Summary
Vi beskriver protokoll för våra arteriosclerois mus transplantat (GA) modeller som innefattar en mellanliggande mus kärlsegment till en mottagare av samma inavlade stam. Genom tillbakakorsning ytterligare genetiska förändringar i kärlet donator, kan modellen bedöma effekten av specifika gener på GA.
Abstract
Graft arteriosclerois (GA), även kallad transplantatvaskulopati, är en patologisk lesion som utvecklas över flera månader eller år i transplanterade organ kännetecknas av diffus, omgivande stenos i hela vaskulär träd. Den mest kritiska komponenten i GA patogenes är tillväxten av glatta muskel-liknande celler i intima. När en human kransartär segmentet är insatt in i den infra-renala aorta av immundefekta möss, kunde intimas skall expandera som svar på adoptivt överförda humana T-celler allogena till artären donator eller exogent humant IFN-γ i frånvaro av humana T-celler. En mellanliggande mus aorta från en stam till en annan musstam mottagare är begränsad som en modell för kronisk avstötning hos människor eftersom det akuta cell-medierad avvisande svar i denna musmodell helt eliminerar alla givare-härledda vaskulära celler från transplantat inom två-tre veckor. Vi har nyligen utvecklat två nya mouse modeller för att kringgå dessa problem. Den första modellen innebär en mellanliggande kärlsegment från en manlig mus in i en kvinnlig mottagare av samma inavlade stam (C57BL/6J). Transplantatavstötning i detta fall är riktad endast mot smärre histokompatibilitetsantigener kodade av Y-kromosomen (närvarande i manliga men inte kvinnliga) och avstötningsreaktioner som följer är tillräckligt loj att bevara donator-härledda glatta muskelceller i flera veckor. Den andra modellen innebär anbringande av en artär segment från en vild typ C57BL/6J mus givare i en värd mus av samma stam och kön som saknar receptorn för IFN-γ följt av administrering av mus-IFN-γ (levereras via infektion av musen levern med en adenoviral vektor. Det finns ingen avstötning i detta fall eftersom både givare och möss mottagare är av samma stam och kön men donor glattmuskelceller proliferera som svar på cytokinet medan värd-härledda celler, som saknar receptorn fördetta cytokin, svarar inte. Genom tillbakakorsning ytterligare genetiska förändringar i kärlet donator, kan båda modellerna kan användas för att bedöma effekten av specifika gener på GA progression. Här beskriver vi detaljerade protokoll för vår mus GA-modeller.
Introduction
Graft arteriosclerois (GA), även kallad transplantatvaskulopati, är en patologisk lesion som utvecklas över flera månader eller år i transplanterade organ kännetecknas av diffus, omgivande stenos i hela vaskulär träd 7. Tidiga skeden kan orsaka excentriska och fokal stenoser som är mer uppenbart i artärerna, vilket närmare liknar stenoser ses i konventionella ateroskleros. Lumen avstötning av transplantatet till fartyg resulterar från intimal expansion på grund av infiltration av celler värd-T och makrofager och speciellt till ackumulering av extracellulär matrix och glatt muskulatur-liknande celler härstammar från transplantat, värd eller båda 5, 13, 19, som är otillräckligt kompenseras genom passiv fartyg ombyggnad. I hjärt allografts, de mest kliniskt signifikanta lesioner är de i epikardiella och intramyocardial kranskärl. I slutändan kommer GA i kranskärlen orsakar ischemisk hjärtsvikt. GA är den största orsaken till sent hjärt grakterut förlust. De stenoser GA stannar vid sutur linjer, starkt binder värdsvaret att ympa alloantigener i dess patogenes och leder oss att klassificera GA som en form av kronisk avstötning 3. Emellertid kan andra former av arteriell skada ökar risken för GA, antingen genom att öka nettobörda av skada eller genom att intensifiera och / eller modulera alloimmun svar. Den endotelcell (EG) beklädnad av transplantat artärer bevaras i human GA och de mest ytliga regionerna av intima intill EG fodret är platsen tyngst infiltrerats av värd-härledd IFN-γ-producerande T-celler och makrofager 11; i vissa patienter GA är förknippade med utvecklingen av donator-specifika alloantikroppar som binder till transplantatet EC 16 men fartygen visar få tecken på den fibrinoid nekros som är kännetecknande för akut antikropp-medierad avstötning 11.
Den mest kritiska komponenten i GA patogenes ärproliferation av glatta muskel-liknande celler i intima, om denna process kan bli arresterad, är GA osannolikt att utvecklas. Tidigare arbete från vår grupp hade visat att intimas av mänskliga kransartärsjukdomar segment insatt in i den infra-renala aorta av immundefekta möss expandera som svar på adoptivt överförda humana T-celler allogena till artären donator och att denna process kunde hämmas genom att neutralisera humant IFN- γ 18. Vidare exogen human IFN-γ kan orsaka intimal (och mediala) vaskulära glatta muskelceller (VSMC) spridning i dessa arteriella transplantat i frånvaro av humana T-celler 15, 17. (Det är viktigt att notera att människa och mus IFN-γ korsar inte arter, utesluter indirekta effekter på musen värd i denna experimentella systemet.) Dessa humaniserade musmodeller har förmånen att rekapitulera human T-cell / vaskulära interaktioner cell och intimala lesioner är till stor del består av humana (dvs. transplantat-härledda) celler,som har observerats i kliniska prover, men de har inte fullt rekapitulera den kliniska situationen eftersom de ignorerar den roll som värd makrofager och eventuellt andra celltyper som deltar i kliniska transplantationer lesioner. En konventionell mus modell av denna process skulle teoretiskt ta itu med detta problem, komplettera begränsningarna av humaniserad modellen genom att involvera ett komplett värdimmunsystemet och ger den ytterligare fördelen att kraften i musen genetiska metoder som ska tillämpas till GA. De två mest använda musmodeller involverar heterotop hjärttransplantation och orthotopic artär transplantation 1. De skador som utvecklas i artärerna i heterotopiska hjärttransplantat är till stor del består av värdceller, troligen av benmärg ursprung, medan intima celler i artärerna i mänskliga hjärttransplantat är övervägande av transplantat ursprung 5, 13, 19. Detta är en viktig distinktion som har fått oss att utveckla alternativa musmodeller. Mellanlägg aven mus aorta från en stam till en annan musstam mottagare är ännu mer begränsad som en modell för kronisk avstötning hos människor eftersom den akut cell-medierad avvisande svar i denna musmodell helt eliminerar alla givare-härledda vaskulära celler från transplantat inom två-tre veckor 19. Följaktligen, de efterföljande förändringarna ses i det mellanliggande kärlsegmentet är enbart ett svar på värdceller som har återpopuleras den decellulariserade fartyget schavotten, skapa ett starkt artefaktuella situation av begränsad betydelse som förebild för de förändringar i transplantatet fartyg som förekommer i kliniken. Vi har nyligen utvecklat två nya musmodeller för att kringgå dessa problem 21. Den första modellen innebär en mellanliggande kärlsegment från en manlig mus in i en kvinnlig mottagare av samma inavlade stam (C57BL/6J). Den andra modellen innebär anbringande av en artär segment från en vild typ C57BL/6J mus givare i en värd mus av samma stam och kön som saknar receptor för IFN-γ (IFN-yR-KO) följt av administrering av mus-IFN-γ (levereras via infektion i muslever med en adenoviral vektor. Här beskriver vi detaljerade protokoll och fördelarna med våra mus GA modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus allograft och syngena transplantat transplantation modell
Samtliga djurstudier har godkänts av Institutional Animal Care och kommittéer användning av Yale University. För transplantatavstötning modell, var segment av aorta från manlig, 4-5 veckor gamla WT (C57BL/6J) eller IFN-yR-KO möss insatt i bukaorta av kvinnlig mottagare, 8-12 veckor gamla WT med en end-to -end mikrokirurgisk anastomotic teknik (se nästa för detaljer). För syngen transplantat modellen var segment av bröstkorg aorta från manliga, 4-5 veckor gamla WT möss insatt i buken aorta av manlig, 8-12 veckor gamla IFN-γR1-KO med en end-to-end mikrokirurgisk anastomotic teknik. Vid en vecka postoperativt fick djuren ympades iv med Ad5.CMV-mus-IFN-γ eller Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) vid 1 x 10 9 PFU. Serum mus-IFN-γ-nivåer mättes genom ELISA (eBioscience) vid 1 och 5 veckor efter adenovirus administrering. Vissa djur fick BrdU(Sigma-Aldrich) vid 100 mg / kg se i 2 veckor före avlivning.
End-to-end mikrokirurgisk anastomotic teknik (Video kommer att tas för denna del):
Ett. Donator Procedur
- Söva donatormöss med intraperitoneala injektioner av ketamin (50 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg).
- Efter att säkerställa adekvat anestesi, placera donatormöss under operationsmikroskopet vid X8-30 förstoring på en bricka i ett ryggläge, och använd Pad Jod Prep och alkohol Prep Pad för bröstkorgen beredning.
- Incise främre bröstkorgen genom revbenen och membran att exponera hjärtat.
- Öppna det högra förmaket, injicera 10 ml hepariniserat (100 U / ml) saltlösning i den vänstra ventrikeln för att spola möss med användning av en 10 ml-spruta med en 25-gauge nål.
- Resekera hjärtat och lungorna för att exponera hela längden av thorakal aorta.
- Dissekera bröstaortan noggrant för att minimera direkt trauma, while identifiera, ligera och dela virket grenarna med 11-0 sutur nära aorta.
- När aorta är fri från omgivande vävnad, punktskatter hela bröstaorta för transplantation.
- Spola den avskurna ändan av givaren aorta med hepariniserad (100 U / ml) saltlösning, och förvara den i samma lösning på is (upp till 6 tim) tills transplantation.
2. Mottagarens Procedur
- Injicera mottagaren möss med ip ketoprofen (5 mg / kg) för smärtlindring, och thenanesthetize mössen med IP ketamin (50 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg). Mottagaren möss är djupt sövda inom 10 minuter för en varaktighet av 60-90 min. Under operationen, är nivån av anestesi bedöms varje 15 min genom att klämma den främre bukväggen eller foten med pincett. Om djuret reagerar på skadliga stimuli när som helst under operationen, kommer ytterligare en dos av ketamin och xylazin (1/4 eller 1/3 ursprungliga dosen) ges av sc eller im
- Efter att säkerställa adekvat anestesi, raka av pälsen i främre bukväggen med en elektrisk rakapparat, rengör huden med hjälp Pad Jod Prep och alkohol Prep Pad, täcker ögonen med oftalmologiska salva. Under operation, kommer följande aseptiska tekniker användas för verksamheten, bland annat städning operationsbordet med 10% blekmedel, bära sterila handskar och använda steriliserade mikrokirurgi instrument (ångsteriliserades instrument för starten av operationen, sedan varm glaspärla-steriliserade instrument mellan flera operationer, etc).
- Placera mottagaren möss i operativsystemet mikroskop vid en förstoring av X8-30 på en bricka i ett ryggläge.
- Incise bukväggen vid mittlinjen från xyphoid till pubis, och sprida bukväggen isär med hjälp av en mikro-upprullare att exponera bukhålan.
- Fäll in tarmarna mycket fint och linda med gasväv fuktad med saltlösning. Mottagaren möss blir kyld av förlust av heaT genom externaliserats tarmar. Det är viktigt att bevara djurens värme. Men den värme ombord inte används under operationen så blygsamma hypotermi är av nytta för att förhindra ryggmärgsskada under ocklusion av aorta blodflödet liksom det är ineffektivt värmeöverföring med frånvarande blodflödet till nedre halvan av möss kroppen.
- Flytta fortplantningsorganen inferiorly, linda buken områden recipientmöss med saltlösning-lösning-fuktad gasväv, och använda den för att dra tillbaka ändtarmen till höger sida av buken. De utsatta vävnader bevattnas periodiskt med saltlösning under transplantationen.
- Dissekera rent ut ett segment av infrarenal aorta mellan renal kärlet proximalt och aortabifurkationen distalt och separera från nedre hålvenen (IVC) försiktigt.
- Identifiera och ligera alla de små grenar med ursprung från detta segment av bukaorta användning 11-0 sutur Polyamid Monofilament.
- Cross-klämma isolerade segment av enbdominal aorta med användning av två vaskulära klämmor proximately 5 mm avstånd från varandra, en i varje ände.
- Transekt bukaorta mellan klämmorna med vassa mikro-sax för att skapa anastomotiska platserna.
- Resekera ett litet segment av bukaorta (upp till 0,4 mm i längd) från en kapad ände av transected mottagarens aorta att rymma transplantatdonatorn aorta.
- Spola aorta segmenten mellan klämmor som använder hepariniserad saltlösning för att avlägsna den resterande blod. Aorta segmenten mellan klämmor och givaren aortagraften bevattnas periodiskt med hepariniserad (100 U / ml) koksaltlösning (upp till 40 ml / kg) under anastomos.
- Transekt båda sidorna av givaren aorta med vassa mikro-sax för att skapa ett segment transplantat av 2,5 mm i längd för transplantation.
- Placera transplantatdonatorn aorta i orthotopic positionen, anastomose givaren transplantat proximala och den distala änden till mottagarens proximal och distal skurna änden av bukaorta, respektive, med en ände-to-end modell med 11-0 sutur Polyamid Monofilament.
- För de kontinuerliga suturer, placera vistelse suturer vid klockan 3 och 9 positioner för det första. Mellan två stay suturer på varje sida av transplantat, anastomose båda skärningskanter 3-4 stygn med de löpande suturer, och knyta de löpande suturer att bo suturer med en dubbelknut. Eftersom båda lagren av nedläggning är kontinuerlig, är risken för dehiscence ökat. Givaren aortagraft bör vara i lämplig längd för att ansluta mottagarens proximal och distal skurna änden av bukaorta.
- För de avbrutna suturer, konstruera fyra anastomos vid klockan 3 och 9 positioner i båda sidor av transplantat för det första, och anastomose båda skärningskanter 3-4 stygn mellan två bo suturer på varje sida av transplantat.
- Släpp distala klämman att tillåta tillbakagående flöde till transplantat, identifiera blödande platser och göra ytterligare stygn inom 3 minuter.
- Efter fastställa tillfredsställande hemostas, släpp den proximala klämman.
- Bekräfta transplantatet patency genom närvaron av kraftig pulsation i transplantatet och den proximala intilliggande segmentet av nativt bukaorta, särskilt i det distala intilliggande segmentet av bukaorta och sämre mesenterica artär. Tänk trombos i anastomosanordningar anläggningar om pulsering avta inom några minuter efter att återställa blodflödet.
- Återgå tarmen in i bukhålan.
- Sutur stänga bukväggen med 5-0 nylonsutur i muskeln lagret och hudlagret, respektive.
- Placera mottagaren möss till en ren bur på toppen av en värmedyna och vänta 1-2 h för mössen att återfå medvetandet och återhämta sig från anestesi. Det är viktigt för att bevara djurens adekvat värme under återhämtning. Håll mössen i den varma och torra bur innan djuret vakna ur narkos.
- Bedöma motoriken av bakbenen efter möss återhämtning, och igen på den andra dagen. En lyckad transplantation kirurgi kommer att bekräftas if någon dysfunktion av bakbenen observeras i mottagarländerna möss på den andra dagen.
- Administrera mottagaren möss med Ketoprofen i dricksvatten (5 mg / kg / d = 27 ug / ml i dricksvattnet) under 48 timmar. Om någon mottagare möss lider av smärta oförlöst av postoperativa smärtstillande medel, vilket framgår av minskad rörlighet, underlåtenhet att brudgummen, onormal bunched kroppshållning, etc, kommer de att avlivas. Djuren ska avlivas vid fördefinierade slutpunkter efter 1-60 dagar.
Graft analys
Artery transplantat i allograft anskaffades vid 4 veckor och transplantat i syngena transplantat modellen var sex veckor postoperativt (5 veckor efter virusinfektion) och analyserades genom standardiserade histologiska tekniker för Elastica-van Gieson (EVG)-färgning, hematoxylin och eosin (HE) färgning och immunofluorescens-färgning. Bilder togs med ett immunofluorescens mikroskop systemet (Zeiss). Cellräkning av kärnor omgivna av positiv immunofärgning var utföred under hög förstoring och medelvärdet från fem tvärsektioner för varje transplantat. Transplantatet arealmätningen i lumen (inom endotelet), intima (mellan endotelet och inre elastisk lamina, IEL), media (mellan lEL och extern elastisk lamina, EEL), väggtjocklek (mellan endotelet och extern elastisk lamina) och hela fartyget (inom EEL) beräknades från 5 seriella tvärsnitt, 150 ìm mellanrum för varje transplantat, med datorstödd bildanalys och NIH Image 1,60 ( http://rsbweb.nih.gov/nih-image ).
Statistisk analys
Alla data uttrycks som medelvärde ± SEM. Tvåsidiga, var parade t tester och en tvåvägs ANOVA analyser utförs med hjälp av programmet Prism programvara (GraphPad Software). Skillnader med P <0,05 ansågs indikera statistisk signifikans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus allograft arterioskleros (GA) modell: I denna modell är en manlig donator aorta transplanteras in kvinnliga mottagaren så att den mottagande inducerar alloreaktiva T-cells medierade alloimmuna svar mot en mindre Y-antigen (den manliga-specifika underordnade histokompatibilitetsantigenet HY) uttrycks på transplantatet 12, och i sin tur T-cell-producerade IFN-γ enheter VSMCs proliferation 20 som observerats i andra modeller allograft transplantation 2, 6, 8-10, 14. Ett segment av thorakal aorta från en donator manlig kirurgiskt anbringad till en abdominal aorta av en kvinnlig mottagare, och aorta skördades vid 4 veckor efter transplantation (Figur 1A). Histologisk analys av artär transplantat utfördes genom Elastica-van Gieson (EVG), H & E och immunofärgning med VSMC markör SMA och pan-leukocyt markör CD45. Ingen avstötning observerades mellan C57BL/6J hanmöss i aorta transplantation. Hane till hona transplantation inducerad GA, som kännetecknas av infiltration av leukocyter och neointimabildning med ackumulering av VSMC (Figur 1B). Att bestämma rollen av IFN-γ signalering i GA, artärer från WT eller IFN-yR-KO möss transplanteras till WT kvinnlig mottagare. Deletion av IFN-yR i donor transplantat uppvisade en reducerad infiltration av leukocyter och neointimabildning med minskningar av SMA-positiva celler jämfört med WT (ej visad). Dessa resultat stöder en kritisk roll för IFN-γ signalering i GA progression som tidigare observerats i humaniserad mus xenograft transplantation model 4, 15, 17, 18.
IFN-γ-inducerad graft arterioskleros: Det har fastställts att IFN-γalone är tillräcklig för att inducera bildning av neointima i en humaniserad mus GA modell 15, 17. Här har vi etablerat en IFN-γ-medierad mus syngen modell graft åderförkalkning. I denna modell har WT manliga aortas transplanterasin IFN-yR-bristfälliga mottagande möss följt av intravenöst injektion av replikationsdefekt adenovirus som kodar för mus-IFN-γ transgenen (Ad-IFN-γ) eller kontroll LacZ-genen (Ad-LacZ) (Figur 2A). Nedsatt infektion och lever transgenexpression av Ad-LacZ verifierades genom X-gal-färgning i Ad-LacZ gruppen men inte Ad-IFN-γ grupper som beskrivits tidigare 17. Systemisk uttryck av IFN-γ i serum detekterades vid en nivå av från 120 till 150 ng / ml på dag 3 och behållit upp till 5 veckor i ad-IFN-γ men inte i LacZ gruppen. Aorta skördades vid 5 veckor efter injektion av adenovirus för histologisk analys och morfometrisk bedömning av artär transplantat intima, media, lumen och kärl-området. Uttryck av IFN-γ, men inte LacZ kontroll, inducerad neointimalbildning. Inga uppenbara infiltration av leukocyter detekterades jämfört med den allograft modellen (Figur 2B). Dessa data överensstämmer med föregåendeobservationer i humaniserad mus xenograftmodell att IFN-γ ensam är tillräcklig för att inducera bildning av neointima 15, 17.
Figur 1. Illustration och systematiken i mus-allograft artär transplantation modell. A. En illustration av transplantatavstötning transplantation förfarande. Ett segment av givare manlig bröstaorta kirurgiskt placerad i bukaorta i en kvinnlig mottagare. Aorta skördades vid 4 veckor efter transplantation. Som en kontroll framställdes ett segment av manlig donator bröstaorta kirurgiskt insatt in i en bukaorta i en manlig mottagare.. B Histologisk analys av artär transplantat genom Elastica-van Gieson (EVG), H & E och immunofärgning med anti-a-SMA och anti-CD45. Representativa mikrofotografier visas. Pilspetsar markera inre elastiska lamina att avgränsa intima från media. Skalabar: 50 mm. Inget kneg arterioskleros observerades i hane till hane grupp.
Figur 2. IFN-γ-inducerad mus syngen artär transplantation modell. A. Ett system av IFN-γ-inducerad mus syngen modell. Manlig donator bröstkorg artären dissekerades och transplanterades in i bukaorta i manlig mottagare IFN-yR KO-möss. En vecka efter operationen, var 1X10 9 pfu Ad-mIFN-γ eller Ad-LacZ injiceras i mottagaren möss via halsvenen. Serum uppsamlades på dag 3, 7 och 35 efter injektion av virus för IFN-γ mätning. Kneg skördades 6 veckor för morfometrisk bedömning. B. Histologisk analys av artär transplantat genom immunfärgning med anti-a-SMA och anti-CD45. Representativa mikrofotografier visas. Pilspetsar markera inre elastiska lamina att avgränsa intima från media. Skala bar: 50 mm. Inget kneg arterioskleros observerades i LacZ grupp.
| Steg | Problem | Möjlig anledning | Lösning |
| 2,17 | Allvarliga blödningar | Gapet (avståndet mellan två stygn) är för stor, särskilt om avbrutna suturer. | Avståndet mellan varje två maskor bör vara enhetliga under anastomos. Lägg ett stygn på blödningsställe. |
| Endast adventitia är sydd. | Identifiera och sy hela aortaväggen | ||
| Oligerade lumber grenar | Ligering av lumber grenarna | ||
| Använda för mycket heparin | Användas tillsammans med upp till fyra0 ml / kg hepariniserat (100 U / ml) koksaltlösning för att bevattna kirurgi fältet under anastomos. | ||
| 2,19 | Trombos | Lumen är för smal på anastomistället, särskilt av kontinuerliga suturer. | Undvik anastomosing alltför många aortaväggen vid varje söm. Aortan storlek mus är mycket liten. Att sy för många aortaväggen under anastomos kommer att orsaka lumen smal och trombos, kommer dock att sy också mindre aortaväggen resultera i allvarlig blödning. |
| Suturen passerar genom aortaväggen vid den motsatta sidan. | Identifiera aortaväggen och sedan göra stygn. Om det hände, bör operatören avbröt sutur knut och re-söm på den här webbplatsen. | ||
| Endotelceller skadas under anastomos. | Använda Vistelsen suturer för anastomos. Håll inte / pressa hela arotic väggen förceps för anastomos. | ||
| Heparin används inte vid anastomos. | Aortan storlek mus är mycket liten. Det är väldigt lätt för blodpropp bildas i transplantaten efter anastomos. Ge heparin för att bevattna operationen fältet är mycket viktigt för att minska trombos. Framgången för fartygets transplantation på möss är cirka 50% utan att använda heparin och 95-100% med hjälp av heparin. Om trombos hittas inom ett par minuter efter återställning av blodflödet, en alternativ metod för att ta bort trombos är att injicera 30-50 ul heparinied saltlösning (100 U / ml) genom IVC. Injicera inte för mycket heparin precis vid svår blödning. | ||
| 2,23 | Transplantation misslyckades | Fördröjd blödning och trombos, eller andra | Kärlet transplantation hos möss är mycket svårt kirurgi för aorta storleken på mus är mycket liten. Det finns tre viktiga points för lyckad operation: 1) Kontrollera att aorta väggar värd och donator anastomoseras tillsammans utan uppenbarligen lucka, bara i fall av allvarlig blödning, 2) hålla tillräckligt lumen utrymme på anastomistället, bara i fall av trombos, 3) använder heparin i rätt dos under anastomos, bara i fall av trombos och svår blödning. Efter detta protokoll, är framgång för författaren mer än 95%. |
Tabell 1. Felsökning tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beskrivna protokollen är fokuserade på mus GA-modeller. Förfarandena kan tillämpas på andra graft transplantation modeller. Dessa modeller inkluderar humaniserad xenotransplantat (dvs. mänskliga kranskärl segment insatt i den infra-renala aorta av möss med immunbrist), och akut avstötning mus GA-modellen (dvs. en mus aorta från en genetisk stam till en annan genetisk stam mottagare). Våra beskrivna musmodeller är mer att stänga mänskliga GA lesioner. Den första modellen innebär en mellanliggande kärlsegment från en manlig mus in i en kvinnlig mottagare av samma inavlade stam (C57BL/6J). Transplantatavstötning i detta fall är riktad endast mot smärre histokompatibilitetsantigener kodade av Y-kromosomen (närvarande i manliga men inte kvinnliga) och avstötningsreaktioner som följer är tillräckligt loj att bevara donator-härledda glatta muskelceller i flera veckor 2, 6 , 8-10, 12, 14. Den andra modellen innebär att anbringa en artär segment från en vild typ C57BL/6J mus givare i en värd mus av samma stam och kön som saknar receptorn för IFN-γ (IFN-yR-KO) följt av administrering av mus-IFN-γ (levereras via infektion av musen levern med en adenoviral vektor.) Det finns ingen avstötning i detta fall eftersom både givare och möss mottagare är av samma stam och kön men donor glattmuskelceller proliferera som svar på cytokinet medan värd-härledda celler, som saknar receptor för detta cytokin, svarar inte 21. Dessutom, genom att tillbakakorsning ytterligare genetiska förändringar i kärlet donator, kan båda modellerna kan användas för att bedöma effekten av specifika gener på IFN-γ-driven glattmuskelcellproliferation och GA progression.
Rollen av IFN-γ i mus GA-modeller har inte varit väl etablerad. Våra två musmodeller har verifierat rollen av IFN-γ i mus GA. I den första modellen, är en manlig donator aorta transplanteras in kvinnlig mottagareså att värden inducerar alloreaktiva T cellförmedlade alloimmuna svar mot den manliga-specifika underordnade histokompatibilitetsantigenet HY uttrycks på transplantaten 12. Sannerligen, WT (C57BL/6J) hane till C57BL/6J kvinnliga transplantation inducerad GA, som kännetecknas av infiltration av leukocyter och neointimabildning med VSMC ackumulation. Däremot inducerar hane till hane aorta transplantation inte GA. Vi bestämde rollen av IFN-γ signalering i vaskulära celler genom att använda IFN-yR-KO som givare transplantat transplanteras till WT kvinnlig mottagare. Borttagande av IFN-yR i donor transplantat trubbiga leukocytinfiltration och VSMC ackumulering i neointiman. Därför är den roll av IFN-γ i nuvarande musmodell överensstämmer med humaniserad mus xenograft transplantation modell där IFN-γ signalering i graft är kritiskt för GA progression 4, 15, 17, 18. Vi bestämde om IFN-γ ensam är tillräcklig för att inducera bildning av neointima genom att skapa en IFN-γ-mediated mus syngen transplantat åderförkalkning modell. I denna modell är en manlig aorta transplanteras in i en manlig IFN-yR-KO mottagardjur i vilket mus-IFN-γ därefter systemiskt uttrycks av intravenöst injektion av replikationsdefekt adenovirus som kodar för mus-IFN-γ transgenen (Ad-IFN-γ ). Vi observerade att uttryck av IFN-γ, men inte LacZ kontroll, inducerade neointimalbildning. I denna modell är ingen uppenbar infiltration av leukocyter detekteras jämfört med allograft-modellen, i överensstämmelse med de tidigare observationerna i en human artär-SCID-mus transplantation modell där vaskulär IFN-γ signalering ensam är tillräcklig för att inducera bildning av neointima i frånvaro av leukocyter 15, 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH bidrag R01 HL109420 till WM och AHA 9320033N till LY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks) |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml) |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml) |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml) |
| Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) | CareFusion | AL4109 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | To prepare the anesthetic |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Microscope | Leica | MZ95 | |
| Micro Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5693 | |
| Spring Scissors | F.S.T | 15009-08 | To transect the aorta of donor or recipient |
| Extra Narrow Scissors | F.S.T | 14088-10 | |
| Needle Holder/Forceps | MICRINS | MI1542 | To hold the needle |
| Fine Forceps | F.S.T | 11254-20 | |
| Forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Forceps | F.S.T | 13011-12 | |
| LANCASTER Eye Speculum | Zepf Medical Instruments | 42-1209-07 | |
| Micro Vascular Clip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6472 | |
| Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5440 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture | AROSurgical Instruments Corporation | Cat #T4A10Q07 | 10-0 suture, Needle=70 microns |
| Black Monofilament Nylon Suture | Syneture (Covidien) |
SN-1956 | 6-0 suture |
| Non-Woven Songes | McKesson Corp. | Reorder No. 94442000 | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | REF 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 18G 1 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305196 | |
| 25G 7/8, Hypodermic Needle | BD | REF 305124 | |
| 27G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305109 | |
| 30G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305106 | |
| Hearting Pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
- George, J. F., Pinderski, L. J., Litovsky, S., Kirklin, J. K. Of mice and men: mouse models and the molecular mechanisms of post-transplant coronary artery disease. J. Heart Lung Transplant. 24, 2003-2014 (2005).
- Koulack, J., McAlister, V. C., MacAulay, M. A., Bitter-Suermann, H., MacDonald, A. S., Lee, T. D. Importance of minor histocompatibility antigens in the development of allograft arteriosclerosis. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 273-277 (1996).
- Libby, P., Pober, J. S.
- Lorber, M. I., Wilson, J. H., Robert, M. E., Schechner, J. S., Kirkiles, N., Qian, H. Y., Askenase, P. W., Tellides, G., Pober, J. S. Human allogeneic vascular rejection after arterial transplantation and peripheral lymphoid reconstitution in severe combined immunodeficient mice. Transplantation. 67, 897-903 (1999).
- Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
- Mitchell, R. N.
- Mitchell, R. N. Graft vascular disease: immune response meets the vessel wall. Annu Rev Pathol. 4, 19-47 (2009).
- Nagano, H., Libby, P., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Stinn, J. L., Becker, G., Tilney, N. L., Mitchell, R. N. Coronary arteriosclerosis after T-cell-mediated injury in transplanted mouse hearts: role of interferon-gamma. Am. J. Pathol. 152, 1187-1197 (1998).
- Nagano, H., Mitchell, R. N., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Tilney, N. L., Libby, P. Interferon-gamma deficiency prevents coronary arteriosclerosis but not myocardial rejection in transplanted mouse hearts. J. Clin. Invest. 100, 550-557 (1997).
- Raisanen-Sokolowski, A., Glysing-Jensen, T., Koglin, J., Russell, M. E. Reduced transplant arteriosclerosis in murine cardiac allografts placed in interferon-gamma knockout recipients. Am. J. Pathol. 152, 359-365 (1998).
- Salomon, R. N., Hughes, C. C. W., Schoen, F. J., Payne, D. D., Pober, J. S., Libby, P. Human Coronary Transplantation-Associated Arteriosclerosis - Evidence for a Chronic Immune Reaction to Activated Graft Endothelial Cells. Am. J. Pathol. 138, 791-798 (1991).
- Scott, D. M., Ehrmann, I. E., Ellis, P. S., Chandler, P. R., Simpson, E. Why do some females reject males? The molecular basis for male-specific graft rejection. J. Mol. Med. 75, 103-114 (1997).
- Shimizu, K., Sugiyama, S., Aikawa, M., Fukumoto, Y., Rabkin, E., Libby, P., Mitchell, R. N. Host bone-marrow cells are a source of donor intimal smooth- muscle-like cells in murine aortic transplant arteriopathy. Nat. Med. 7, 738-741 (2001).
- Tellides, G., Pober, J. S.
- Tellides, G., Tereb, D. A., Kirkiles-Smith, N. C., Kim, R. W., Wilson, J. H., Schechner, J. S., Lorber, M. I., Pober, J. S. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
- Vassalli, G., Gallino, A., Weis, M., von Scheidt, W., Kappenberger, L., von Segesser, L. K., Goy, J. J. Alloimmunity and nonimmunologic risk factors in cardiac allograft vasculopathy. Eur. Heart J. 24, 1180-1188 (2003).
- Wang, Y., Bai, Y., Qin, L., Zhang, P., Yi, T., Teesdale, S. A., Zhao, L., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ. Res. 101, 560-569 (2007).
- Wang, Y., Burns, W. R., Tang, P. C., Yi, T., Schechner, J. S., Zerwes, H. G., Sessa, W. C., Lorber, M. I., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma plays a nonredundant role in mediating T cell-dependent outward vascular remodeling of allogeneic human coronary arteries. Faseb J. 18, 606-608 (2004).
- Yacoub-Youssef, H., Marcheix, B., Calise, D., Thiers, J. C., Benoist, H., Blaes, N., Segui, B., Dambrin, C., Thomsen, M. Chronic vascular rejection: histologic comparison between two murine experimental models. Transplant. Proc. 37, 2886-2887 (2005).
- Yokota, T., Shimokado, K., Kosaka, C., Sasaguri, T., Masuda, J., Ogata, J. Mitogenic activity of interferon gamma on growth-arrested human vascular smooth muscle cells. Arterioscler. Thromb. 12, 1393-1401 (1992).
- Yu, L., Qin, L., Zhang, H., He, Y., Chen, H., Pober, J., Tellides, G., Min, W. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting IFN-γ-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Cir. Res. 109, 418-427 (2011).
