유전학과 광학을 결합 신경 과학 도구의 최근 개발, 공간 및 시간 해상도의 전례없는 수준의 신경 회로의 활동을 제어 할 수 있습니다, "optogenetics"라고. 여기에서 우리는 전두엽 피질과 subicular 피라미드 뉴런의 유전 정의 된 부분 집합의 optogenetic 조작과 생체 녹화에 통합하기위한 프로토콜을 제공합니다.
Optogenetic 방법은 종의 넓은 범위에 걸쳐 행동의 다양한 세트를 기본 신경 회로의 활동을 해명하기위한 강력한 도구로 등장했습니다. 미생물 유래의 Optogenetic 도구 (예를 들어, channelrhodopsin-2, ChR2) 또는 침묵 (예를 들어, halorhodopsin, NpHR) 행동으로 관련 척도에 신경 활동 ingenetically 정의 종류의 세포를 활성화 할 수있는 빛에 민감한 막 단백질로 구성되어 있습니다. 우리는 첫 번째 지느러미 subiculum의 쥐의 전두엽 피질의 prelimbic 지역에 ChR2 및 NpHR 도입 유전자의 아데노 – 관련 바이러스 매개 전달을위한 간단한 방법을 보여줍니다. ChR2 및 NpHR 유전자 타겟팅 할 수 있기 때문에, 우리는 높은 시간 정밀도로 이종 조직에 내장 신경 (즉, 피라미드 뉴런)의 특정 개체군의 전기적 활성도를 제어하기위한 본 기술의 사용을 설명한다. 우리는 여기에 하드웨어, 사용자 정의 소프트웨어 업데이트를 설명생체 준비 마취에서 유전자 변형 피라미드 뉴런에서 동시에 빛의 전달 및 전기 녹음 수 있도록 사용자 인터페이스 및 절차에 대해 설명합니다. 이러한 광 응답 툴 정보 처리 및 동작에 다른 세포 유형의 인과 포스팅을 식별하기위한 기회를 제공한다.
시간적으로 정확한 방식으로 신경 회로 내의 특정 세포 유형을 활성화하거나 침묵하는 기능은 신경 회로가 감정과 인식의 기초가 서로 다른 유형의 정보를 처리하는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 그대로 신경 활동을 통해 실험 제어는 제공하지 않습니다 loss-/gain-of-function 도구 (예를 들어, 전기 자극, 약물 변조, 병변)를 채용 한 하나 공간적 시간적 규모로, 뉴런의 특정 인구를 제어하기위한 선택적으로 필요합니다. 바로 이러한 기술적 과제를 해결, 유전자 인코딩 할 빛에 민감한 도구의 개발 및 응용 프로그램은 잘 정의 된 행동 이벤트 기간 동안 셀을 선택 유형의 전기 활동을 제어하는 신경 과학자를 가능하게했다. 이 빛에 민감한 단백질의 대부분은 빛 게이트 양이온 채널, channelrhodopsin-2 (ChR2) 1, 및 광 기반 염화 펌프, halorhodop으로, 미생물 기원합니다죄 널리 사용 (NpHR) 2, 3,.
optogenetics의 가장 큰 장점은 이종 뇌 영역에있는 유전자 표적 특정 세포 집단의 능력과 기술을 성공적으로 모델 생물의 수 (인간이 아닌 영장류에 무척추 동물) 4-6에 적용되었습니다. 많은 optogenetic 형질 전환 동물이 발생하고 7,8 상업적으로 사용할 수 있습니다, 그러나 설립 유전자 변형 라인은 노동 집약적이고 비용 금지 될 수 있습니다되었습니다. 여기서 우리는 재조합 아데노 – 관련 바이러스 (AAV) 벡터를 사용하여 쥐 prelimbic의 피질 및 subiculum의에서 CaMKIIα 프로모터에서 ChR2 및 NpHR 유전자의 바이러스 성 매개 납품을위한 프로토콜을 설명합니다. 전뇌 내 CaMKIIα 식 글루타메이트 피라미드 뉴런 9 배타적입니다. AAV는 일반적으로 인해 상대적으로 생산 및 병원성의 부족의 용이성뿐만 아니라, 기본적인 연구에 사용되는 강한 persi이 벡터 10 달성 한 스텐트 유전자 발현. 또한 우리는 마취 머리 고정 된 쥐에서 동시에 빛의 전달 및 기록하는 단계와 하드웨어를 설명합니다.
기술의 다양한 설치류에서 분리 된 뇌 영역에 미생물 옵신 유전자를 유전자 표적으로 사용할 수 있습니다. 바이러스 성 유전자 전달은 세포 형 특이 ChR2 및 NpHR 표현을 매개 비교적 저렴하고 빠른 방법을 제공합니다. AAV 벡터 시스템은 스토리지, 병원성이 부족하고 장기 유전자 발현 (10)을 생산하는 능력을 유지하는 동안 안정적인 높은 생산 역가 때문에 optogenetic 실험에 사용하기위한 일반적인 선택이다. 세포 형 특이 적 프로모터와 옵신 구조의 대부분은 펜실베니아 대학 (벡터 핵심 시설에서 AAV 혈청 형의 다양한 상업적으로 사용할 수 있습니다 http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore ) 또는 대학 채플 힐의 노스 캐롤라이나 ( http://genetherapy.unc.edu ). AAV 기술에 대한 하나의 단점은셀 고유 타겟팅을 사용할 수있는 유전자 카세트 크기에 제한을 배치 한정된 장비 용량 (~ 4.7 KB). 대안으로,보다 큰 장비 용량 렌티 바이러스 벡터는, 큰 프로모터 서열의 제어하에 표적 옵신를 수용 할 수있다.
optrode의 사용은 일시적으로 정밀한 빛의 전달과 함께 전기 생리학 신호의 신뢰성 감지 할 수 있습니다. 상술 한 바와 같이, 그러나, 충분한주의가 그 건설 필요하다. 절단 된 광섬유가 깨지기 때문에, 너무 단단히 봉합 실을 묶는 것은 섬유가 중단 될 수 있습니다. 전달 광의 전극과 품질의 임피던스가 저하되므로 optrode 여러 레코딩에 사용될 수 있지만, 전극과 광섬유 삽입 이전 세정 (또는 수동으로 광섬유 맨발 단부의 경우 절단)되어야 반복 사용과 함께.
ELE 중ctrophysiological 녹음 그것은 optrode 서서히 전진하는 것이 중요하다. 여기에 사용 optrode 약 350 μm의 두께가 (텅스텐 전극 : 125 μm의, 광섬유의 코어 : 200 ㎛) 및 빨리 저하는 뇌 조직의 움직임으로 이어질 수 있습니다. 빛에 의한 유물은 특정 기록 및 광 전달 셋업 11-12로 간주 될 수 있습니다. 우리가 우리의 실험 조건에서 더 빛을 유도 유물을 발견하지만, 형질 뇌 영역 밖의 기록은 잠재적으로 빛 유물에 대한 제어로 사용할 수 있습니다. 기록 처리 중에 다른 고려 사항은, 특히 장기간 녹화 들면 ChR2 또는 NpHR-발현 뉴런의 변화를 관찰하기위한 필수의 광 강도이다. 강한 레이저 강도와 긴 레이저 조명은 조직 손상 및 / 또는 후속 전달 빛을 12-13로 감소 반응이 발생할 수 있습니다. 행동 실험을 위해서 컨트롤 바이러스 벡터의 사용은 eliminatin 필요G 섬유에서 전달되는 열에 의한 영향. 시판 optogenetic 구조의 많은 옵신 유전자 서열이 제거 된 상보 제어 구조가있다.
그것은 ChR2 특정 실험 질문에 14 ~ 15에 더 적합 할 수있는 다른 침묵 opsins과 함께 개발 된 향상된 특성 및 반응 속도와 변종 설계 주목해야한다. 예를 들어, 대상 돌연변이 유발을 통해 설립 된 새로운 ChR2 변종, "Cheta은은"원래 ChR2 14의 위의 (적어도 200 Hz에서 최대) 주파수에서 높은 충실도의 연결 스파이크를 구동 할 수있다라고합니다.
생체 내에서 빛의 전달 및 신경 반응의 동시 녹음의 조합은 유전자 표적 세포 집단과 해당 시간에 잠 행동 행사에 패턴 활동 사이의 인과 관계를 확립하는 중요한 단계입니다. 절차 및 하여기에 설명 rdware 설치류의 생체 내 머리 고정 녹음에 optogenetics을 구현하는 간단한 방법을 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 약물 남용 (NIDA) 부여 R01 DA24040 (DCC), 콜로라도 대학의 혁신적인 씨 그랜트 (DCC) 및 NIDA 교육 교부금 T32 DA017637 (MVB)에 대한 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl |
Removable Needle | Hamilton | 7803-03 | 31 gauge, beveled tip |
Microinjector Pump | World Precision Instruments | UMP3 | |
Pump Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
Silicone Oil | Alfa Aesar | A12728 | |
Laser Protective Eyeware | Kentek | KMT-4501 | |
Multimode Optical Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm diameter core, 0.37 NA |
Fiber Stripping Tool | Thorlabs | T12S21 | for 200 μm diameter core multimode fiber |
Optical Power Meter | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
Photodetector | Newport | 818-SL/DB | |
Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
Green Laser (532 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
Tungsten/Fiber Optrode | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | Lumitrode |
Glass Capillary Tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MO-22 | |
Amplifier | Kation Scientific | ExAmp-20K | |
Data Acquistion Device | National Instruments | NI USB-6009 | |
Rodent Head Restraint for Recording | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
Small Animal Stereotaxic Unit | David Kopf Instruments | Model 963 |