| 反対側の大動脈壁を通して縫合糸を通過。 | 大動脈壁を識別してから、ステッチを作ること。それが起こった場合、オペレータは、このサイトで縫合糸の結び目と再ステッチを切断する必要があります。 | ||
| 内皮細胞は、吻合中に負傷している。 | 吻合のための滞在縫合糸を使用した。用することによって全体arotic壁を絞る/保持しないでください吻合用CEPS。 | ||
| ヘパリンは吻合中に使用されていません。 | マウスの大動脈の大きさは非常に小さい。それは吻合後の移植片における血栓形成のための非常に簡単です。手術フィールドを灌漑するヘパリンを与えることは血栓症を減少させるために非常に重要です。マウスにおける血管移植の成功率はヘパリンおよびヘパリンの使用に95〜100％を使用せずに50％程度である。 血栓症は、血流の回復後数分以内に検出された場合、血栓を除去する別のアプローチは、IVCを介し30-50 ulのheparinied食塩水（100 U / ml）を注入することである。ただ重度の出血の場合にはあまりにも多くのヘパリンを注入しないでください。 | ||
| 2.23 | 移植に失敗しました | 遅延出血や血栓症、または他 | マウスの大動脈のサイズが非常に小さいために、マウスにおける血管移植は非常に困難な外科手術である。 3つの重要なポイがあります手術の成功のためにNTS：1）ホストとドナーの大動脈壁は単に重度の出血の場合には、明らかに隙間なく一緒に吻合されていることを確認し、2）だけで血栓症の場合には、吻合部で十分な内腔の空間を保つ、3）使用吻合時の右用量におけるヘパリン、血栓症、重度出血の念。このプロトコルに従って、著者の成功率が95％以上である。 |
表1。テーブルのトラブルシューティング。
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Discussion
記載されているプロトコルは、マウスGAモデルに焦点を当てている。手順は、他のグラフト移植モデルに適用することができる。これらのモデルは、ヒト異種移植（ つまり人間の冠動脈セグメントは免疫不全マウスの赤外線腎大動脈に介在する）、および急性拒絶反応のマウスGAモデル（ すなわち別の遺伝系統の受信者への1つの遺伝的系統からマウス大動脈）が含まれています。私たちの説明マウスモデルは、ヒトGA病変を閉じもっとある。最初のモデルは、雄マウスから同じ近交系（C57BL/6J）のメスのレシピエントに血管セグメントの介在を必要とする。この場合の移植片拒絶は、Y染色体にコードされるマイナー組織適合抗原に対してのみ向けられ（男性が、女性ではないに存在する）とすさまじい拒否応答は2、6数週間のためにドナー由来の平滑筋細胞を維持するために十分に無痛です、8-10、12、14。第二のモデルは動脈segmeを介在関与IFN-γ（IFN-γR-KO）の受容体を欠い同じ系統、性別のホストマウスに野生型C57BL/6JマウスドナーからのNTは、マウスを投与続いIFN-γ（マウスの感染を介して配信アデノウイルスベクターを用いた肝臓。）両方のドナーとレシピエントマウスは同じ系統と性別であるが、宿主由来しながらドナー平滑筋細胞がサイトカインに反応して細胞を、このサイトカインのために不足している受容体を、増殖するように全く拒絶はこのケースではありません21応答しない。また、血管ドナーに追加の遺伝的変化を交配することにより、両方のモデルは、IFN-γドリブン平滑筋細胞の増殖およびGAの進行に対する特定の遺伝子の効果を評価するために使用することができる。
マウスGAモデルにおけるIFN-γの役割は十分に確立されていない。当社の2つのマウスモデルでは、マウスGAにおけるIFN-γの役割を確認しました。最初のモデルでは、男性ドナー大動脈女性レシピエントに移植するホストは、移植12日に表明し、男性特有のマイナー組織適合抗原HYに対してアロ反応性T細胞媒介同種免疫応答を誘導するようにします。確かに、C57BL/6J雌の移植誘発GAへWT（C57BL/6J）男性は、白血球とVSMC蓄積と新生内膜形成の浸潤によって特徴。これとは対照的に、男性の大動脈移植への男性はGAを誘導しない。私たちは、WT女性レシピエントに移植ドナー移植片としてIFN-γR-KOを使用することによって血管細胞におけるIFN-γシグナル伝達の役割を決定した。ドナー移植片におけるIFN-γRの削除は新生内膜における白血球浸潤とVSMC蓄積を鈍化。したがって、現在のマウスモデルにおけるIFN-γの役割は、IFN-γは、グラフトにおけるシグナリングヒト化マウス異種移植移植モデルと一致しているGAの進行4、15、17、18のために重要である。 IFN-γ単独ではIFN-γ-メディを作成することにより、新生内膜形成を誘導するのに十分であるならば、我々は決定atedマウス同系移植片動脈硬化モデル。このモデルでは、雄の大動脈は、マウスIFN-γその後全身マウスIFN-γ導入遺伝子（AD-IFN-γをコード複製欠損アデノウイルスの静脈内注射することにより表現される男性IFN-γR-KOのレシピエント動物に移植する）。私たちは、IFN-γはなく、LacZを制御、誘導された新生内膜形成の発現を観察した。このモデルでは、白血球の明らかな浸潤が、同種移植片モデルと比較して、単独で血管IFN-γシグナリングは白血球の非存在下で新生内膜形成を誘導するのに十分であるヒト動脈-SCIDマウス移植モデルにおいて以前の観察と一致して検出されない15、17。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作業は、WMとLYにAHA 9320033NにNIHの助成金R01 HL109420によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks) |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml) |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml) |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml) |
| Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) | CareFusion | AL4109 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | To prepare the anesthetic |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Microscope | Leica | MZ95 | |
| Micro Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5693 | |
| Spring Scissors | F.S.T | 15009-08 | To transect the aorta of donor or recipient |
| Extra Narrow Scissors | F.S.T | 14088-10 | |
| Needle Holder/Forceps | MICRINS | MI1542 | To hold the needle |
| Fine Forceps | F.S.T | 11254-20 | |
| Forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Forceps | F.S.T | 13011-12 | |
| LANCASTER Eye Speculum | Zepf Medical Instruments | 42-1209-07 | |
| Micro Vascular Clip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6472 | |
| Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5440 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture | AROSurgical Instruments Corporation | Cat #T4A10Q07 | 10-0 suture, Needle=70 microns |
| Black Monofilament Nylon Suture | Syneture (Covidien) |
SN-1956 | 6-0 suture |
| Non-Woven Songes | McKesson Corp. | Reorder No. 94442000 | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | REF 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 18G 1 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305196 | |
| 25G 7/8, Hypodermic Needle | BD | REF 305124 | |
| 27G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305109 | |
| 30G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305106 | |
| Hearting Pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
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