Summary
Descrevemos os protocolos para nossos arteriosclerois enxerto do mouse (GA) modelos que envolvem a interposição de um segmento de vaso do mouse em um receptor da mesma linhagem consanguínea. Por recruzá alterações genéticas adicionais no recipiente dador, o modelo pode determinar o efeito de genes específicos em GA.
Abstract
Arteriosclerois enxerto (GA), também chamado de doença vascular do enxerto, é uma lesão patológica que se desenvolve ao longo de meses ou anos em órgãos transplantados caracterizadas por difusa, estenose circunferencial de toda a árvore vascular do enxerto. O componente mais crítico do GA patogênese é a proliferação de células musculares lisas, como dentro da íntima. Quando um segmento da artéria coronária humana é interposta na aorta infra-renal de ratos imunodeficientes, o INTIMAS poderia ser expandir em resposta a células T humanas adoptivamente transferidos para o dador alogénico artéria ou humana exógena do IFN-γ na ausência de células T humanas. A interposição de uma aorta do rato a partir de uma estirpe para outra estirpe de ratinho receptor é limitado como um modelo para a rejeição crónica em seres humanos, porque a resposta de rejeição mediada por células aguda neste modelo de ratinho elimina completamente todas as células vasculares dos doadores derivados do enxerto dentro de duas a três semanas. Recentemente, desenvolveu dois novos mOuse modelos para contornar esses problemas. O primeiro modelo envolve a interposição de um segmento de vaso a partir de um rato macho em uma fêmea receptora da mesma estirpe consanguínea (C57BL/6J). Rejeição de enxerto, neste caso, é dirigido apenas contra os antigénios de histocompatibilidade menor codificadas pelo cromossoma Y (presente no sexo masculino, mas não a do sexo feminino) e a resposta de rejeição que se segue é suficientemente indolentes para preservar as células musculares lisas derivadas de doadores durante várias semanas. O segundo modelo envolve a interposição de um segmento da artéria de um tipo selvagem C57BL/6J rato doador em um rato hospedeiro da mesma estirpe e sexo que falta o receptor para o IFN-γ seguido por administração de ratinho de IFN-γ (entregue via infecção do ratinho fígado, com um vector adenoviral. Não existe rejeição neste caso como dador e ratinhos receptores são da mesma estirpe e sexo, mas as células do músculo liso dos doadores proliferar em resposta à citoquina, enquanto células hospedeiras derivadas de, por falta de receptoresessa citocina, não respondem. Por recruzá alterações genéticas adicionais no dador embarcação, os dois modelos podem ser utilizados para avaliar o efeito de genes específicos em progressão GA. Aqui, descrevemos os protocolos detalhados para os nossos modelos GA rato.
Introduction
Arteriosclerois prótese (GA), também chamadas de doença vascular do enxerto, é uma lesão patológica, que se desenvolve ao longo de meses ou anos em órgãos transplantados caracterizadas por difuso, estenose circunferencial da árvore vascular do enxerto inteiro 7. Os estágios iniciais pode causar obstruções excêntricas e focal, que são mais evidente nas artérias, assim, assemelha-se mais estreitamente estenoses visto na aterosclerose convencional. A perda luminal dos vasos enxertados resultados de expansão da íntima devido à infiltração de células T do hospedeiro e os macrófagos e, especialmente, a uma acumulação de matriz extracelular e de músculo liso, tal como as células provenientes de enxerto, central ou ambos 5, 13, 19, que não está suficientemente compensada pela remodelação navio para fora. Em aloenxertos cardíacos, as lesões mais clinicamente significativas são aquelas nas artérias coronárias epicárdicas e intramio. Em última análise, GA das artérias coronárias irá causar insuficiência cardíaca isquémica. GA é a principal causa de gr cardíaca tardeperda de popa. As estenoses de GA parar nas linhas de sutura, implicando fortemente a resposta do hospedeiro à aloantigenes enxerto em sua patogênese e que nos leva a classificar GA como uma forma de rejeição crônica 3. No entanto, outras formas de lesão arterial pode aumentar o risco de GA, quer através do aumento da carga líquida de lesão ou através da intensificação e / ou modulação da resposta aloimune. A célula (CE) revestimento endotelial das artérias do enxerto é preservada no GA humano e as regiões mais superficiais da intima adjacente ao forro CE é o sítio mais fortemente infiltrado pelo hospedeiro derivado de IFN-γ produtoras de células T e macrófagos 11, em alguns pacientes GA está associada com o desenvolvimento de aloanticorpos específicos do dador que se ligam ao enxerto CE 16, mas os vasos mostram pouca evidência de que a necrose fibrinoide que é característico da rejeição mediada por anticorpos aguda 11.
O componente mais crítico do GA patogênese é aproliferação de células de músculo liso, como dentro da íntima, se este processo pode ser preso, GA é improvável a progredir. Trabalho prévio do nosso grupo mostraram que INTIMAS de segmentos de artérias coronárias humanas interposta em aortas de infra-renal de ratinhos imunodeficientes expandir em resposta a células T humanas alogénicas adoptivamente transferidos para o dador artéria e que este processo pode ser inibido por neutralização do IFN-humano γ 18. Além disso humana exógena do IFN-γ poderia causar íntima (e medial) proliferação de células de músculo liso (VSMC) em vascular destes enxertos arteriais, na ausência de células T humanas 15, 17. (É importante notar que o ser humano e do rato IFN-γ não cruzar espécies, excluindo efeitos indiretos sobre o anfitrião mouse neste sistema experimental.) Estes modelos humanizados rato tem a vantagem de recapitular célula T humana / interações de células vasculares e íntima As lesões são em grande parte composta de células humanas (por exemplo, derivada do enxerto),como tem sido observado nas amostras clínicas, mas não totalmente recapitular a situação clínica porque ignoram o papel dos macrófagos do hospedeiro e, possivelmente outros tipos de células envolvidos na lesão de transplantes clínicos. Um modelo de rato convencional, este processo poderia, teoricamente, resolver este problema, complementando as limitações do modelo humanizado, que envolve um sistema imunitário do hospedeiro completa e proporcionar a vantagem adicional de permitir que a alimentação de abordagens genéticas do rato para ser aplicado a GA. Os dois modelos de mouse mais amplamente utilizados envolvem transplante cardíaco heterotópico e ortotópico transplante de artéria 1. As lesões que se desenvolvem nas artérias dos enxertos cardíacos heterotópicos são em grande parte composta de células hospedeiras, provavelmente de origem medula óssea, enquanto que as células da camada íntima das artérias em enxertos cardíacos humanos são predominantemente de origem enxerto de 5, 13, 19. Esta é uma distinção significativa que nos levou a desenvolver modelos alternativos de rato. Interposição deuma aorta do rato a partir de uma estirpe para outra estirpe de ratinho receptor é ainda mais limitado, como um modelo para a rejeição crónica em seres humanos, porque a resposta de rejeição mediada por células aguda neste modelo de ratinho elimina completamente todas as células vasculares derivadas do doador do enxerto dentro de duas a três 19 semanas. Por conseguinte, as alterações subsequentes visto no segmento do vaso interposta são unicamente uma resposta de células hospedeiras que têm o repovoados descelularizado navio andaime, criando uma situação altamente artefactual de relevância limitada como um modelo para as alterações nos vasos de enxerto que ocorrem na clínica. Nós recentemente desenvolveu dois novos modelos de mouse para contornar esses problemas 21. O primeiro modelo envolve a interposição de um segmento de vaso a partir de um rato macho em uma fêmea receptora da mesma estirpe consanguínea (C57BL/6J). O segundo modelo envolve a interposição de um segmento de artéria de um tipo selvagem C57BL/6J camundongo doador em um rato anfitrião da mesma linhagem e sexo que não tem a receptor para IFN-γ (IFN-γR-KO), seguido por administração de ratinho de IFN-γ (entregue via infecção do fígado do ratinho com um vector de adenovírus. Aqui, descrevemos protocolos detalhados e as vantagens dos nossos modelos GA rato.
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Protocol
Rato do enxerto e modelo de transplante de enxerto singênico
Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e comitês de uso, da Universidade de Yale. Para o modelo do enxerto, segmentos da aorta torácica do homem, 4-5 semanas de idade WT (C57BL/6J) ou IFN-γR-KO foram interpostas na aorta abdominal do receptor do sexo feminino, 8-12 semanas de idade WT com um fim-de -end técnica de anastomose microcirúrgica (ver ao lado para mais detalhes). Para o modelo de enxerto singênico, segmentos da aorta torácica de homens, 4-5 semanas camundongos WT idade foram interpostas na aorta abdominal de macho, 8-12 semanas de idade IFN-γR1-KO usando uma técnica de anastomose microcirúrgica end-to-end. Em 1 semana pós-operatória, os animais foram inoculados com Ad5.CMV iv-murganho IFN-γ ou Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) a 1 x 10 9 UFP. Soro de ratinho de IFN-γ foram medidos por ELISA (eBioscience) em 1 e 5 semanas após a administração de adenovírus. Alguns animais receberam BrdU(Sigma-Aldrich) a 100 mg / kg sc, durante 2 semanas antes do sacrifício.
End-to-end técnica de anastomose microcirúrgica (Video será levado para esta parte):
1. Procedimento doador
- Anestesiar os ratinhos dadores com injecções intraperitoneais de cetamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg).
- Depois de assegurar a anestesia adequada, coloque os ratos doadores sob o microscópio cirúrgico em X8-30 ampliação em uma bandeja em uma posição supina, e usar iodo Prep Pad e Prep Álcool Pad para a preparação da parede torácica.
- Faça uma incisão na parede anterior do tórax através das costelas e diafragma para expor o coração.
- Abra o átrio direito, injecta-se 10 ml de heparina (100 U / ml), solução salina no ventrículo esquerdo para lavar os murganhos utilizando uma seringa de 10 ml com uma agulha de calibre 25.
- Ressecar o coração e os pulmões para expor todo o comprimento da aorta torácica.
- Dissecar a aorta torácica com cuidado para minimizar o trauma direto, while identificar, ligadura e dividir os ramos de madeira, utilizando 11-0 sutura perto da aorta.
- Uma vez que a aorta torácica é livre de tecido circundante, consumo de toda a aorta torácica para transplante.
- Lave a extremidade cortada da aorta do doador com heparina (100 U / ml), solução salina, e armazená-la na mesma solução em gelo (até 6 horas), até ao transplante.
2. Procedimento Destinatário
- Injectar os ratinhos receptores com ip cetoprofeno (5 mg / kg) para a analgesia, e thenanesthetize os ratinhos ip com cetamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Os ratinhos receptores são anestesiados profundamente dentro de 10 minutos para uma duração de 60-90 min. Durante a cirurgia, o nível de anestesia é avaliada a cada 15 min, apertando a parede abdominal anterior utilizando uma pinça ou o pé. Se o animal reage aos estímulos nocivos a qualquer momento durante a cirurgia, uma dose adicional de cetamina e xilazina (1/4 ou 1/3 da dose inicial) será administrado por via sc ou im
- Depois de assegurar a anestesia adequada, raspar a pele na parede abdominal anterior usando um barbeador elétrico, limpe a pele com iodo Prep Pad e Álcool Prep Pad, cobrir os olhos com pomada oftálmica. Durante a cirurgia, as seguintes técnicas assépticas será utilizada para as operações de limpeza, incluindo a mesa de operações com lixívia a 10%, com luvas estéreis e utilizando instrumentos de microcirurgia (instrumentos esterilizados a vapor esterilizado durante o início da operação, depois de vidro quente talão esterilizado instrumentos entre várias operações, etc.)
- Colocar os ratinhos receptores sob o microscópio de exploração com uma ampliação de X8-30 num tabuleiro numa posição supina.
- Faça uma incisão na parede abdominal na linha média a partir de xifóide até púbis, e espalhar a parede abdominal distante usando um micro-retractor para expor a cavidade abdominal.
- Recolha os intestinos superiormente e enrole com uma gaze umedecida com solução salina. Os ratos receptores ficam refrigerados pela perda de heat através intestinos externalizados. É importante manter o calor animal. No entanto, a placa de aquecimento não é usado durante a cirurgia como hipotermia modesta é benéfica na prevenção da lesão espinhal durante a oclusão do fluxo sanguíneo na aorta assim como existe uma transferência de calor ineficaz com ausência de fluxo sanguíneo para a metade inferior do corpo de ratos.
- Mova os órgãos reprodutivos inferiormente, envolva as áreas no abdômen de ratos destinatário com solução salina, gaze umedecida, e usá-lo para retirar o reto para o lado direito do abdômen. Os tecidos expostos são irrigados periodicamente com soro fisiológico durante o transplante.
- Dissecar sem rodeios um segmento da aorta infra-renal entre o vaso renal proximal e distal da bifurcação aórtica e separar-se da veia cava inferior (IVC) cuidadosamente.
- Identificar e ligar todos os ramos pequenos provenientes deste segmento de aorta abdominal utilizando 11-0 poliamida monofilamento sutura.
- Clampeamento do segmento isolado de umaorta bdominal usando dois grampos vasculares aproximadamente, 5 mm entre si, um em cada extremidade.
- Transecto da aorta abdominal entre os grampos afiados usando micro-tesoura para criar os sites de anastomose.
- Ressecção de um pequeno segmento de aorta abdominal (até 0,4 mm de comprimento) a partir de uma extremidade cortada da aorta destinatário seccionado para acomodar a prótese aórtica doador.
- Lave os segmentos da aorta, entre grampos utilizando solução salina heparinizada para remover o sangue residual. Os segmentos de aorta entre grampos e o dador do enxerto aórtico são periodicamente irrigada com (100 U / ml), solução salina heparinizada (até 40 ml / kg) durante a anastomose.
- Transecão ambos os lados da aorta do doador com micro-tesoura afiada para criar um segmento de enxerto de 2,5 mm de comprimento para a transplantação.
- Coloque a prótese aórtica doador em posição ortotópica, anastomose da extremidade proximal e distal do enxerto doador para proximal e distal de extremidade cortada do destinatário da aorta abdominal, respectivamente, com um fim-to padrão-end usando 11-0 poliamida monofilamento sutura.
- Para as suturas contínuas, coloque as suturas de ancoragem em 3 e 09:00 posições em primeiro lugar. Entre duas suturas estadia em cada lado do enxerto, anastomose ambas as bordas cortadas em 3-4 pontos com as suturas em execução e amarrar as suturas correndo para suturas com um nó duplo. Uma vez que ambas as camadas de fecho são contínuos, o risco de deiscência é aumentada. O enxerto da aorta do doador deve ser de comprimento apropriado para conectar proximal e distal extremidade cortada do destinatário da aorta abdominal.
- Para as suturas interrompidas, construir quatro anastomose em 3 e 09:00 posições em ambos os lados do enxerto em primeiro lugar, e anastomosar ambas as bordas cortadas em 3-4 pontos entre duas suturas estadia em cada lado do enxerto.
- Solte a braçadeira de distal para permitir que o fluxo retrógrado em enxerto, identificar os locais de sangramento e fazer pontos adicionais dentro de 3 minutos.
- Depois de verificar a hemostasia satisfatória, solte a braçadeira proximal.
- Confirma a perviedade do enxerto pelo presença de pulsação vigorosa no enxerto e o segmento adjacente proximal da aorta abdominal nativa, em particular, no segmento adjacente da aorta abdominal distai e na artéria mesentérica inferior. Considere trombose em locais de anastomose se a pulsação diminuir dentro de alguns minutos após a restauração do fluxo sanguíneo.
- Retorno dos intestinos para a cavidade abdominal.
- Sutura fechar a parede abdominal com fio de nylon 5-0 na sutura da camada muscular e camada de pele, respectivamente.
- Colocar os ratinhos receptores em uma gaiola limpa em cima de uma almofada de aquecimento, e esperar 1-2 horas para que os ratos a recuperar a consciência e recuperar da anestesia. É importante manter a animais durante a recuperação de calor adequado. Mantenha os ratos na gaiola quente e seco antes de wake animais da anestesia.
- Avaliar a função motora dos membros posteriores após a recuperação ratos, e novamente no segundo dia. A cirurgia de transplante bem sucedido será confirmada if sem disfunção dos membros posteriores é observada em ratinhos receptores no segundo dia.
- Administrar os ratinhos receptores com cetoprofeno em água potável (5 mg / kg / d = 27 ug / ml em água potável) durante 48 horas. Se algum camundongos receptores sofrem de dor não aliviada pelo uso de analgésicos no pós-operatório como evidenciado pela perda de mobilidade, a falta de noivo, anormal agrupados postura, etc, eles serão sacrificados. Os animais serão sacrificados aos predefinidos fim-pontos depois de 1-60 dias.
Análise do enxerto
Enxertos de artéria do enxerto foram adquiridos em 4 semanas e enxertos no modelo de enxerto singênico foram seis semanas de pós-operatório (5 semanas após a infecção viral) e analisados por técnicas histológicas padrão para Elastica-van Gieson coloração (EVG), hematoxilina e eosina (HE) e coloração de imunofluorescência. Imagens foram feitas usando um sistema de microscópio de imunofluorescência (Zeiss). A contagem das células de núcleo rodeado por imunocoloração positiva foi executared em alta ampliação e média de cinco cortes transversais para cada enxerto. As medições do lúmen (dentro do endotélio), íntima (entre o endotélio e lâmina elástica interna, IEL), meios (entre o LIE e lâmina elástica externa, EEL), a espessura da parede (entre o endotélio e lâmina elástica externa) da área de enxerto e navio inteiro (dentro da EEL) foram calculados a partir de 5 de série transversais, 150 mM de distância para cada enxerto, usando análise de imagem assistida por computador e NIH Imagem 1,60 ( http://rsbweb.nih.gov/nih-image ).
A análise estatística
Todos os dados são expressos como média ± SEM. Bicaudal, teste t pareado e uma análise de variância de dois fatores foram realizadas utilizando o programa Prism (GraphPad Software). Diferenças com P <0,05 foram considerados para indicar significância estatística.
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Representative Results
Arteriosclerose modelo de rato de aloenxerto (GA): Neste modelo, uma aorta dador é transplantado para macho fêmea receptora, para que o hospedeiro de célula T induz respostas mediadas pelo aloimunes alorreativas contra um antigénio Y menor (antigénio de histocompatibilidade menor do HY-específica do sexo masculino), expresso em o enxerto 12, e por sua vez, produzido por células T IFN-γ unidades proliferação de VSMC 20 como observado em outros modelos de transplante de aloenxerto de 2, 6, 8-10, 14. Um segmento de aorta torácica de um dador masculino foi interposta cirurgicamente em uma aorta abdominal de uma fêmea receptora e aortas foram colhidas às 4 semanas pós-transplante (Figura 1A). A análise histológica do enxerto de artéria foi realizada por Elastica-van Gieson (EVG), H & E e imunocoloração com VSMC SMA marcador e marcador pan-leucócitos CD45. Não foi observada a rejeição do enxerto entre camundongos C57BL/6J machos no transplante de aorta. Macho para fêmea transplantatião induzida GA, caracterizada por infiltração de leucócitos e a formação da neointima com a acumulação de VSMC (Figura 1B). Para determinar o papel do IFN-γ sinalização em GA, aortas de WT ou IFN-γR-KO foram transplantados para ratinhos fêmea WT destinatário. Supressão de IFN-γR em enxertos de dadores exibiram uma diminuição da infiltração de leucócitos e a formação da neointima com diminuições de células-SMA positivos em comparação com WT (não mostrado). Estes resultados apoiam um papel crítico para o IFN-γ de sinalização na progressão GA como previamente observado no rato humanizado modelo de transplante de xenoenxerto de 4, 15, 17, 18.
Arterioesclerose de enxerto de IFN-γ induzida: Foi estabelecido que o IFN-γalone é suficiente para induzir a formação da neoíntima em um modelo de rato humanizado GA 15, 17. Aqui, estabelecido um modelo de arteriosclerose IFN-γ mediada rato singeneico enxerto. Neste modelo, a WT aortas do sexo masculino foram transplantadasem ratinhos receptores de IFN-γR deficientes seguido de injecção intravenosa de deficiente em replicação de adenovírus que codifica para o rato do transgene de IFN-γ (Ad-IFN-γ) ou o gene de LacZ de controlo (Ad-LacZ) (Figura 2A). Infecção hepática ea expressão do transgene fígado de Ad-LacZ foi verificada pela coloração de X-gal no grupo Ad-LacZ mas não os Ad-IFN-γ grupos como descrito anteriormente 17. Expressão sistémica de IFN-γ no soro foi detectada com um nível de 120-150 ng / mL no dia 3, e manteve-se a 5 semanas no Ad-IFN-γ, mas não no grupo LacZ. Aortas foram colhidos em cinco semanas pós-injeção de adenovírus para análise histológica e avaliação morfométrica da artéria do enxerto íntima, média lúmen e área do vaso. Expressão de IFN-γ, mas não o controlo LacZ, a formação da neoíntima induzida. Nenhuma infiltração de leucócitos óbvio foi detectado em comparação com o modelo de aloenxerto (Figura 2B). Estes dados são consistentes com o anteriorobservações no modelo de xenoenxerto de ratinho humanizado que o IFN-γ isoladamente é suficiente para induzir a formação de neoíntima de 15, 17.
Figura 1. Ilustração e esquema de modelo de transplante de artéria do enxerto mouse. A. Uma ilustração do procedimento de transplante de aloenxerto. Um segmento de aorta torácica dador masculino foi interposta cirurgicamente na aorta abdominal numa fêmea receptora. Aortas foram colhidas às 4 semanas pós-transplante. Como controlo, um segmento de aorta torácica macho dador foi interposta cirurgicamente na aorta abdominal de um receptor do sexo masculino. B. A análise histológica do enxerto de artéria por Elastica-van Gieson (EVG), H & E e imunocoloração com anti-a-SMA e anti-CD45. Fotomicrografias representativas são mostradas. Pontas de seta marcar a lâmina elástica interna para delinear a íntima da mídia. Escalabar: 50 mm. No arteriosclerose enxerto foi observada no sexo masculino para sexo masculino.
Figura 2. Modelo de IFN-γ induzida rato singeneico artéria transplante. A. Um esquema do modelo de rato singeneico IFN-γ induzida. Artéria torácica doador do sexo masculino foi dissecada e transplantadas em aorta abdominal em receptores masculinos KO IFN-γR. Uma semana após a cirurgia, 1X10 9 pfu Ad-mIFN-γ ou Ad-LacZ foi injetado em camundongos destinatário através da veia jugular. O soro foi recolhido no dia 3, 7 e 35 após a injecção de vírus para a produção de IFN-γ medição. Os enxertos foram colhidas seis semanas para avaliação morfométrica. B. A análise histológica do enxerto de artéria por imunocoloração com anti-a-SMA e anti-CD45. Fotomicrografias representativas são mostradas. Pontas de seta marcar a lâmina elástica interna para delinear a íntima da mídia. Escala bar: 50 mm. No arteriosclerose enxerto foi observada no grupo LacZ.
| Passo | Problema | Possível razão | Solução |
| 2.17 | Hemorragia grave | O intervalo (a distância entre dois pontos) é muito grande, em particular de suturas interrompidas. | A distância entre cada dois pontos devem ser uniforme durante a anastomose. Adicionar um ponto no local do sangramento. |
| Apenas a adventícia é costurada. | Identificar e costura da parede da aorta todo | ||
| Ramos de madeira sem ligadura | Ligadura dos ramos de madeira | ||
| Usando muito heparina | Utilizando-se a 40 ml / kg de heparina (100 U / ml), solução salina para irrigar o campo operatório, durante a anastomose. | ||
| 2.19 | Trombose | Lumen é muito estreito no local de anastomose, em particular de sutura contínua. | Evite anastomosing parede da aorta demais em cada ponto. O tamanho aorta de rato é muito pequena. Para montar parede aórtica demasiadas durante a anastomose causará lúmen estreito e trombose, no entanto, pontos de parede muito inferior aórtica irá resultar em hemorragias graves. |
| O fio de sutura passe através da parede da aorta, no lado oposto. | Identificar parede da aorta e, em seguida, fazer pontos. Se isso acontecesse, o operador deve cortar o nó de sutura e re-ponto neste site. | ||
| As células endoteliais são feridos durante a anastomose. | Usando as suturas de ancoragem para a anastomose. Não segure / espremer toda a parede por arotic paraceps para anastomose. | ||
| A heparina não é usado durante a anastomose. | O tamanho aorta de rato é muito pequena. É muito fácil para a formação da trombose nos enxertos após anastomose. Dando heparina para irrigar a área cirúrgica é muito importante para reduzir a trombose. A taxa de sucesso dos transplantes de vasos em ratos é de cerca de 50% sem o uso de heparina e de 95-100% com o uso de heparina. Se a trombose encontra-se dentro de alguns minutos após o restabelecimento do fluxo sanguíneo, uma abordagem alternativa para remover a trombose é injectar 30-50 ul de solução salina heparinied (100 U / ml) através da veia cava inferior. Não injectar muito heparina apenas em caso de hemorragia grave. | ||
| 2.23 | Transplante falhou | Hemorragia e trombose tardia, ou outros | O transplante de vasos em ratos é a cirurgia muito difícil para o tamanho da aorta de rato é muito pequena. Há três poi chavents para a cirurgia bem sucedida: 1) certifique-se as paredes da aorta de acolhimento e dos doadores são anastomosado juntos, sem, obviamente, gap, apenas no caso de hemorragia grave, 2) manter o espaço lúmen suficiente no local da anastomose, apenas no caso de trombose; 3) uso heparina em dose certa durante a anastomose, apenas no caso de trombose e hemorragia grave. Seguindo este protocolo, a taxa de sucesso para o autor é mais do que 95%. |
Tabela 1. Solução de problemas mesa.
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Discussion
Os protocolos descritos estão focados em modelos de ratos GA. Os procedimentos podem ser aplicados a outros modelos de transplante de enxerto. Estes incluem os modelos de xenoenxerto humanizada (isto é, segmentos de artérias coronárias humanas interposta em aortas de infra-renal de ratinhos imunodeficientes), eo modelo de rato GA rejeição aguda (isto é, uma aorta do rato a partir de uma estirpe genética em outro recipiente estirpe genética). Nossos modelos de mouse descritos são mais para fechar lesões GA humanos. O primeiro modelo envolve a interposição de um segmento de vaso a partir de um rato macho em uma fêmea receptora da mesma estirpe consanguínea (C57BL/6J). Rejeição de enxerto, neste caso, é dirigido apenas contra os antigénios de histocompatibilidade menor codificadas pelo cromossoma Y (presente no sexo masculino, mas não a do sexo feminino) e a resposta de rejeição que se segue é suficientemente indolentes para preservar as células musculares lisas derivadas de doadores durante várias semanas 2, 6 , 8-10, 12, 14. O segundo modelo envolve a interposição de um segme artériant a partir de um rato dador C57BL/6J tipo selvagem em um rato hospedeiro da mesma estirpe e sexo que falta o receptor para o IFN-γ (IFN-γR-KO), seguido por administração de ratinho de IFN-γ (entregue via infecção do ratinho fígado, com um vector adenoviral.) Não existe rejeição neste caso como dador e ratinhos receptores são da mesma estirpe e sexo, mas as células do músculo liso dos doadores proliferar em resposta à citoquina, enquanto células hospedeiras derivadas, sem receptor para essa citocina, não respondem 21. Além disso, por recruzá alterações genéticas adicionais no dador embarcação, os dois modelos podem ser utilizados para avaliar o efeito de genes específicos sobre a proliferação de células de músculo liso de IFN-γ orientado e progressão GA.
O papel do IFN-γ em modelos de rato de GA não foi bem estabelecido. Nossos dois modelos de mouse verificaram o papel de IFN-γ em camundongos GA. No primeiro modelo, uma aorta dador é transplantado para macho fêmea receptorade modo que o hospedeiro de célula T induz respostas mediadas pelo aloimunes alorreativas contra o menor histocompatibilidade HY antigénio específico de sexo masculino expressa nos enxertos 12. Na verdade, WT (C57BL/6J) macho para fêmea C57BL/6J transplante induzido GA, caracterizada por infiltração de leucócitos e formação de neo-íntima com acúmulo VSMC. Em contraste, do sexo masculino para o transplante de aorta macho não induz GA. Determinou-se o papel do IFN-γ sinalização em células vasculares usando IFN-γR-KO como enxerto dador transplantado para a fêmea receptora WT. Supressão de IFN-γR em enxertos de dadores embotados infiltração de leucócitos e acumulação de VSMC na neoíntima. Portanto, o papel do IFN-γ em modelo actual do rato é consistente com o modelo de transplante de xenoenxerto de ratinho humanizado onde o IFN-γ sinalização em enxerto é crítico para a progressão GA 4, 15, 17, 18. Determinou-se se o IFN-γ por si só é suficiente para induzir a formação da neoíntima através da criação de uma produção de IFN-γ-medisingênico modelo arteriosclerose enxerto rato decido. Neste modelo, uma aorta macho é transplantado para um animal de IFN-γR-KO destinatário rato macho no qual o IFN-γ é então expressa sistemicamente através de injecção intravenosa de adenovírus deficiente em replicação o rato que codifica o IFN-γ transgene (Ad-IFN-γ ). Observou-se que a expressão de IFN-γ, mas não o controlo LacZ, induziu a formação neointimal. Neste modelo, não há infiltração de leucócitos é óbvio detectado em comparação com o modelo de aloenxerto, consistente com as observações anteriores, em um modelo de transplante de artéria rato SCID-vascular humano, no qual o IFN-γ sinalização é suficiente para induzir a formação da neointima, na ausência de leucócitos 15, 17.
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01 HL109420 para WM e AHA 9320033N para LY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks) |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml) |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml) |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml) |
| Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) | CareFusion | AL4109 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | To prepare the anesthetic |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Microscope | Leica | MZ95 | |
| Micro Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5693 | |
| Spring Scissors | F.S.T | 15009-08 | To transect the aorta of donor or recipient |
| Extra Narrow Scissors | F.S.T | 14088-10 | |
| Needle Holder/Forceps | MICRINS | MI1542 | To hold the needle |
| Fine Forceps | F.S.T | 11254-20 | |
| Forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Forceps | F.S.T | 13011-12 | |
| LANCASTER Eye Speculum | Zepf Medical Instruments | 42-1209-07 | |
| Micro Vascular Clip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6472 | |
| Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5440 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture | AROSurgical Instruments Corporation | Cat #T4A10Q07 | 10-0 suture, Needle=70 microns |
| Black Monofilament Nylon Suture | Syneture (Covidien) |
SN-1956 | 6-0 suture |
| Non-Woven Songes | McKesson Corp. | Reorder No. 94442000 | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | REF 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 18G 1 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305196 | |
| 25G 7/8, Hypodermic Needle | BD | REF 305124 | |
| 27G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305109 | |
| 30G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305106 | |
| Hearting Pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
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