Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

En metode for High Fidelity optogenetic kontroll av enkeltPyramideFormet Neuroner doi: 10.3791/50291 Published: September 2, 2013
* These authors contributed equally

Summary

Den siste utviklingen av nevrovitenskap verktøy som kombinerer genetikk og optikk, kalt "optogenetics", muliggjør kontroll over nevral krets aktivitet med et enestående nivå av romlig og tidsmessig oppløsning. Her gir vi en protokoll for å integrere in vivo-opptak med optogenetic manipulasjon av genetisk definerte undergrupper av prefrontal hjernebark og subicular pyramidale nevroner.

Abstract

Optogenetic metoder har dukket opp som et kraftig verktøy for å belyse nevral krets aktivitet underliggende et mangfoldig sett av atferd over et bredt spekter av arter. Optogenetic verktøy av mikrobiell opprinnelse består av lys-sensitive membran proteiner som er i stand til å aktivere (f.eks channelrhodopsin-2, CHR2) eller stillhet (f.eks halorhodopsin, NpHR) nevral aktivitet ingenetically definerte celletyper enn atferdsmessig-aktuelle tidsrammer. Vi først demonstrere en enkel tilnærming for adeno-assosiert virus-mediert levering av CHR2 og NpHR transgener til rygg subiculum og prelimbic regionen i prefrontal cortex i rotte. Fordi CHR2 og NpHR er genetisk målrettbar beskriver vi bruk av denne teknologien til å kontrollere den elektriske aktiviteten i bestemte populasjoner av nerveceller (dvs. pyramidale nevroner) innebygd i heterogene vev med høy tidsmessig presisjon. Vi beskriver her maskinvaren, tilpasset programvarebrukergrensesnitt, og prosedyrer som gir mulighet for samtidig lys levering og elektriske opptak fra transduserte pyramidale nevroner i en bedøvet in vivo forberedelse. Disse lys-responsive verktøy gir mulighet for identifisering av det kausale bidragene fra forskjellige celletyper til informasjonsbehandling og virkemåte.

Introduction

Muligheten til å aktivere eller slå en bestemt celletype i et nervekrets i en timelig presis måte er avgjørende for å forstå hvordan nevrale kretser behandle ulike typer informasjon underliggende følelser og kognisjon. Eksperimentell kontroll over intakt nevrale aktiviteten har ansatt loss-/gain-of-function verktøy (for eksempel elektrisk stimulering, farmakologisk modulering, lesjon) som ikke gir den nødvendige selektivt for å kontrollere bestemte populasjoner av nerveceller, enten på en tidsmessig eller romlig skala. Direkte adressering disse teknologiske utfordringene har utvikling og anvendelse av genetisk-encodable lyssensitive verktøy aktivert nevrologer for å styre den elektriske aktiviteten i utvalgte celletyper i løpet av veldefinerte atferds hendelser. Mange av disse lys-følsomme proteiner er av mikrobiell opprinnelse, med lys-gated kation kanal, channelrhodopsin-2-(CHR2) 1, og lys-klorid drevet pumpe, halorhodopsin (NpHR) 2,3, i utbredt bruk.

En stor fordel med optogenetics er evnen til genetisk mål-spesifikke cellepopulasjoner i heterogene områder av hjernen og teknikken har blitt brukt på en rekke modellorganismer (løse til ikke-menneskelige primater) 4-6. Mange optogenetic transgene dyr har blitt generert og er kommersielt tilgjengelig 7,8, men etablere transgene linjer kan være arbeidskrevende og kostnads ​​uoverkommelige. Her beskriver vi en protokoll for viralt-mediert levering av CHR2 og NpHR gener under CaMKIIα promoter i rotte prelimbic cortex og rygg subiculum ved hjelp av en rekombinant adeno-assosiert virus (AAV) vektor. Innenfor brain, er CaMKIIα uttrykk eksklusivt til glutamatergic pyramidale nevroner ni. AAV er vanlig brukt for grunnleggende forskning på grunn av den relative letthet for produksjon og mangel på patogenitet, så vel som den sterke og persistent transgen ekspresjon som er oppnådd med disse vektorene 10. I tillegg har vi skissere fremgangsmåten og maskinvare for samtidig lys levering og registrering i bedøvede hode-fast rotter.

Protocol

En. Virus lagring og tilberedning

  1. Bruken av replikering-inkompetent AAV vektorer for å levere opsin gener til gnager hjernen er godkjent for biosikkerhet Nivå 1 (BSL-en), og krever skikkelig beskyttelse og håndtering prosedyrer som er skissert i den amerikanske regjeringen publikasjon, biosikkerhet i mikrobiologi og Biomedical Laboratories, tilgjengelig på Centers for Disease Control hjemmeside ( http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm ).
  2. For å unngå gjentatte fryse-tine sykluser, pipette virus fra produsentens ampulle i mindre arbeidsgrupper porsjoner i en klasse II biosikkerhet Cabinet og oppbevar i en -80 ° C fryser.
  3. Før stereotaktisk injeksjon, la en prøve for å tine på is og deretter raskt spinne ned med en benk sentrifuge.
  4. Sakte fylle et Hamilton glass sprøyte og nål med en liten mengde silikon eller mineralolje.Pass på at det ikke er noen synlige luftbobler i sprøyten. Sett sprøyten inn en microinjector pumpe og feste pumpen direkte til den vertikale stereotaxic arm (dvs. stereotaksisk manipulator).
  5. Senk stereotaxic armen inntil spissen av nålen treffer bunnen av viruset aliquot røret. Bruke kontrolleren for microinjector pumpe å trekke ønsket volum av virus (1,5 mL for en 1 mL injeksjon).
  6. Alt materiale og overflater som kommer i kontakt med virus må dekontamineres med et desinfeksjonsmiddel, for eksempel klor (10%).

2. Kirurgi og Virus Injection

  1. Anesthetize dyret med en ketamin (rotte, 125 mg / kg, ip) - xylazin (rotte, 10 mg / kg, ip) cocktail. For å måle effekten av anestesi, se etter en refleks respons på en tå klype og gi supplerende doser av ketamin hvis nødvendig. Ved hjelp av standard aseptiske kirurgiske metoder, plassere dyret i en stereotaxic apparat (David Kopf Iinstrumenter).
  2. Lag et midtlinje innsnitt gjennom huden på toppen av det animalske skallen med små kirurgiske sakser eller skalpell. Forsiktig skille bindevev og rengjøre toppen av hodeskallen med en liten bein skrape.
  3. Kontroller at hodet av dyret er plan slik at z-koordinater for bregma, og lambda er like. Bestem stereotaksiske koordinatene for målet hjerneområde fra en hjerneatlas som The Rat Brain i Stereotaxic Koordinater (George Paxinos og Charles Watson, Academic Press, 2007) eller The Mouse Brain i Stereotaxic Koordinater (Keith BJ Franklin og George Paxinos, Academic Press , 2007). Merk den påtenkte injeksjonsstedet med en kirurgisk penn.
  4. Nøye tynn skallen over målområdet ved hjelp av en håndholdt drill og stoppe når borekronen når bunnen av hodeskallen. Ved hjelp av et par ekstra fin pinsett, fjerner tynnet bein for å avdekke dura.
  5. Plasser sprøytespissen over målet eren og senke nålen til den berører dura og bruke dette punktet for å beregne z koordinat. Meget sakte lavere injeksjonsnålen inn i hjernen til riktig z posisjonen er nådd. I denne fremgangsmåte inneholdt prelimbic regionen i den mediale prefrontale cortex (2,7 mm anterior til bregma, ± 0,5 mm lateralt i forhold til midtlinjen, og -2,2 mm fra dura) eller dorsal subiculum (-6,0 mm anterior til bregma, ± 3,0 mm lateral til midtlinjen, og -2,0 mm fra dura) er rettet i en voksen Sprague Dawley hannrotter (ca. 275 g).
  6. Injisere virus med en hastighet på 0,1 mL / min. Etter at injeksjonen er fullført vente 10 min før kanylen trekkes ut for å unngå tilbakestrømning av viruset til hjernens overflate.
  7. Bruk en sy sutur med fast kanyle til å forsegle huden og påfør antibiotika på såret.
  8. Tidsforløpet av CHR2 og NpHR funksjonell ekspresjon fra AAV vektorer vil variere avhengig av den eksperimentelle design og viral titer. For dette eksperimentet in vivo

Tre. Lett Levering og In vivo Innspillingen av CHR2 eller NpHR-uttrykker Nerveceller

  1. Fest en wolframelektrode (~ 1-1,5 MΩ, microprobes) til et glass capillary tube (Fisher Scientific) ved hjelp av superlim.
  2. Bruk av en fiber stripping verktøy (Thorlabs) å eksponere den nakne ende av en optisk fiber (200 mikrometer diameter kjerne, Thorlabs) og rent fiberspiss med etanol. Veldig lett scorer fiber spissen med en kileformet diamant kniv (Thorlabs) og forsiktig fjerne overflødig fiber (f.eks med fin pinsett). The fiber bør holde seg lett på stillingen.
  3. Koble FC enden av fiberen til PC-kontakten på utgang av en 200 mW enkelt diodelaser ( www.Lumiphy.com ) med den ønskede bølgelengde. Sørg for at hensiktsmessige vernebriller er til enhver tid når du arbeider med lasere.
  4. Mål laser intensitet på tuppen av den optiske fiber ved hjelp av en optisk kraftmåler ( www.Lumiphy.com ). For in vivo-opptak, kan lysintensiteten så lite som 20-100 mW / mm 2 på en pålitelig måte fremkalle CHR2-eller NpHR-mediert aktivering eller stanse, henholdsvis, for neuronal aktivitet.
  5. Før den optiske fiberen inn i kapillarrøret. Plasser fiber spissen omtrent 500 mikrometer ovenfor spissen av wolfram-elektroden og binde et tynt suture tråd to ganger på noen få punkter i nærheten av spissen, slik at elektroden og fiberen er rette. Sørge for at avstanden mellom spissen av elektroden og den nærmeste knuten er lang nok for innføring til målområdet.
  6. Forbered dyret som i trinn 2,1 og 2,2 ovenfor. Bruk den første craniotomy som en guide for å gjøre et nytt rent lite vindu i skallen for å posisjonere optrode ( www.Lumiphy.com ). Lag et lite snitt på dura ved hjelp av en tynn nål.
  7. Senk optrode gjennom skallen vinduet og inn i hjernen til transduced regionen ved hjelp av en mikromanipulator (Narishige). Deretter fremme optrode sakte i 10-50 mikrometer trinnene til fremveksten av en lys-responsive celle.
  8. En tilpasset programvare brukergrensesnitt (NeuroLux Pro www.Lumiphy.com ) skrevet i LabVIEW (National Instruments) brukes til å kontrollere den enkelt diode laser og å visualisere og registrere pågående nevrale aktiviteten. Innspilte signaler fanges med en examp-20K (Kation Scientific) forsterker band-pass filtrert (0,3 til 8 kHz), og en National Instruments analog til digital bord (NI USB-6009). Den NeuroLux Pro brukergrensesnittet gjør at valg av analoge innganger (velg to kanaler for nevronale og TTL-signal) og digital utgang. Brukeren kan definere samplingsfrekvens (20 kHz), grunnlagsperioden (pre-lys), og post-lys periode. Brukeren kan definere TTL laser stimulatipå pulsbredde, frekvens og stimulering periode (hvis frekvens er 20 Hz og stimulering perioden er 500 msek, er 10 laser pulser med definerte pulsbredde levert). Brukeren kan også velge kontinuerlig lys levering (f.eks, figur 1). For gjentatte innspillinger, brukeren kan også definere antall pulsrekkekfølgen og intervallet mellom togene. Data kan bli kjøpt med eller uten opptak til disk.
  9. Etter opptak, blir dyrene bedøvet med ketamin / xylazin cocktail og transcardially perfundert med fysiologisk saltvann, og paraformaldehyd (4%) for å verifisere optrode plassering og opsin ekspresjon.

Representative Results

Figur 1 viser et skjermbilde av tilpasset programvare (NeuroLux Pro) utviklet i LabVIEW miljø (National Instruments) som brukes for samtidig opptak av neuronal aktivitet og styring av lys puls parametre (dvs. puls frekvens, pulsbredde, stimulering periode). Programmet sender et kommandosignal til en digital innhentingsenhet som genererer TTL-pulser for kontroll over den ene diodelaser. I tillegg Programvaren viser og lagrer den innspilte neuronal aktivitet og levert TTL-signaler. Disse signalene blir digitalisert gjennom oppkjøpet enheten ved en definert samplingsfrekvens (f.eks 20 kHz). Innspilte signaler blir lagret som en todimensjonal matrise dobbel presisjon i en binærfil.

Fig. 2 viser den tilpassede optrode som består av en wolframelektrode er koblet til en optisk fiber. En optisk fiber er festet til elektroden ved hjelp av tynne sutur tråden på trepoeng. Hvis det er nødvendig, kan superlim brukes til å følge dem. Imidlertid unngår permanent feste den optiske fiber til elektroden fordi selv om elektroden kan brukes om igjen flere ganger, lystransmisjon gjennom fiberen vil nedbrytes ved gjentatt bruk, og må spaltes og renses eller erstattes med hver innsetting inn i hjernen.

Venstre panel av figur 3 viser fluorescerende bilder av forbedret gul fluoriserende protein, noe som indikerer faktiske CHR2 og NpHR uttrykk. Disse fotografiene viser representative NpHR uttrykk i rotte rygg subiculum (figur 3A) og CHR2 uttrykk i prelimbic cortex (Figur 3B). Viral uttrykk ble begrenset meste til rygg subiculum og prelimbic cortex (f.eks noen fluorescens ble observert i dentate gyrus (figur 3A, venstre)). Sporene av elektroden (tynn spor, pil hodet) og optisk fiber (tykk spor, pil) ble også observert.

figur 4 viser at CHR2 indusert tidsmessig nøyaktig spiking i rotte cortex prelimbic. Figur 4A er et eksempel på spor av CHR2-utløste aksjonspotensialer som reaksjon på 20 Hz levering av 10 msek blått lyspulser til rotte prelimbic cortex. Raster tomten (Figur 4B) viser CHR2-indusert aktivering i seks representative nevroner. Alle registrerte nevroner viste lys-fremkalt spiking med perfekt gjengivelse. I motsetning til CHR2, NpHR hurtig og reversibelt brakt til taushet spontan aktivitet in vivo i rotte prelimbic cortex (høyre panel i figur 4). Figur 4C er et eksempel som viser at kontinuerlige spor 532 nm lys (10 s) i prelimbic cortex uttrykker NpHR under CaMKllα promoter eliminerer spontan enkeltenhet-aktivitet in vivo. Legg merke til at den komplette stanse all prelimbic pyramide celle aktivitet er tid-låst til 10 sek kontinuerlig lys levering. Laveh raster tomten (Figur 4D) viser NpHR-indusert stanse i seks representative nevroner. Både in vivo-opptak er typisk for de som ble oppnådd fra voksne Sprague-Dawley-rotter som AAV-mediert levering av mikrobielle opsin gener oppsto 18-21 dager før.

Figur 5 viser resultatet av gjentatt CHR2 stimulering av en rotte prelimbic pyramidal neuron. Blått lys puls (10 msek) ble levert på 20 Hz for 5 sek (100 pulser totalt). Spennings spor av lys-fremkalt spiking ble gjentatte ganger kjøpt hver 2 min under en to timers innspilling (61 repetisjoner totalt). Selv ved bruk av denne repeterende stimulasjons-protokoll, CHR2 indusert stabil og robust spiking som reaksjon på lyset levering.

Figurene 6 og 7 viser resultatene av NpHR-indusert photoinhibition og CHR2-drevet fotoaktivering av rotte subicular neuron-aktivitet. Som tilfellet er i prelimbic cortex, NpHR og CHR2 var i stand til åmediere lysindusert tid-låst inhibering og aktivering av opsin-transduced subicular neuroner med høy reproduserbarhet.

Figur 1
Figur 1. Skjermbilde av NeuroLux Pro programvaregrensesnitt for samtidig lys levering og elektrofysiologisk registrering. Avbildet spor viser NpHR indusert stanse av spontan aktivitet av rotter prelimbic pyramidecelle i respons til 10 sek med kontinuerlig 532 nm lys levering. Klikk her for å se større figur .

Fig. 2
Figur 2. Høy effekt bilde av tilpassede optrode. En optisk fiber er satt inn i glass kapillarrør forbundet med en wolframelektrode og festes til elektroden ved hjelp av sutur tråd. Senter-til-senter avstand between elektrodespissen og fiber spissen er omtrent 500 mikrometer.

Figur 3
Figur 3. Viral uttrykk og optrode plassering. (Venstre) Fotografier viser representative NpHR uttrykk i rygg subiculum (A) og CHR2 uttrykk i prelimbic cortex (B). (Høyre) Skjematisk som representerer stedet der hvert bilde ble tatt. Pilspissen og pilen i hvert bilde angir plasseringen av wolfram-elektroden og den optiske fiber, respektivt. SUB: subiculum, DG: dentate gyrus, PL:. Prelimbic cortex Klikk her for å se større figur .

Figur 4
Figur 4 In vivo elektrofysiologiske opptak fra CHR2 eller NpHR-transduced rotte prelimb.ic cortex. (A) Eksempel spor av CHR2-utløst aksjonspotensialer i respons til 20 Hz levering av blå (473 nm) lyspulser (10 msek, blå søyle). (B) Raster plott som viser CHR2-indusert spiking i seks representative nevroner. Hver enhet aktivitet er plottet som en prikk. (C) Eksempel spor av NpHR-indusert undertrykkelse av spontan aktivitet under kontinuerlig grønt (532 nm) lys belysning (10 sek, grønn bar). (D) Raster plott som viser NpHR-indusert stanse i seks representative nevroner. Hver enhet aktivitet er plottet som en prikk. Klikk her for å se større figur .

Figur 5
Figur 5. Gjentatte 20 Hz CHR2-drevet spiking av en rotte prelimbic pyramide nevron in vivo. (A) Spenning spor av lys-fremkalt spikingervervet på tidspunkter 0, 30, 60, 90, 120 min etter begynnelsen av opptakene. (B) Raster plott som viser alle 61 repetisjoner (2 min inter-prøveintervall, 120 min totalt) av lys-indusert aktivering. Hver enhet aktivitet er plottet som en prikk. Klikk her for å se større figur .

Figur 6
Figur 6. In vivo elektrofysiologiske opptak fra NpHR-transduced rotte rygg subiculum. (A) Eksempel spor som viser at 10 sek kontinuerlig 532 nm lys (grønn bar) av dorsal subiculum uttrykker NpHR eliminerer spontan aktivitet. (B) Gjennomsnitt bølgeformer for de to registrerte enheter fra de ovennevnte spor. Amplituden terskel ble brukt for å identifisere to forskjellige neuroner. (C) Raster plott som viser fem repetisjons av NpHR-indusert stanse av disse enhetene. Hver enhet aktivitet er plottet som en prikk.

Figur 7
Figur 7. Gjentatte 20 Hz CR2-drevet spiking av en rotte rygg subicular nevron in vivo. (A) Spenning spor av lys-fremkalt skyter ervervet på tidspunkter 0, 30, 60, 90, 120 min etter begynnelsen av opptakene. Innfelt: typisk sprengning aktivitet av denne cellen. (B) Raster plott som viser alle 61 repetisjoner (2 min inter-prøveintervall, 120 min totalt) av lys-indusert aktivering. Hver enhet aktivitet er plottet som en prikk. Klikk her for å se større figur .

Discussion

Et bredt spekter av teknikker er tilgjengelige for genetisk målretting mikrobielle opsin gener til diskrete områder av hjernen hos gnagere. Viral genet levering gir en relativt billig og hurtig metode for å mediere CHR2 og NpHR uttrykk med celle-typen spesifisitet. AAV vektor-systemer er et vanlig valg for bruk i optogenetic eksperimenter på grunn av høye produksjons-titere som forblir stabile under lagring, sin mangel på patogenitet, og dens evne til å produsere langvarig genekspresjon 10.. Mange av opsin konstruerer med celle-typespesifikke arrangører er kommersielt tilgjengelig i en rekke av AAV serotyper fra vektorkjernefasiliteter som University of Pennsylvania ( http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore ) eller universitetet of North Carolina ved Chapel Hill ( http://genetherapy.unc.edu ). En ulempe å AAV teknologi erbegrenset emballasjeplasser (~ 4,7 kb), som setter en begrensning på transgenet kassettstørrelse som kan bli brukt for cellespesifikk målretting. Som et alternativ, lentiviral vektorer, som har en større emballasje kapasitet, er i stand til å romme opsin rettet under styring av større promotorsekvenser.

Bruken av et optrode muliggjør pålitelig deteksjon av elektrofysiologiske signaler i kombinasjon med timelig nøyaktig lys levering. Som beskrevet ovenfor, er imidlertid tilstrekkelig forsiktighet er nødvendig i sin konstruksjon. Siden spaltet optisk fiber er skjøre, kan binde sutur tråden for hardt føre fiber til å bryte. Selv om optrode kan brukes til flere opptak, bør elektroden og den optiske fiber renses (eller manuelt spaltes i tilfellet med den optiske fiber nakne ende) før innføring fordi impedansen av elektroden og kvaliteten av det leverte lyset vil forringe med gjentatt bruk.

Under electrophysiological opptak er det viktig at den optrode fremskyndes langsomt. Den optrode brukt her har omtrent 350 mikrometer tykkelse (wolframelektrode: 125 mikrometer; kjernen av den optiske fiber: 200 mikrometer) og senke det raskt vil kunne føre til bevegelse av hjernevev. Light-indusert gjenstander også kan betraktes med særlig opptak og lys leverings set-ups 11-12. Selv om vi har funnet ikke lys-induserte gjenstand i våre eksperimentelle tilstand, kan opptak utenfor transduced hjerneområdet potensielt bli anvendt som en kontroll for lette gjenstander. En annen vurdering i løpet av innspillingsprosessen er det aktuelle lysintensitet for å observere endringer i CHR2-eller NpHR-uttrykke nevroner, spesielt for langvarige opptak. Sterk laserintensitet og lange laserbelysning kan resultere i skade på vev og / eller en nedsatt respons til følgende levert lys 12-13. For adferds eksperimenter ved bruk av en kontroll viral vektor er nødvendig for eliminating noen virkning på grunn av varme levert fra fiberen. For mange av de kommersielt tilgjengelige optogenetic konstruksjoner er det komplementære styre konstruksjoner hvor opsin gensekvensen er blitt fjernet.

Det bør bemerkes at konstruert CHR2 varianter med forbedrede egenskaper og kinetikk har blitt utviklet sammen med andre støydempere opsins som kan være bedre egnet for visse eksperimentelle spørsmål 14-15. For eksempel, en ny CHR2 variant etablert via målrettet mutagenese, kalt "cheta", kan kjøre high-fidelity nevronale spiking på frekvenser (opp til minst 200 Hz) over det opprinnelige CHR2 14.

Kombinasjonen av in vivo lys levering og samtidig opptak av nevrale responser er et avgjørende skritt i å etablere årsakssammenhenger mellom mønstret aktivitet i genetisk målrettede cellepopulasjoner og tilsvarende tids låst atferds hendelser. Prosedyrene og hardware skissert her gir en enkel tilnærming for å implementere optogenetics for in vivo-hode-faste opptak i gnagere.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institute on Drug Abuse (NIDA) stipend R01 DA24040 (DCC), University of Colorado Innovative Seed Grant (DCC), og NIDA trening stipend T32 DA017637 (MVB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Syringe Hamilton 7653-01 10 μl
Removable Needle Hamilton 7803-03 31 gauge, beveled tip
Microinjector Pump World Precision Instruments UMP3
Pump Controller World Precision Instruments SYS-MICRO4
Silicone Oil Alfa Aesar A12728
Laser Protective Eyeware Kentek KMT-4501
Multimode Optical Fiber Thorlabs BFL37-200 200 μm diameter core, 0.37 NA
Fiber Stripping Tool Thorlabs T12S21 for 200 μm diameter core multimode fiber
Optical Power Meter Lumiphy LLC www.lumiphy.com
Photodetector Newport 818-SL/DB
Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW) Lumiphy LLC www.lumiphy.com coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter
Green Laser (532 nm, 100-200 mW) Lumiphy LLC www.lumiphy.com coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter
Tungsten/Fiber Optrode Lumiphy LLC www.lumiphy.com Lumitrode
Glass Capillary Tube Fisher Scientific 22-362-566
Hydraulic Micromanipulator Narishige MO-22
Amplifier Kation Scientific ExAmp-20K
Data Acquistion Device National Instruments NI USB-6009
Rodent Head Restraint for Recording Lumiphy LLC www.lumiphy.com
Small Animal Stereotaxic Unit David Kopf Instruments Model 963

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, (9), 1263-1268 (2005).
  2. Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2, (3), e299 (2007).
  3. Zhang, F., Wang, L. P., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, (7136), 633-639 (2007).
  4. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15, (24), 2279-2284 (2005).
  5. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, (7168), 420-424 (2007).
  6. Han, X. Optogenetics in the nonhuman primate. Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).
  7. Zhao, S., Ting, J. T., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8, (9), 745-752 (2011).
  8. Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing. Nat Neurosci. 15, (5), 793-802 (2012).
  9. Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, eg Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system. Neuroscience. 46, (4), 825-849 (1992).
  10. McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS. Curr Gene Ther. 5, (3), 333-338 (2005).
  11. Cardin, J. A., Carlen, M., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat Protoc. 5, (2), 247-254 (2010).
  12. Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. J Physiol Paris. 106, (3-4), 104-111 (2012).
  13. Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J Neurosci. 31, (29), 10529-10539 (2011).
  14. Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13, (3), 387-392 (2010).
  15. Chow, B. Y., Han, X., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463, (7277), 98-102 (2010).
En metode for High Fidelity optogenetic kontroll av enkeltPyramideFormet Neuroner<em&gt; In vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nakamura, S., Baratta, M. V., Cooper, D. C. A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo. J. Vis. Exp. (79), e50291, doi:10.3791/50291 (2013).More

Nakamura, S., Baratta, M. V., Cooper, D. C. A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo. J. Vis. Exp. (79), e50291, doi:10.3791/50291 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter