Den siste utviklingen av nevrovitenskap verktøy som kombinerer genetikk og optikk, kalt "optogenetics", muliggjør kontroll over nevral krets aktivitet med et enestående nivå av romlig og tidsmessig oppløsning. Her gir vi en protokoll for å integrere in vivo-opptak med optogenetic manipulasjon av genetisk definerte undergrupper av prefrontal hjernebark og subicular pyramidale nevroner.
Optogenetic metoder har dukket opp som et kraftig verktøy for å belyse nevral krets aktivitet underliggende et mangfoldig sett av atferd over et bredt spekter av arter. Optogenetic verktøy av mikrobiell opprinnelse består av lys-sensitive membran proteiner som er i stand til å aktivere (f.eks channelrhodopsin-2, CHR2) eller stillhet (f.eks halorhodopsin, NpHR) nevral aktivitet ingenetically definerte celletyper enn atferdsmessig-aktuelle tidsrammer. Vi først demonstrere en enkel tilnærming for adeno-assosiert virus-mediert levering av CHR2 og NpHR transgener til rygg subiculum og prelimbic regionen i prefrontal cortex i rotte. Fordi CHR2 og NpHR er genetisk målrettbar beskriver vi bruk av denne teknologien til å kontrollere den elektriske aktiviteten i bestemte populasjoner av nerveceller (dvs. pyramidale nevroner) innebygd i heterogene vev med høy tidsmessig presisjon. Vi beskriver her maskinvaren, tilpasset programvarebrukergrensesnitt, og prosedyrer som gir mulighet for samtidig lys levering og elektriske opptak fra transduserte pyramidale nevroner i en bedøvet in vivo forberedelse. Disse lys-responsive verktøy gir mulighet for identifisering av det kausale bidragene fra forskjellige celletyper til informasjonsbehandling og virkemåte.
Muligheten til å aktivere eller slå en bestemt celletype i et nervekrets i en timelig presis måte er avgjørende for å forstå hvordan nevrale kretser behandle ulike typer informasjon underliggende følelser og kognisjon. Eksperimentell kontroll over intakt nevrale aktiviteten har ansatt loss-/gain-of-function verktøy (for eksempel elektrisk stimulering, farmakologisk modulering, lesjon) som ikke gir den nødvendige selektivt for å kontrollere bestemte populasjoner av nerveceller, enten på en tidsmessig eller romlig skala. Direkte adressering disse teknologiske utfordringene har utvikling og anvendelse av genetisk-encodable lyssensitive verktøy aktivert nevrologer for å styre den elektriske aktiviteten i utvalgte celletyper i løpet av veldefinerte atferds hendelser. Mange av disse lys-følsomme proteiner er av mikrobiell opprinnelse, med lys-gated kation kanal, channelrhodopsin-2-(CHR2) 1, og lys-klorid drevet pumpe, halorhodopsin (NpHR) 2,3, i utbredt bruk.
En stor fordel med optogenetics er evnen til genetisk mål-spesifikke cellepopulasjoner i heterogene områder av hjernen og teknikken har blitt brukt på en rekke modellorganismer (løse til ikke-menneskelige primater) 4-6. Mange optogenetic transgene dyr har blitt generert og er kommersielt tilgjengelig 7,8, men etablere transgene linjer kan være arbeidskrevende og kostnads uoverkommelige. Her beskriver vi en protokoll for viralt-mediert levering av CHR2 og NpHR gener under CaMKIIα promoter i rotte prelimbic cortex og rygg subiculum ved hjelp av en rekombinant adeno-assosiert virus (AAV) vektor. Innenfor brain, er CaMKIIα uttrykk eksklusivt til glutamatergic pyramidale nevroner ni. AAV er vanlig brukt for grunnleggende forskning på grunn av den relative letthet for produksjon og mangel på patogenitet, så vel som den sterke og persistent transgen ekspresjon som er oppnådd med disse vektorene 10. I tillegg har vi skissere fremgangsmåten og maskinvare for samtidig lys levering og registrering i bedøvede hode-fast rotter.
Et bredt spekter av teknikker er tilgjengelige for genetisk målretting mikrobielle opsin gener til diskrete områder av hjernen hos gnagere. Viral genet levering gir en relativt billig og hurtig metode for å mediere CHR2 og NpHR uttrykk med celle-typen spesifisitet. AAV vektor-systemer er et vanlig valg for bruk i optogenetic eksperimenter på grunn av høye produksjons-titere som forblir stabile under lagring, sin mangel på patogenitet, og dens evne til å produsere langvarig genekspresjon 10.. Mange av opsin konstruerer med celle-typespesifikke arrangører er kommersielt tilgjengelig i en rekke av AAV serotyper fra vektorkjernefasiliteter som University of Pennsylvania ( http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore ) eller universitetet of North Carolina ved Chapel Hill ( http://genetherapy.unc.edu ). En ulempe å AAV teknologi erbegrenset emballasjeplasser (~ 4,7 kb), som setter en begrensning på transgenet kassettstørrelse som kan bli brukt for cellespesifikk målretting. Som et alternativ, lentiviral vektorer, som har en større emballasje kapasitet, er i stand til å romme opsin rettet under styring av større promotorsekvenser.
Bruken av et optrode muliggjør pålitelig deteksjon av elektrofysiologiske signaler i kombinasjon med timelig nøyaktig lys levering. Som beskrevet ovenfor, er imidlertid tilstrekkelig forsiktighet er nødvendig i sin konstruksjon. Siden spaltet optisk fiber er skjøre, kan binde sutur tråden for hardt føre fiber til å bryte. Selv om optrode kan brukes til flere opptak, bør elektroden og den optiske fiber renses (eller manuelt spaltes i tilfellet med den optiske fiber nakne ende) før innføring fordi impedansen av elektroden og kvaliteten av det leverte lyset vil forringe med gjentatt bruk.
Under electrophysiological opptak er det viktig at den optrode fremskyndes langsomt. Den optrode brukt her har omtrent 350 mikrometer tykkelse (wolframelektrode: 125 mikrometer; kjernen av den optiske fiber: 200 mikrometer) og senke det raskt vil kunne føre til bevegelse av hjernevev. Light-indusert gjenstander også kan betraktes med særlig opptak og lys leverings set-ups 11-12. Selv om vi har funnet ikke lys-induserte gjenstand i våre eksperimentelle tilstand, kan opptak utenfor transduced hjerneområdet potensielt bli anvendt som en kontroll for lette gjenstander. En annen vurdering i løpet av innspillingsprosessen er det aktuelle lysintensitet for å observere endringer i CHR2-eller NpHR-uttrykke nevroner, spesielt for langvarige opptak. Sterk laserintensitet og lange laserbelysning kan resultere i skade på vev og / eller en nedsatt respons til følgende levert lys 12-13. For adferds eksperimenter ved bruk av en kontroll viral vektor er nødvendig for eliminating noen virkning på grunn av varme levert fra fiberen. For mange av de kommersielt tilgjengelige optogenetic konstruksjoner er det komplementære styre konstruksjoner hvor opsin gensekvensen er blitt fjernet.
Det bør bemerkes at konstruert CHR2 varianter med forbedrede egenskaper og kinetikk har blitt utviklet sammen med andre støydempere opsins som kan være bedre egnet for visse eksperimentelle spørsmål 14-15. For eksempel, en ny CHR2 variant etablert via målrettet mutagenese, kalt "cheta", kan kjøre high-fidelity nevronale spiking på frekvenser (opp til minst 200 Hz) over det opprinnelige CHR2 14.
Kombinasjonen av in vivo lys levering og samtidig opptak av nevrale responser er et avgjørende skritt i å etablere årsakssammenhenger mellom mønstret aktivitet i genetisk målrettede cellepopulasjoner og tilsvarende tids låst atferds hendelser. Prosedyrene og hardware skissert her gir en enkel tilnærming for å implementere optogenetics for in vivo-hode-faste opptak i gnagere.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institute on Drug Abuse (NIDA) stipend R01 DA24040 (DCC), University of Colorado Innovative Seed Grant (DCC), og NIDA trening stipend T32 DA017637 (MVB).
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl |
Removable Needle | Hamilton | 7803-03 | 31 gauge, beveled tip |
Microinjector Pump | World Precision Instruments | UMP3 | |
Pump Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
Silicone Oil | Alfa Aesar | A12728 | |
Laser Protective Eyeware | Kentek | KMT-4501 | |
Multimode Optical Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm diameter core, 0.37 NA |
Fiber Stripping Tool | Thorlabs | T12S21 | for 200 μm diameter core multimode fiber |
Optical Power Meter | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
Photodetector | Newport | 818-SL/DB | |
Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
Green Laser (532 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
Tungsten/Fiber Optrode | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | Lumitrode |
Glass Capillary Tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MO-22 | |
Amplifier | Kation Scientific | ExAmp-20K | |
Data Acquistion Device | National Instruments | NI USB-6009 | |
Rodent Head Restraint for Recording | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
Small Animal Stereotaxic Unit | David Kopf Instruments | Model 963 |