Summary
Tilstedeværelsen av stabile microRNAs (miRNAs) i exosomes har generert enorm interesse som en roman modus for intercellular kommunikasjon, for deres potensielle nytten som biomarkører og som en rute for terapeutisk intervensjon. Her viser vi exosome rensing fra blod og kultur media etterfulgt av kvantitativ PCR til å identifisere miRNAs som transporteres.
Abstract
Stabile miRNAs er tilstede i alle kroppsvæsker og noen sirkulerende miRNAs er beskyttet mot nedbrytning ved lagring i små blærer som kalles exosomes. Exosomes kan smelte sammen med plasmamembranen som resulterer i overføring av RNA og proteiner til målcellen. Deres biologiske funksjoner inkluderer immunrespons, antigenpresentasjon, og intracellulær kommunikasjon. Levering av miRNAs som kan regulere genuttrykket i mottakerlandene celler via blod har åpnet nye veier for target intervensjon. I tillegg til å tilby en strategi for levering av legemidler eller RNA terapeutiske midler, kan exosomal innholdet tjene som biomarkører som kan hjelpe i diagnosen, bestemme behandlingsalternativer og prognose.
Her vil vi beskrive prosedyren for kvantitativt analysere miRNAs og messenger RNA (mRNA) fra exosomes utskilles i blodet og cellekulturmedier. Purified exosomes vil være preget bruke western blot analyse for ExosOmal markører og PCR for mRNA av interesse. Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og immungullmerkingsteknikk vil bli brukt til å validere exosomal morfologi og integritet. Totalt RNA blir renset fra disse exosomes for å sikre at vi kan studere både mRNA og miRNA fra samme prøve. Etter validering RNA integritet ved Bioanalyzer, vil vi utføre en medium gjennomstrømming kvantitativ sanntids PCR (qPCR) for å identifisere exosomal miRNA hjelp Taqman Low Density Array (TLDA) kort og genuttrykk studier for transkripsjoner av interesse.
Disse protokollene kan brukes til å kvantifisere endringer i exosomal miRNAs hos pasienter, gnager modeller og cellekultur media før og etter farmakologisk intervensjon. Exosomal innholdet variere på grunn av kilden til opprinnelsen og fysiologiske forhold av celler som skiller ut exosomes. Disse variasjonene kan gi innsikt i hvordan celler og systemer takle stress eller fysiologiske forstyrrelser. Våre representative data viser variations i mirnas stede i exosomes renset fra mus blod, menneskeblod og menneskelige cellekulturmedier.
Her vil vi beskrive prosedyren for kvantitativt analysere miRNAs og messenger RNA (mRNA) fra exosomes utskilles i blodet og cellekulturmedier. Purified exosomes vil være preget bruke western blot analyse for exosomal markører og PCR for mRNA av interesse. Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og immungullmerkingsteknikk vil bli brukt til å validere exosomal morfologi og integritet. Totalt RNA blir renset fra disse exosomes for å sikre at vi kan studere både mRNA og miRNA fra samme prøve. Etter validering RNA integritet ved Bioanalyzer, vil vi utføre en medium gjennomstrømming kvantitativ sanntids PCR (qPCR) for å identifisere exosomal miRNA hjelp Taqman Low Density Array (TLDA) kort og genuttrykk studier for transkripsjoner av interesse.
Disse protokollene kan brukes til å kvantifisere endringer i exosomal miRNAs in pasienter, gnager modeller og cellekultur media før og etter farmakologisk intervensjon. Exosomal innholdet variere på grunn av kilden til opprinnelsen og fysiologiske forhold av celler som skiller ut exosomes. Disse variasjonene kan gi innsikt i hvordan celler og systemer takle stress eller fysiologiske forstyrrelser. Våre representative data viser presentere variasjoner i miRNAs i exosomes renset fra mus blod, menneskeblod og menneskelige cellekulturmedier
Introduction
Korte noncoding mirnas modulere genuttrykk ved å binde seg til målet mRNA. Seed sekvens komplementaritet ~ 7 basepar muliggjør miRNA å binde seg til mål-mRNA som resulterer i hemming av translasjon eller i reduksjon i stabiliteten av mRNA, som begge kan resultere i redusert ekspresjon av målproteinet 1.. Forskning det siste tiåret har utvetydig bevist en fundamental rolle for miRNAs i formidling cellulære funksjoner. Det har også vært betydelig innsats rettet mot dissekere miRNA medierte molekylære endringer som ligger til grunn ulike sykdommer 2,3. Videre banet siste identifisering av stabile miRNAs i kroppsvæsker 4-6 veien for deres bruk som nye biomarkører mottagelig for klinisk diagnose.
En modus av miRNA transport i kroppsvæsker er via exosomes, små blemmer som bærer mRNA, proteiner, lipid mediatorer, og MiRNAs til mottaker celler via systemisk blod mikrosirkuion 7-14. Dette resulterer i modulering av genekspresjon i mottakercellene og representerer en ny mekanisme for cellulær kommunikasjon. For eksempel kan celler som modulerer immun-regulerende prosesser ved sekresjon og / eller absorberende exosomes inneholdende biomolekyler som er involvert i inflammasjon, for eksempel interleukin-1β (IL1β), tumor nekrose faktor-α (TNF-alfa), transformerende vekstfaktor-β5 (TGFβ5), og de miRNAs som regulerer disse genene 13. Som avvikende miRNA uttrykk er en vanlig funksjon i en rekke menneskelige sykdommer, disse molekylene tilby spennende nye muligheter for oppdagelsen og validering av nye terapeutiske mål to.
Sirkulerende mirnas er tilstede i alle kroppsvæsker og det er kjent at sammensetningen av exosomes er forskjellig basert på kilden celler fra hvilke de ble gitt. Dermed de tilbyr en vei å studere fysiologiske status av cellene og hvordan cellene alter signaliserer endats som svar på stress, inkludert sykdommer. Studerer endringer i exosome sammensetning kan gi innsikt i signaloverføring og undersøke deres potensielle nytten som biomarkører eller terapeutisk intervensjon ruter.
Her vil vi demonstrere rensing av exosomes fra flere kilder basert på publiserte protokoller. Disse exosomes vil bli brukt for RNA isolering etterfulgt av qPCR for å identifisere og måle nivåene av mirnas stede i exosomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter med blodprøver fra mennesker og gnagere ble henrettet i samsvar med alle gjeldende retningslinjer, forskrifter og offentlige myndigheter. Forsøkspersoner ble rekruttert etter å gi informert samtykke som er godkjent av Drexel University College of Medicine Institutional Review Board og alle prosedyrer for studier utført ved hjelp av dyr ble godkjent av Drexel Institutional Animal Care og bruk komité.
En. Exosome Rensing fra Blood (~ 5,5 t)
TIPS
- Vi resuspender exosomes fra ett rør av blod (~ 10 ml menneskeblod og ~ 2 ml mus blod) i 300 mL RNA lysis buffer fra Mirvana miRNA isolasjon kit.
- For å rense exosomes fra cellekulturmedier, blir mediet sentrifugert ved 500 xg i 10 min for å fjerne celler og også filtrert gjennom et 0,22 mikrometer filter etter sentrifugering ved 12.000 x g i. Den exosome rensing fra cellekulturmedierikke krever en fortynning i PBS, PBS-vask eller den andre ultrasentrifugering trinnet.
- Hvis de rensede exosomes vil bli brukt for proteomikk studier, og legger en sukrosegradient sentrifugeringstrinnet etter ultracentrifugation trinnet vil redusere mengden av protein aggregater og forurensninger 15.
- Den observerte morfologi av exosomes kan variere avhengig av både kilde og behandling trinn for TEM. Vi observerte ikke kopp formet morfologi for exosomes som tidligere er tilskrives forskjeller i utvalgets behandling 9,15. Våre TEM bilder, inkludert den immungullmerkingsteknikk er lik tidligere rapporter fra ulike kilder, inkludert blod, galle og kortikale kultur avledet exosomes 9,16,17.
- Invert EDTA-belagte rør som inneholder blodet 5x og sted stående ved romtemperatur i 10-60 min.
- Sentrifuger ved 2000 x g i 15 min ved 4 ° C. Samle det øverste laget, plasma, i 15 ml rør og holde på is.
- Fortynn væske med et like stort volum av PBS. Sentrifuger 30 minutter ved 2000 xg ved 4 ° C.
- Overfør til sentrifugerør, tilsett 1X PBS i et samlet volum på 24 ml, og sentrifugeres 45 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C.
- Overføring til Ultrasentrifuger rør og sentrifuger 2 timer ved 110 000 xg ved 4 ° C.
- Resuspender pellet i PBS og sentrifuger 1 time ved 100.000 x g ved 4 ° C.
- Resuspender pellet i passende buffer (RNA lysis buffer).
- Gjensuspender i PBS eller RIPA buffer for elektronmikroskopi og western blot analyse henholdsvis.
2. RNA Rensing hjelp av en modifisert Mirvana miRNA Isolation Kit (~ 1 time)
TIPS
- Klargjøre området for å isolere RNA ved å bruke personlig verneutstyr (PVU), tørke overflater og pipetter med RNase Zap, og ved hjelp av sterile filter tips og rør.
- Å legge til en on-column DNase behandling trinnet fjerner spor av DNA som kan være tilstede. Avhengig av kilden til exosomes har DNA blitt rapportert å være fraværende i exosomes renset fra noen kilder, inkludert mus og menneskelige mast cellelinjer 8 men kromosomale DNA-sekvenser har blitt oppdaget i exosomes renset fra media av dyrkede cardiomyocytes 18.
- Vi reduserte volumet av vask løsning 1-350 ul (trinn 2.4 nedenfor) fordi leverandøren gir bare nok Vask løsning en for en 700 ul tillegg. Hvis volumet ikke er redusert er det ikke tilstrekkelig oppløsning igjen for å bruke hele innholdet i settet. Gjenværende trinnene ble utført i henhold til produsentens anbefalinger.
- Legg 1/10 volume av miRNA Homogenat Additive (30 pl) og inkuberes på is i 10 min.
- Ekstraher med et volum av syre-fenol: kloroform lik den opprinnelige volum lysate. Sentrifuger og gjenopprette den øvre fase i et nytt rør.
- Legg 1,25 volum 100% etanol (375 ul). Vortex. Bruk for å filtrere kassett og sentrifuger 15 sek på 10 000 x g.
- Tilsett halvparten av anbefalte volum miRNA Wash Solution 1 (350 mL) og sentrifuger 15 sek på 10 000 x g.
- Tilsett 10 mL DNase 1 til 70 mL buffer RDD (Qiagen) for hver prøve. Tilsett 80 ul til kolonnen og inkuberes 15 minutter ved romtemperatur.
- Legg Vask Løsning 1 (350 mL) og sentrifuger 15 sek på 10 000 x g.
- Legg Vask Løsning 2/3 (500 mL) og sentrifuger 15 sek på 10 000 x g. GJENTA.
- Eluer med 40 pl 95 ° C nukleasefritt H2O
- Bestemme konsentrasjonen av RNA og RNA fortynnes til 100 ng / mL.
3. miRNA Profilering av Exosomes fra Blood Bruk Taqman Low Density Array (TLDA) kort (~ 6,5 t)
TIPS
- Klargjøre området for å isolere RNA ved iført verneutstyr, tørke overflater og pipetter med RNase Zap, og ved hjelp av sterile filter tips og rør.
- Pre-forsterkning (pre-amp) steg anbefales for 1-350 ng RNA (350-1,000 ng prøvene ikke krever pre-amp steg etter cDNA syntese). Det er viktig å finne ut om pre-amp er nødvendig for utvalget ditt fordi du må behandle alle prøvene under like forhold. Pre-amp trinnet legger kostnadene og Ct-verdiene har en lavere akseptabelt cut off (32 i stedet for 40).
- Det er nyttig å fremstille cDNA-reaksjon i strip-rør i stedet for en plate, avhengig av antall kort som kan kjøres på en enkelt dag. Dette vil redusere fryse-tine av cDNA-prøvene som ikke vil bli behandlet på samme dag.
- Exosomes samlet inn fra forskjellige kilder har diffeleie mengder av RNA. Denne protokollen tillater maksimalt tre ul RNA mal for cDNA syntese reaksjon. Avhengig av kilden, mengden av exosomal RNA som kan bli isolert kanskje begrenset. Mens en typisk vev ville gi nok RNA som cDNA ville bli gjort fra 100 ng RNA i 3 mL volum, Exosomes fra humant blod eller humane cellekulturmedier ofte inneholde mindre RNA og cDNA må være laget av mindre utgangsmateriale. Mus blod exosomes inneholder høyere nivåer av RNA og minst 100 ng i 3 mL kan oppnås.
- For å forberede cDNA fra renset RNA ved hjelp megaplex Pools reverstranskriptasehemmere primere (Pool A og Pool B inneholder primere for miRNAs på microfluidic kort Array A og B), tine reaksjonskomponentene på is.
- Etiketten to RNase-frie 1,5 ml rør for RT reaksjon med Pool A primere eller Pool B primere og legge til komponenter i diagrammet rekkefølge. Tilsett minst ett ekstra volum av komponenter for to eller flere reaksjoner eller foreta en konsentrat-blanding som anbefalt av than leverandøren.
| RT reaksjon Component | Komponent Konsentrasjon | Volum for en prøve (total V / sample = 4.5 ul) |
| Nukleasefritt vann | 0,20 ul | |
| Megaplex RT buffer (10X) | 1X | 0.80 ul |
| dNTPs (100 mm) | 4,4 mM | 0,20 ul |
| MgCl 2 (25 mm) | 5 mM | 0.90 ul |
| RNase Inhibitor (20U/μl) | 2 U | 0,10 ul |
| Megaplex RT Primere A eller B (10X) | 1X | 0.80 ul |
| MultiScribe revers transkriptase | 75 U | 1,50 ul |
- Inverter rør seks ganger og ørerifuge kort. Deretter pipette 4,5 ul RT reaksjon bland inn MicroAmp 8-tube Strips eller en 96-brønn MicroAmp optisk reaksjon plate.
- Tilsett 100 ng av RNA og justere volumet til tre ul med DEPC behandlet vann eller legge 3 mL total RNA, rør med pipette spissen, og forsegle rør eller plate. Spinn kort og ruge på is i 5 min.
- Laste reaksjonen til PCR maskin og kjøre den under følgende forhold (som anbefalt av Applied Biosystems Megaplex Pools protokoll):
| Stage | Temp | Tid |
| Cycle (40x) | 16 ° C | 2 min |
| 42 ° C | 1 min | |
| 50 ° C | 1 sek | |
| Hold | 85 ° C | 5 min |
| Hold | 4 ° C | ∞ |
- Oppbevar cDNA ved -20 ° C (bra i minst én uke) eller fortsett til forforsterker trinn som kan lagres i en uke.
- Tine preamp primere for Pool A og Pool B på is og invertere å blande. Swirl Taqman Pre-Amp mester mikse og holde på is også.
- Følg diagrammet legge minst ett ekstra volum av komponenter for to eller flere reaksjoner eller lage en master mix som anbefalt av leverandøren.
| Pre-Amp Reaction Component | Volum for en prøve |
| Nukleasefritt vann | 7.5 ul |
| Taqman PreAmp Master Mix (2X) | 12.5 ul |
| Megaplex preamp Primere A eller B (10X) | 2,5 pl |
- Pipetter 2,5 mL RT proct inn MicroAmp 8-tube Strips eller en 96-brønn MicroAmp optisk reaksjon plate og dispensere 22,5 ul PreAmp reaksjon bland inn hver brønn.
- Tett plate, ruge på is 5 min og deretter laste prøven i PCR maskin. Kjør under følgende forhold.
| Stage | Temp | Tid |
| Hold | 95 ° C | 10 min |
| Hold | 55 ° C | 2 min |
| Hold | 72 ° C | 2 min |
| Cycle (12x) | 95 ° C | 15 sek |
| 60 ° C | 4 min | |
| Hold | 99.9 ° C | 10 min |
| Hold | 4 ° C | ∞ |
- Etter forforsterkeren reaksjonen er ferdig kort sentrifuger rør eller plate og deretter legge til 75 pl 0,1 x TE pH 8,0 til hver brønn eller et rør.
- Seal og mikse og spinne kort. Oppbevar utvannet produkt for en uke på -20 ° C eller fortsette på å laste plate.
- Kombiner de følgende i en RNase-fri 1,5 ml rør på is.
| Komponent | Volum for en kort |
| Taqman Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG (2X) | 450 ul |
| Fortynnet preamp produkt | 9 ul |
| Nukleasefritt vann | 441 ul |
- Snu røret å mikse og sentrifuger kort. Tilsett 100 ul PCR reaksjon bland inn hver port av Taqman MikroRNA Array kort.
- Sentrifuger kortet 2 x 1000 x g i 1 min. Tett kortet og kjøre den ved hjelp av malen følger med primere i Applied Biosystems håndboken og 384 brønner TaqMan lav tetthet Array innstillinger. Vi bruker Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System.
4. mRNA Analyse av Taqman (~ 1,5 t)
- For å forberede qPCR reaksjon, bland reaksjonskomponentene i den rekkefølgen i diagrammet. Alle prøver blir analysert i primer prober for genet av interesse, så vel som 18S rRNA som normalizer genet.
| Taqman Reaction Component | Volum for en prøve |
| Nukleasefritt vann | 7 ul (justere basert på individuell prøve) |
| Taqman Fast Master Mix (2X) | 10 pl |
| TaqMan Primer prober (20x) | 1 ul |
| cDNA fra 100 ng RNA | 2 & mu; L (justere basert på individuell prøve) |
- Kjør plate med 96 brønner ved hjelp av Fast 96-brønn blokk som anbefalt av produsenten (Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter å isolere exosomes fra blod eller cellekultur-mediet, kan renheten av exosomes testes ved elektronmikroskopi (EM) og Western blot (figurene 1A og 1B). Vi bekreftet våre exosome preparater fra ulike kilder med EM og western blot ved hjelp av flere antistoffer. Figur 1A viser EM bildene bekrefter at exosomes er intakt med en diameter på ~ 30 -100 nm og inneholder CD81 ved immungullmerkingsteknikk. Vanlig brukte exosomal markører er hsp70 og tetraspannin familie glykoproteiner CD63, CD81 og CD9 14. Etter å ha bekreftet integriteten til de rensede exosomes, utførte vi western blot for Hsp70 i figur 1B og viste at exosomes inneholder Hsp70 mens media alene (negativ kontroll) ikke. Den Bioanalyzer spor viser at exosomes isolert fra RAW cellekulturmedier inneholder en rekke RNA, men som ikke inneholder store mengder ribosomale RNA som er typiske i RNA fra helecelle (figur 1C). Figur 1D viser qPCR analyse av mRNA fra blod og exosomes avledet fra blod. Vi er i stand til å isolere 500 ng av exosomal RNA fra ~ 10 ml blod fra mennesker bruker Mirvana miRNA isolasjon kit. QPCR Resultatene indikerer tilstedeværelse av mRNA som koder for TNF-alfa og vaskulær endotelial vekstfaktor A (VEGFA) i renset exosomes samt i fullblod.
I tillegg til qPCR for genekspresjon studier, ble total RNA også brukt for miRNA profilering. MiRNA TLDA kort versjon 3.0 inneholder primer prober for ~ 758 mirnas inkludert den endogene kontroll RNA U6. Med tillegg av pre-amplifikasjonstrinn, anbefaler leverandøren 30 ng RNA til å kjøre en TLDA kort. Dette er nyttig for å analysere RNA fra exosomes renset fra serum eller menneskelig blod som typisk har lavere rente enn de som renset fra mus blod. Den miRNA analysen vist i Figur 2 ble utført med 250 ng RNA fra blod musexosomes og 15-30 ng exosomal RNA fra humant blod eller menneskelige aorta endotelceller (HAOEC). Våre resultater indikerer tilstedeværelse av 89 miRNAs i exosomes samlet inn fra mus blod, 209 miRNAs i menneskelig blod exosomes, og 199 miRNAs i exosomes fra menneskelige cellekulturmedier. Representative data for seks miRNAs er vist som deltaet Ct verdi normalisert til den endogene U6 RNA for gnager blod (Figur 2A), menneskeblod (figur 2B) og HAOEC cellekultur media (figur 2C). Mens Mir-126 og Mir-200c var fraværende i exosomes fra gnager blod eller HAOEC media henholdsvis de resterende fire miRNAs er tilstede i alle tre prøvene i varierende mengder. Forhold til exosomes renset fra cellekulturmedier, er Mir-223 uttrykk på høyere nivåer i exosomes fra menneskelige og gnager blodprøver.
Figur 1. Transmission elektronmikroskopi (TEM), western blot analyse og QRT-PCR for mRNA ved hjelp exosomes renset fra ulike kilder. A) TEM bilde av mus blod Exosomes resuspendert i 1% glutaraldehyd (til venstre) eller RAW-celle avledet exosomes resuspendert i 4% paraformaldehyde, merket med 10 nm gull og kanin-anti CD81 (th) og flekket på formvar karbon-belagt nett for EM . analyse (skala bar = 100 nm) B) Western analyse av HSP70 i exosomes renset fra mus blod eller exosome-frie medier + / -. 24 timers inkubasjon med RAW 264,7 murine celler og resuspendert i Ripa buffer C) Bioanalyzer analyse av total RNA renset fra exosomes avledet fra RAW 264,7 cellekultur media D) Total RNA renset fra fullblod og exosomes hentet fra en representant menneskelig kontroll ble brukt til å sammenligne uttrykket nivåer av TNF-alfa og VEGFA. Klikk herå se større figur.
Figur 2. Relativ Expression of miRNA fraksjon som finnes i exosomes. Terskel syklus (Ct-verdien) er et relativt mål på konsentrasjonen av et individ miRNA i PCR reaksjonen og nedre CT verdi indikerer høyere ekspresjon. qPCR verdier for seks påvisbare exosomal miRNAs ble normalisert til U6 RNA og deltaet Ct-verdier ble fremstilt grafisk for exosomes fra tre kilder. En negativ verdi indikerer høyere uttrykk i denne figuren. Exosomes fra gnager blod (A) og menneskeblod (B) uttrykte HSA-Mir-223 på høyere nivåer enn kontroll, mens exosomes fra HAOEC cellekultur media (C) uttrykt HSA-Mir-223 på lavere nivåer enn kontroll. HSA-Mir-226 var fraværende fra gnagere blod exosomes og HSA-Mir-200c var fraværende fra HAOEC exosomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen, viser vi kvantifisering av miRNAs og mRNA fra exosomes renset av differensial sentrifugering fra blod og kultur media. Exosomes har forskjellige komponenter som er avhengige av deres opprinnelse og er involvert i en rekke biologiske funksjoner, blant annet immunforsvaret, antigen presentasjon, intracellulær kommunikasjon og overføring av RNA og proteiner 9,11,12,19,20. Selv om størrelsen og formen er en determinant for exosome renhet, en rekke papirer på EM-data i exosomes indikerer at disse vesikler kan variere i størrelse og morfologi basert på kilden hvorfra de blir utskilt i tillegg til den metode som brukes for fiksering og avbildning 9 , 15.. Den aksepterte størrelse for exosomes av 30-100 nm er et gjennomsnitt område som omfatter en liten bestand av exosomes med en større diameter avhengig av kilden 21,22, en grunn til at flere metoder brukes for å validere exosomal renhet. Skilles mirnas har mange nødvendige features av gode biomarkører 23 i tillegg til å være potensielle terapeutiske mål for ulike sykdommer 2,3,24. Dette rensing metoden gir en ikke-invasiv måte å karakterisere timelige biologiske endringer i exosomal innhold fra en rekke kroppsvæsker mens miRNA profilering av qPCR gir en omfattende oversikt over miRNA innhold to. Over 4500 proteiner, 1639 mRNA, 764 MiRNAs og 194 lipider er kjent for å assosiere med exosomes 25 ( www.exocarta.org ) og i noen tilfeller har endringer i nivåene av disse biomolekyler allerede vært knyttet til sykdomstilstander. I våre studier, hadde exosomes renset fra humant blod mange miRNAs til felles med exosomes renset fra media fra dyrkede humane cellelinjer, men signifikante forskjeller fra exosomal miRNAs funnet i mus blod. Mens det finnes eksempler på miRNAs som er rettet mot bare ett mRNA, mange miRNAs fungere å delvis redusere nivåene av flerfasemodelleringle mål fører til en sterk fysiologisk respons. Karakterisere både mRNA og miRNA som bor i exosomes gir unik innsikt i exosome-mediert informasjonsoverføring og rollen av sirkulerende miRNAs i formidling av endringer i genuttrykk. Rensing og karakterisering av exosomes fra en rekke kilder vil være gunstig i å identifisere molekylære signaturer knyttet til disse sekretoriske vesikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av midler fra Rita Allen Foundation stipend til Seena Ajit. Forfatterne ønsker å takke Erika Balogh og Dr. Soumitra Ghoshroy fra University of South Carolina elektronmikroskopi Center for instrumentbruk, vitenskapelig og teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) | BD Diagnostics | 366643 | For exosome purification from human blood |
| EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) | BD Diagnostics | 367841 | For exosome purification from mouse blood |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | For miRNA isolation from total blood |
| miRVana microRNA isolation kit | Ambion | AM1561 | |
| Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | For TLDA cards |
| Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp human pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman MicroRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| Tumor necrosis factor (primer probe) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Vascular endothelial growth factor A (primer probe) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | For mRNA |
| HSP70 antibody | Abcam | ab94368 | For western blot |
| Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | For electron microscopy |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
| Copper 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Table 1. Table of specific reagents. | |||
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell research. 18, 997-1006 (2008).
- Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PloS one. 3, e3148 (2008).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature. 2, 282 (2011).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
- Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
- Ramachandran, S., Palanisamy, V. Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication. Wiley Interdiscip Rev. RNA. , (2011).
- Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors. Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).
- Ludwig, A. K., Giebel, B. Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
- Masyuk, A. I., et al. Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).
- Fauré, J., et al. Exosomes are released by cultured cortical neurones. Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).
- Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PloS one. 7, e34653 (2012).
- Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).
- Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).
- El-Andaloussi, S., et al. Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nature. 7, 2112-2126 (2012).
- Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo. J. Immunol. 189, 777-785 (2012).
- Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. Extracellular microRNA: A new source of biomarkers. Mutat. Res. , (2011).
- Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics. Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).
- Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids. Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).
