Summary
Exosomes istikrarlı microRNA (miRNA'lar) varlığı biyolojik olarak ve terapötik müdahale için bir yol olarak potansiyel programı için, hücreler arası iletişim yeni bir mod olarak büyük ilgi üretti. Burada taşınmaları miRNAs tespit etmek kantitatif PCR tarafından takip edilir ve kan kültür ortamından saflaştırılması exosome göstermektedir.
Abstract
Kararlı miRNA'lar tüm vücut sıvılarında bulunan ve bazı dolaşan miRNA'lar exosomes adı verilen küçük kesecikler içinde haciz tarafından bozulması korunur. Exosomes hedef hücre RNA ve protein aktarımı ile sonuçlanan plazma zarı ile birleştirebilirler. Onların biyolojik fonksiyonları immün yanıt, antijen sunumu, ve hücre içi iletişim içerir. Kan yoluyla alıcı hücrelerde gen ifadesini düzenler miRNA'lar teslimi hedef müdahale için yeni yollar açtı. Ilaç veya RNA terapötik ajanların teslimat için bir strateji sunan ek olarak, exosomal içeriği tedavi seçenekleri ve prognoz belirlenmesinde, tanıda yardımcı olabilir biyolojik olarak hizmet verebilir.
Burada kantitatif kan ve hücre kültür ortamı içinde salgılanan exosomes gelen miRNA'lar ve haberci RNA'lar (mRNA) analiz için prosedür anlatacağız. Saf exosomes exos için western blot analizi ile karakterize olacakilgi mRNA için OMAL işaretleri ve PCR. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve immunogold etiketleme exosomal morfolojisi ve bütünlüğünü doğrulamak için kullanılacaktır. Toplam RNA biz aynı örnekten mRNA ve miRNA hem eğitim sağlamak için bu exosomes arınmış olacaktır. Bioanalyzer RNA bütünlüğünü doğrulayarak sonra, Taqman Alçak Yoğunluk Array (TLDA) kartları ve ilgi transkript için gen ekspresyon çalışmaları kullanarak exosomal miRNA tanımlamak için orta düzeyde kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) gerçekleştirir.
Bu protokoller, farmakolojik müdahale öncesi ve sonrasında, kemirgen modelleri ve hücre kültür ortamı içinde exosomal miRNAs değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. Exosomal içeriği nedeniyle kökenli kaynağı ve salgılayan exosomes bu hücrelerin fizyolojik koşullara değişir. Bu varyasyonlar hücreler ve sistemler stres veya fizyolojik değişimleri ile baş nasıl fikir sağlayabilir. Bizim temsilcisi veri v gösteriyormiRNA'lar içinde ariations fare kan, insan kanı ve insan hücre kültürü ortamı arındırılmış exosomes mevcut.
Burada kantitatif kan ve hücre kültür ortamı içinde salgılanan exosomes gelen miRNA'lar ve haberci RNA'lar (mRNA) analiz için prosedür anlatacağız. Saf exosomes ilgi mRNA için exosomal işaretleri ve PCR için western blot analizi ile karakterize edilecektir. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve immunogold etiketleme exosomal morfolojisi ve bütünlüğünü doğrulamak için kullanılacaktır. Toplam RNA biz aynı örnekten mRNA ve miRNA hem eğitim sağlamak için bu exosomes arınmış olacaktır. Bioanalyzer RNA bütünlüğünü doğrulayarak sonra, Taqman Alçak Yoğunluk Array (TLDA) kartları ve ilgi transkript için gen ekspresyon çalışmaları kullanarak exosomal miRNA tanımlamak için orta düzeyde kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) gerçekleştirir.
Bu protokoller exosomal miRNAs değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir ifarmakolojik müdahale öncesi ve sonrası n hasta, kemirgen modelleri ve hücre kültür ortamı. Exosomal içeriği nedeniyle kökenli kaynağı ve salgılayan exosomes bu hücrelerin fizyolojik koşullara değişir. Bu varyasyonlar hücreler ve sistemler stres veya fizyolojik değişimleri ile baş nasıl fikir sağlayabilir. Bizim temsilcisi veri miRNA'lar farklılıklar fare kan, insan kanı ve insan hücre kültürü ortamı arındırılmış exosomes mevcut göstermek
Introduction
Kısa noncoding miRNA'lar hedef mRNA bağlanarak gen modüle. ~ 7 baz çifti tamamlayıcılığı tohum sırası çevirinin engellenmesi ya da hedef proteinin 1 azalmış ekspresyonu neden olabilir, her ikisi de mRNA, kararlılığını azalma ile sonuçlanan hedef mRNA bağlamak için MiRNA sağlar. Son on yılda Araştırma tümden hücresel fonksiyonları aracılık miRNA'lar için temel bir rol kanıtlamıştır. Ayrıca çeşitli hastalıklar 2,3 altında yatan miRNA aracılı moleküler değişiklikler diseksiyon yönelik önemli çaba olmuştur. Ayrıca, vücut sıvıları 4-6 istikrarlı miRNA'lar son belirlenmesi klinik tanı için uygun yeni biyolojik olarak kendi kullanımı için yolu açtı.
Vücut sıvıları içinde miRNA ulaşım bir mod sistemik kan dolaşımdaki ile alıcı hücrelere exosomes, mRNA taşıyan küçük kesecikler, protein, lipid arabulucular ve miRNA'lar üzerinden gerçekleştiriliriyon 7-14. Alıcı hücrelerde gen ifadesinin modülasyonunda ve bu sonuçlar hücresel iletişim için yeni bir mekanizmayı temsil etmektedir. Örneğin, hücre büyüme faktörü-β5 (TGFβ5) dönüşüm, salgılayan ve / veya interlökin-1β (IL1β), tümör nekroz faktörü-α (TNF) gibi inflamasyon dahil biyomoleküllerin içeren emici exosomes tarafından immün-düzenleyici işlemleri modüle ve olabilir Bu genlerin 13 düzenleyen miRNA'lar. Anormal miRNA ifade insan hastalıklarının çeşitli ortak bir özelliktir gibi, bu moleküller yeni tedavi hedefleri 2 keşif ve doğrulama için heyecan verici yeni fırsatlar sunmaktadır.
Dolaşım miRNA'ların tüm vücut sıvılarında mevcut olan ve exosomes kompozisyonu, serbest bırakıldıktan hangi kaynak hücrelere göre farklı olduğu bilinmektedir. Böylece, hücrelerin fizyolojik durumunu incelemek için bir yol sunar ve nasıl hücrelerde bile sinyal değişiklik gösterecektirhastalıklar da dahil olmak üzere strese yanıt olarak ts. Exosome kompozisyon değişiklikler okuyan sinyal iletimi ilişkin bilgi sağlar ve biyolojik ya da terapötik müdahale yolları olarak potansiyellerini programını araştırabilirsiniz.
Burada yayınlanan protokollere dayalı birden fazla kaynaktan exosomes en arıtma gösterecektir. Bu exosomes exosomes mevcut miRNAs seviyelerini tespit etmek ve ölçmek için QPCR ardından RNA izolasyonu için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Insan ve kemirgenler kan örnekleri kullanan tüm deneyler ilgili tüm kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar uygun olarak idam edildi. İnsan konular Tıp Kurumsal Değerlendirme Kurulu Drexel University College ve hayvanlar kullanıldı çalışmaları için tüm prosedürleri Drexel en Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış ve Kullanım Kurulu edildi onayladığı bilgilendirilmiş onam verdikten sonra alındı.
1. Blood Exosome saflaştırma (~ 5.5 saat)
İPUÇLARI
- Biz Mirvana miRNA izolasyon kiti 300 ul RNA lizis tamponu kan bir tüp (~ 10 ml insan kanı ve ~ 2 ml fare kan) den exosomes tekrar süspansiyon.
- Hücre kültürü ortamından exosomes arındırmak için, ortam hücreleri çıkarmak için 10 dakika boyunca 500 xg'de bükülmüş ve 12,000 x g'de santrifüj işleminden sonra 0.22 um bir filtre ile filtre edilir. Hücre kültürü ortamından saflaştırılması exosomePBS, PBS yıkama veya ikinci ultrasantrifugasyon adımda bir seyreltme gerektirmez.
- Saflaştırılmış exosomes ultrasantrifugasyon aşamasından sonra bir sükroz gradyent santrifügasyonu adım ekleyerek, proteomik çalışmaları için kullanılacak ise protein agregatlarının ve kirletici 15 miktarını azaltacaktır.
- Exosomes gözlenen morfolojisi, kaynak ve TEM için işlem adımları iki bağlı olarak farklılık gösterebilir. Daha önce numune işleme 9,15 farklılıkları isnat edilmiştir exosomes için fincan şeklinde morfolojisi gözlenmedi. Immunogold etiketleme dahil olmak üzere TEM görüntüleri exosomes 9,16,17 edilen safra ve kortikal kültür kan, dahil olmak üzere farklı kaynaklardan önceki raporlar benzer.
- 10-60 dakika oda sıcaklığında dik 5x ve yer kan içeren EDTA kaplı tüp ters.
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüje 15 ml tüpler üst tabaka, plazma, toplayın ve buz üzerinde tutmak.
- PBS eşit bir hacmi ile akışkan seyreltin. 4 az 2,000 x g'de 30 dakika santrifüje ° C
- 4 ° C de, santrifüj tüpleri 24 ml toplam hacmi için 1X PBS ekleyin ve 12,000 x g hızında 45 dakika santrifüj transfer
- 4 ° C'de tüpler ultrasantrifüjdeki ve 110.000 xg 2 saat santrifüj transfer
- PBS içinde yeniden süspanse pelet ve 4 ° C'de 100,000 xg'de 1 saat santrifüj
- Uygun bir tampon içinde süspanse pelet (RNA lizis tamponu).
- Elektron mikroskopisi ve Western blot analizi için sırasıyla PBS veya RIPA tampon içerisinde yeniden süspanse edin.
2. Bir Modifiye Mirvana miRNA İzolasyon Kiti (~ 1 saat) kullanarak RNA Arıtma
İPUÇLARI
- , Kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyerek RNA izole RNaz Zap ile yüzeyleri ve pipetler silme ve steril filtre ipuçları ve borulu için zemin hazırlayın.
- Bir on-sütunu DNase işleme aşamasına eklenmesi mevcut olabilir DNA izlerini ortadan kaldırır. Exosomes kaynağına bağlı olarak, DNA fare ve insan mast hücresi çizgileri 8 aynı kromozomal DNA dizilerinin kültür kardiyomiyositlerde 18. ortamdan saflaştırılmıştır exosomes tespit edilmiştir dahil olmak üzere bazı kaynaklardan saflaştırılmış exosomes katılmamış olduğu bildirilmiştir.
- Satıcı sadece yeterli bir 700 ul eklenmesi için çözüm 1 yıkayın sağlar çünkü yıkama solüsyonu 1-350 ul (aşağıda Adım 2.4) hacmi azalır. Hacmi azalır değilse tüm kit içeriğini kullanarak için sol yeterli çözüm değildir. Kalan adımları üretici tavsiyelerine göre yapıldı.
- 1/10 vo ekleme10 dakika boyunca buz üzerinde MiRNA homojeni katkı maddesi (30 ul) ve inkübe lume.
- Asit-fenol hacmi ile ektraktlayınız: başlangıç lizat hacmi eşit kloroform yer alır. Santrifüj ve yeni bir tüp içinde üst faz kurtarmak.
- 1.25 hacimleri% 100 etanol (375 ul) ekleyin. Vortex. Kartuş filtre ve 10.000 x g az 15 saniye santrifüj için geçerlidir.
- Tavsiye hacmi miRNA Yıkama Çözeltisi 1 (350 ul) yarısı ekleyin ve 10.000 x g az 15 saniye santrifüj.
- Her bir numune için 10 ml DNase 1-70 ul tampon RDD (Qiagen) ekleyin. Sütun 80 ul ekle ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
- Çözüm 1 yıkayın (350 ul) ve 10,000 x g'de 15 saniye santrifüj ekleyin.
- Yıkama Çözeltisi ekleme 2/3 (500 ul) ve 10,000 x g'de 15 saniye santrifüj. TEKRAR.
- 40 ul 95 ile Zehir ° C nükleaz içermeyen H 2 O
- RNA konsantrasyonu belirlemek ve 100 ng / ul RNA seyreltin.
3. Bloo gelen Exosomes bir miRNA Profild Taqman Düşük Yoğunluklu Array (TLDA) Kartlar (~ 6.5 saat) kullanarak
İPUÇLARI
- , KKD giyerek RNA izole RNaz Zap ile yüzeyleri ve pipetler silme ve steril filtre ipuçları ve borulu için zemin hazırlayın.
- Ön amplifikasyon (pre-amp) adım 1-350 ng RNA (350-1,000 ng örnekleri cDNA sentezi sonra pre-amp adım gerektirmeyen) için önerilir. Bu eşit koşullar altında tüm örnekler tedavi gerekir çünkü pre-amp da örnek için gerekli olup olmadığını belirlemek için önemlidir. Pre-amp adım maliyet ekler ve Ct değerleri daha düşük kabul edilebilir bir kesim kapalı (32 yerine 40) var.
- Bu, tek bir gün içinde çalıştırılabilir kart sayısı ile ilgili olarak bir levhası yerine şerit tüpler içinde cDNA reaksiyon hazırlamak için yararlıdır. Bu, aynı gün işleme olmayacak edilen cDNA örnekleri arasında donma-çözülme en aza indirecektir.
- Farklı kaynaklardan toplanan Exosomes yönün varRNA miktarda kira. Bu protokol, cDNA sentezi için reaksiyon için 3 ul RNA şablonu azami izin verir. Kaynağına bağlı olarak, izole edilebilir exosomal RNA miktarı belki de sınırlıdır. Tipik bir doku cDNA, 3 ul hacim içinde 100 ng RNA, insan kanı ya da hücre kültür ortamından exosomes yapılmış olacağı kadar RNA verim olur ise genellikle daha az RNA içeren ve cDNA daha az başlangıç malzemesinden yapılmış olmalıdır. Fare kan exosomes RNA yüksek seviyelerde içeren ve 3 ul içinde, en az 100 ng elde edilebilir.
- Megaplex Havuzları kullanarak RNA saflaştırılmış cDNA hazırlamak için transkriptaz primer (A Grubu ve B Grubu mikroakışkan kartlarında miRNA'lar için astar içeren Dizi A ve B) tersine, buz üzerinde reaksiyon bileşenleri çözülme.
- Etiket RT A Grubu astar veya B Grubu astar ile reaksiyona ve grafik için bileşenleri eklemek için iki RNaz ücretsiz 1.5 ml tüpler. 2 veya daha fazla reaksiyon için bileşenlerin en az bir ekstra hacim ekleme veya t tarafından önerilen bir ana karışımı yapmako satıcı.
| RT reaksiyon Bileşen | Bileşen Konsantrasyon | 1 adet numune için hacmi (toplam V / örnek = 4.5 ul) |
| Nükleaz içermeyen su | 0.20 ul | |
| Megaplex RT tamponu (10x) | 1X | 0.80 ul |
| dNTP (100 mM) | 4.4 mM | 0.20 ul |
| MgCl2 (25 mm) | 5 mM | 0.90 ul |
| RNaz İnhibitör (20U/μl) | 2 U | 0.10 ul |
| Megaplex RT Astarlar A veya B (10X) | 1X | 0.80 ul |
| Ters Transkriptaz MultiScribe | 75 U | 1.50 ul |
- Tüpler invert 6 kez ve yüzdekısaca rifuge. Daha sonra, pipet 4,5 MicroAmp içine ul RT reaksiyon karışımı 8-tüp Şeritler veya 96-MicroAmp optik reaksiyon plakası.
- RNA 100 ng ekleyin ve DEPC arıtılmış su ile 3 ul ses seviyesini ayarlamak ya da 3 ul toplam RNA ekleyin, pipet ucu ile karıştırın ve tüpler veya plaka mühür. Kısaca Spin ve 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
- PCR makineye reaksiyon yükleyin ve (gibi Applied Biosystems Megaplex Havuzları protokolü tarafından önerilir) aşağıdaki koşullar altında çalıştırın:
| Sahne | Sıcaklık | Zaman |
| Çevrim (40x) | 16 ° C | 2 dakika |
| 42 ° C | 1 dakika | |
| 50 ° C | 1 sn | |
| Tutmak | 85 ° C | 5 dakika |
| Tutmak | 4 ° C | ∞ |
- -20 ° C'de (en az bir hafta için iyi) cDNA depolamak ya da bir hafta boyunca muhafaza edilebilir ön-ampi adıma devam eder.
- Buz üzerinde A Grubu ve B Grubu için Preamp astar çözülme ve karıştırmak için ters. Girdap Taqman Pre-Amp ana karıştırın ve buz üzerinde tutmak.
- 2 veya daha fazla reaksiyon için bileşenlerin en az bir ekstra hacim ekleme şeması takip veya satıcı tarafından önerilen ana karışımı yapmak.
| Pre-Amp Reaksiyon Bileşen | 1 örnek için ses |
| Nükleaz içermeyen su | 7.5 ul |
| Taqman Preamp Master Mix (2X) | 12.5 ul |
| Megaplex Preamp Astarlar A veya B (10X) | 2.5 ul |
- Pipet 2.5 ul RT süredenct MicroAmp içine 8-tüp Şeritler veya 96-MicroAmp optik reaksiyon plaka ve her kuyuya 22.5 ul Preamp reaksiyon karışımı dağıtmak.
- Buz 5 dk inkübe plaka, mühür ve daha sonra PCR makineye örnek yükleyin. Aşağıdaki koşullar altında çalıştırın.
| Sahne | Sıcaklık | Zaman |
| Tutmak | 95 ° C | 10 dakika |
| Tutmak | 55 ° C | 2 dakika |
| Tutmak | 72 ° C | 2 dakika |
| Çevrim (12x) | 95 ° C | 15 sn |
| 60 ° C | 4 dk | |
| Tutmak | 99.9 ° C | 10 dakika |
| Tutmak | 4 ° C | ∞ |
- Preamp reaksiyon tamamlandıktan sonra, kısa bir süre tüpler veya plaka santrifüj ve sonra her iyi ya da tüp 75 ul 0.1x TE pH 8.0 ekleyin.
- Seal ve karıştırın ve kısaca döndürün. -20 ° C'de bir hafta seyreltilmiş ürün saklayın veya plaka yüklemek için devam.
- Buz üzerinde bir RNaz içermeyen 1.5 ml'lik bir tüp içinde, aşağıdaki birleştirin.
| Bileşen | 1 kart için ses |
| Taqman Evrensel PCR Master Mix, yok AmpErase UNG (2X) | 450 ul |
| Seyreltilmiş preamp ürün | 9 ul |
| Nükleaz içermeyen su | 441 ul |
- Karıştırın ve kısaca santrifüj için tüp ters. Taqman MicroRNA Dizi kart her portuna 100 ul PCR karışımı koyun.
- 1 dakika boyunca kartı 2 x 1.000 x g'da santrifüj. Kart mühür ve Uygulamalı Biyosistem manuel ve 384 Taqman Düşük Yoğunluklu Array ayarlarında astar birlikte verilen şablonu kullanarak çalıştırın. Biz Uygulamalı Biyosistem 7900HT Hızlı Real-Time PCR sistemi kullanın.
4. Taqman (~ 1.5 saat) ile analiz mRNA
- QPCR reaksiyon hazırlamak için, grafik sırayla reaksiyon bileşenleri karıştırın. Tüm numuneler normalleştirici gen olarak faiz hem de 18S rRNA geni için astar probları ile analiz edilecektir.
| Taqman Reaksiyon Bileşen | 1 örnek için ses |
| Nükleaz içermeyen su | 7 ul (bireysel örnek göre ayarlayın) |
| Taqman Hızlı Master Mix (2X) | 10 ul |
| Taqman Primer sondalar (20x) | 1 ul |
| 100 ng RNA, cDNA | 2 ve mu, L (tek tek örnek göre ayarlayın) |
- Üreticisi (Biyosistem 7900HT Hızlı Real-Time PCR Sistemi Uygulamalı) tarafından tavsiye edilen hızlı 96-blok kullanarak 96 plaka çalıştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kan ya da hücre kültür ortamından izole exosomes sonra exosomes saflığı elektron mikroskopisi (EM) ve Western Blot (Şekil 1A ve 1B) ile test edilebilir. Biz EM ve birden fazla antikor kullanarak western blot ile çeşitli kaynaklardan bizim exosome hazırlıkları doğruladı. Şekil 1A exosomes ~ çapında 30 -100 nm ile sağlam ve immunogold etiketleme ile CD81 içeren teyit EM görüntüleri gösterir. Yaygın olarak kullanılan exosomal işaretleri Hsp70 ve tetraspannin aile glikoproteinler CD63, CD81 ve CD9 14 bulunmaktadır. Saflaştırılmış exosomes bütünlüğünü doğrulayan sonra, Şekil 1B Hsp70 için Western Blot gerçekleştirilen ve tek başına ortam (negatif kontrol) yok iken exosomes Hsp70 içerdiğini gösterdi. Bioanalyzer izleme RAW hücre kültür ortamından izole exosomes RNA'lar çeşitli içerdiğini gösterir, ancak bütün RNA tipiktir ve ribozomal RNAların büyük miktarda içermezHücre (Şekil 1C). Şekil 1D kandan alınan tam kan ve exosomes mRNA QPCR analizini gösterir. Biz Mirvana MiRNA izolasyon kiti kullanılarak ~ 10 ml insan kanından exosomal RNA, 500 ng izole etmek mümkündür. QPCR sonuçlar TNFa ve vasküler endotelyal büyüme faktörü kodlayan mRNA varlığını göstermektedir A (VEGFA) yanı sıra tam kan gibi exosomes saflaştırılmış.
Gen ekspresyon çalışmaları için QPCR ek olarak, toplam RNA aynı zamanda, MiRNA profili kullanılmıştır. MiRNA TLDA kartı sürüm 3.0 endojen kontrol RNA U6 dahil olmak üzere ~ 758 miRNA'lar için astar probları içerir. Öncesi amplifikasyon adım ilavesi ile, satıcı bir TLDA kartı çalıştırmak için 30 ng RNA önerir. Bu, genellikle fare kanından saflaştırılmıştır daha düşük verimleri sahip serum veya insan kanından saflaştırılmıştır exosomes RNA analizi için yararlıdır. Şekil 2'de gösterildiği gibi MiRNA analizi fare kanından 250 ng RNA ile gerçekleştirilmiştirexosomes ve insan kanı veya insan aort endotel hücreleri (HAOEC) 15-30 ng exosomal RNA. Sonuçlarımız fare kan, insan kanı exosomes 209 miRNA'lar ve insan hücre kültürü medya exosomes 199 miRNA'lar toplanan exosomes 89. miRNA'lar varlığına işaret. Altı miRNA'ların için temsilci veriler delta Ct kemirgen kan için endojen U6 RNA normalize değeri (Şekil 2A), insan kanı (Şekil 2B) ve HAOEC hücre kültür ortamı (Şekil 2C) olarak gösterilir. MiR-126 ve miR-200c sırasıyla kemirgen kan veya HAOEC medyadan exosomes içinde yok iken, geri kalan dört miRNA'lar değişen miktarlarda her üç örnek mevcuttur. Hücre kültürü ortamından saflaştırılır exosomes göre, miR-223, insan ve kemirgen kan örneklerinden exosomes daha yüksek seviyelerde ifade edilir.
Şekil 1. Transmission elektron mikroskobu (TEM), çeşitli kaynaklardan saflaştırılmış exosomes kullanarak mRNA için western blot analizi ve Mah-PCR. Fare kan A) TEM görüntüsü EM için 10 nm altın ve tavşan anti-CD81 (sağda) ile etiketli,% 1 gluteraldehit (sol) veya% 4 paraformaldehid yeniden süspanse RAW hücre elde exosomes yeniden süspanse ve formvar karbon kaplı ızgaraları damlatılır exosomes .. fare kan veya exosome-ücretsiz medya arındırılmış + / exosomes içinde HSP70 analizi (ölçek bar = 100 nm) B) Batı analizi - toplam RNA RAW 264.7 fare hücreleri ile 24 saat inkübasyon ve RIPA tampon C yeniden süspanse) Bioanalyzer analizi temsili bir insan kontrolü elde edilen tam kan ve exosomes arındırılan Toplam RNA, TNFa ve VEGFA arasında salgılama seviyeleri, karşılaştırma için kullanıldı RAW 264.7 hücre kültür ortamı D'sinden türetilir exosomes) arındırılır. Burayıbüyük rakam görmek için.
Şekil 2. Exosomes bulunan MiRNA fraksiyonu bağıl ifade. Eşik döngüsü (CT değeri) PCR reaksiyonu ve daha düşük bir CT değeri bağımsız bir MiRNA konsantrasyonu göreli bir ölçüsüdür artmış ekspresyonu gösterir. Altı tespit exosomal miRNA'lar için qPCR değerleri U6 RNA ve delta Ct değerleri üç kaynaktan exosomes için grafikle edildi normalize edildi. Negatif bir değer bu rakamın daha yüksek ifade gösterir. HAOEC hücre kültür ortamı (C) den exosomes kontrolü daha düşük seviyelerde hsa-miR-223 ifade ederken kemirgen kan (A) ve insan kanından Exosomes (B), kontrol daha yüksek seviyelerde hsa-miR-223 dile getirdi. Hsa-miR-226 kemirgen kan exosomes eksik ve hsa-miR-200c HAOEC exosomes gelen yoktu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, kan ve kültür ortamından diferansiyel santrifüj saflaştırılmış exosomes gelen miRNA'lar ve mRNA miktarının gösterir. Exosomes kökenlerine bağlı çeşitli bileşenleri ve immün yanıt, antijen sunumu, hücre içi iletişim ve RNA ve protein 9,11,12,19,20 devri de dahil olmak üzere biyolojik fonksiyonları, bir dizi olarak katılıyor. Büyüklüğü ve şekli exosome saflık belirleyici iken EM exosomes veri gösteren bir dizi çalışma, bu veziküller da tespit için kullanılan yöntemi hem de salgılanan kaynak ve görüntüleme 9 dayalı büyüklüğü ve morfoloji gibi değişebilir belirtmek , 15. 30-100 nm exosomes için kabul boyutu kaynağı 21,22, birden çok yöntem exosomal saflık doğrulamak için kullanılan bir nedeni bağlı olarak daha büyük bir çapa sahip exosomes küçük bir nüfusu içeren bir ortalama aralığıdır. Salgılanan miRNA'lar çok gerekli İKLER varçeşitli hastalıklar 2,3,24 için potansiyel terapötik hedefler olmanın yanı sıra 23 iyi biyolojik es. Bu arıtma yöntemi qPCR miRNA profilleme miRNA içerik 2 kapsamlı bir bakış sağlar ise vücut sıvılarının çeşitli exosomal içeriğinde geçici biyolojik değişiklikler karakterize etmek için bir non-invaziv bir yol sağlar. 4,500 'ün üzerinde proteinler, 1.639 mRNA, 764 ve 194 miRNAs lipid exosomes 25 (ilişkilendirmek için bilinen www.exocarta.org ) ve bazı durumlarda, bu biyomoleküllerin seviyelerinde değişiklikler, önceden hastalık durumları ile bağlantılı olmuştur. Çalışmalarda, insan kanından saflaştırılmıştır exosomes kültürlenmiş insan hücre hatları ancak fare kanında bulunan exosomal miRNAs anlamlı farklılık ikinci ortamdan saflaştırılmıştır exosomes ile birçok ortak miRNAs vardı. Sadece bir mRNA hedef miRNA'lar örnekleri olsa da, birçok miRNA'lar kısmen multip seviyelerini azaltmak için çalışırle güçlü bir fizyolojik tepki neden hedefliyor. Exosomes ikamet mRNA ve miRNA hem karakterize eden exosome-aracılı bilgi aktarımı ve gen ekspresyon değişiklikleri arabuluculuk miRNA'lar dolaşan rolüne benzersiz bir bakış açısı sağlar. Çeşitli kaynaklardan gelen exosomes saflaştırılması ve karakterizasyonu, bu veziküller salgı ile ilişkili moleküler imza tanımlanması yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Rita Allen Vakfı hibe Seena Ajit fon tarafından desteklenmiştir. Yazarlar alet kullanımı, bilimsel ve teknik yardım için Güney Carolina Elektron Mikroskopi Merkezi Üniversitesi'nden Erika Balogh ve Dr Soumitra Ghoshroy kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) | BD Diagnostics | 366643 | For exosome purification from human blood |
| EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) | BD Diagnostics | 367841 | For exosome purification from mouse blood |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | For miRNA isolation from total blood |
| miRVana microRNA isolation kit | Ambion | AM1561 | |
| Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | For TLDA cards |
| Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp human pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman MicroRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| Tumor necrosis factor (primer probe) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Vascular endothelial growth factor A (primer probe) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | For mRNA |
| HSP70 antibody | Abcam | ab94368 | For western blot |
| Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | For electron microscopy |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
| Copper 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Table 1. Table of specific reagents. | |||
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell research. 18, 997-1006 (2008).
- Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PloS one. 3, e3148 (2008).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature. 2, 282 (2011).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
- Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
- Ramachandran, S., Palanisamy, V. Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication. Wiley Interdiscip Rev. RNA. , (2011).
- Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors. Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).
- Ludwig, A. K., Giebel, B. Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
- Masyuk, A. I., et al. Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).
- Fauré, J., et al. Exosomes are released by cultured cortical neurones. Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).
- Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PloS one. 7, e34653 (2012).
- Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).
- Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).
- El-Andaloussi, S., et al. Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nature. 7, 2112-2126 (2012).
- Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo. J. Immunol. 189, 777-785 (2012).
- Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. Extracellular microRNA: A new source of biomarkers. Mutat. Res. , (2011).
- Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics. Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).
- Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids. Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).
