Summary
Tilstedeværelsen af stabile microRNA (miRNA) i exosomes har skabt enorm interesse som en ny form for intercellulær kommunikation, for deres potentielle anvendelighed som biomarkører og som en vej til terapeutisk intervention. Her viser vi exosome oprensning fra blod og kultur medier efterfulgt af kvantitativ PCR til at identificere miRNA, der transporteres.
Abstract
Stabile miRNA er til stede i alle kroppens væsker og nogle cirkulerende miRNA er beskyttet mod nedbrydning ved binding i små vesikler kaldet exosomes. Exosomer kan fusionere med plasmamembranen, der medfører overførsel af RNA og proteiner til målcellen. Deres biologiske funktioner omfatter immunrespons, antigenpræsentation og intracellulær kommunikation. Levering af miRNA, der kan regulere genekspression i modtagerlandene celler via blodet har åbnet nye muligheder for target intervention. Ud over at tilbyde en strategi for levering af medicin eller RNA terapeutiske midler, kan exosomal indhold tjene som biomarkører, der kan støtte i diagnosticering, bestemme behandlingsmuligheder og prognose.
Her vil vi beskrive proceduren for kvantitativ analyse af miRNA og messenger RNA (mRNA) fra exosomes udskilles i blod og celledyrkningsmedier. Oprensede exosomer vil være præget med western blot analyse for ExosOmal markører og PCR for mRNA af interesse. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) og immunogold mærkning vil blive anvendt til at validere exosomal morfologi og integritet. Totalt RNA vil blive oprenset fra disse exosomes at sikre, at vi kan studere både mRNA og miRNA fra den samme prøve. Efter validering RNA integritet ved Bioanalyzer, vil vi udføre en medium gennemløb kvantitativ real-time PCR (qPCR) for at identificere den exosomal miRNA hjælp Taqman Low Density Array (TLDA) kort og genekspressionsstudier for udskrifter af interesse.
Disse protokoller kan anvendes til at kvantificere ændringer i exosomal miRNA i patienter, gnavermodeller og celledyrkningsmedier før og efter farmakologisk intervention. Exosomal indhold varierer på grund af kilden til oprindelse og de fysiologiske forhold af celler, der udskiller exosomes. Disse variationer kan give indsigt i, hvordan celler og systemer håndtere stress eller fysiologiske forstyrrelser. Vores repræsentative data viser variations i miRNA stede i exosomer oprenset fra muse blod, humant blod og cellekulturmedier.
Her vil vi beskrive proceduren for kvantitativ analyse af miRNA og messenger RNA (mRNA) fra exosomes udskilles i blod og celledyrkningsmedier. Oprensede exosomer vil være præget med western blot analyse for exosomal markører og PCR for mRNA'er af interesse. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) og immunogold mærkning vil blive anvendt til at validere exosomal morfologi og integritet. Totalt RNA vil blive oprenset fra disse exosomes at sikre, at vi kan studere både mRNA og miRNA fra den samme prøve. Efter validering RNA integritet ved Bioanalyzer, vil vi udføre en medium gennemløb kvantitativ real-time PCR (qPCR) for at identificere den exosomal miRNA hjælp Taqman Low Density Array (TLDA) kort og genekspressionsstudier for udskrifter af interesse.
Disse protokoller kan anvendes til at kvantificere ændringer i exosomal miRNA in patienter gnaver modeller og celledyrkningsmedier før og efter farmakologisk intervention. Exosomal indhold varierer på grund af kilden til oprindelse og de fysiologiske forhold af celler, der udskiller exosomes. Disse variationer kan give indsigt i, hvordan celler og systemer håndtere stress eller fysiologiske forstyrrelser. Vores repræsentative data viser variationer i miRNA stede i exosomer oprenset fra muse blod, humant blod og cellekulturmedier
Introduction
Korte kodende miRNA modulere genekspression ved binding til mål-mRNA'et. Frø sekvens komplementaritet ~ 7 basepar giver miRNA at binde til mål-mRNA resulterer i inhibering af translation eller i reduktion i stabiliteten af mRNA, som begge kan resultere i nedsat ekspression af målproteinet 1.. Forskning i det sidste årti har utvetydigt bevist en fundamental rolle for miRNA i mediering cellulære funktioner. Der har desuden været en betydelig indsats rettet mod dissekere miRNA medierede molekylære ændringer underliggende forskellige sygdomme 2,3. Desuden nylige identifikation af stabile miRNA i kropsvæsker 4-6 banede vejen for deres anvendelse som nye biomarkører kan underkastes klinisk diagnose.
Én form for miRNA transport i kropsvæsker er via exosomes, små blærer, der bærer mRNA, proteiner, lipidmediatorer og miRNA til modtager celler via systemisk blod circulation 7-14. Dette resulterer i modulering af genekspression i recipientceller og repræsenterer en ny mekanisme for cellulær kommunikation. For eksempel kan celler modulere immun-regulerende processer ved at udskille og / eller absorberende exosomer indeholdende biomolekyler involveret i inflammation, såsom interleukin-1β (IL1β), tumornekrosefaktor-α (TNF), transformerende vækstfaktor-β5 (TGFβ5), og de miRNA, der regulerer disse gener 13.. Som afvigende miRNA udtryk er et fælles træk i en række humane sygdomme, disse molekyler tilbyde nye spændende muligheder for opdagelse og validering af nye terapeutiske mål 2.
Cirkulerende miRNA er til stede i alle kropsvæsker, og det er kendt, at sammensætningen af exosomer er forskellige baseret på kildecellerne hvorfra de blev frigivet. Således tilbyder de en vej til at studere den fysiologiske status af cellerne, og hvordan cellerne alter signalering selvts som reaktion på stress, herunder sygdomme. Studere ændringer i exosome sammensætning kan give indsigt i signaltransduktion og undersøge deres potentielle anvendelighed som biomarkører eller terapeutisk intervention ruter.
Her vil vi vise, rensning af exosomer fra flere kilder er baseret på offentliggjorte protokoller. Disse exosomer vil blive anvendt til RNA-isolering efterfulgt af qPCR at identificere og måle niveauet af miRNA i exosomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ved hjælp af blodprøver fra mennesker og gnavere blev henrettet i overensstemmelse med alle relevante retningslinjer, regler og reguleringsorganer. Forsøgspersoner blev rekrutteret efter at give informeret samtykke, som er godkendt af Drexel University College of Medicine Institutional Review Board, og alle procedurer for undersøgelser udført ved hjælp af dyr blev godkendt af Drexel Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1.. Exosome Oprensning fra Blood (~ 5,5 timer)
TIPS
- Vi resuspender exosomer fra det ene rør af blod (ca. 10 ml humant blod og ~ 2 ml mus blod) i 300 pi RNA lysepuffer fra Mirvana miRNA isolation kit.
- At oprense exosomer fra cellekulturmedier, er medierne centrifugeret ved 500 x g i 10 minutter til fjernelse af celler og også filtreret gennem et 0,22 um filter efter centrifugering ved 12.000 x g.. Exosomet oprensning fra cellekulturmedierikke kræver en fortynding i PBS, PBS vask eller anden ultracentrifugering trin.
- Hvis de oprensede exosomer vil blive anvendt til proteomics undersøgelser, tilføjer en saccharosegradientcentrifugering trin efter ultracentrifugering skridt vil reducere mængden af protein aggregater og forurenende stoffer 15..
- Den observerede morfologi exosomer kan variere afhængigt af både kilden og de procestrin for TEM. Vi har ikke observere skålformede morfologi for exosomes som tidligere er blevet tilskrevet forskelle i prøven behandling 9,15. Vores TEM billeder herunder immunogold mærkning ligner tidligere rapporter fra forskellige kilder, herunder blod, galde og kortikal kultur afledt exosomes 9,16,17.
- Invert EDTA coatede rør indeholdende blod 5x og sted opretstående ved stuetemperatur i 10-60 minutter.
- Centrifuger ved 2.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Saml det øverste lag, plasma, i 15 ml rør og holde på is.
- Fortynd væske med et tilsvarende volumen PBS. Centrifugeres 30 minutter ved 2.000 xg ved 4 ° C.
- Overførsel til centrifugerør tilføje 1X PBS i en samlet volumen på 24 ml, og centrifugeres 45 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C.
- Overførsel til ultracentrifugerør og centrifuger 2 timer ved 110.000 xg ved 4 ° C.
- Resuspender pellet i PBS og centrifuger 1 time ved 100.000 xg ved 4 ° C.
- Resuspender pellet i passende buffer (RNA lysisbuffer).
- Resuspender i PBS eller RIPA-buffer til elektronmikroskopi og western blot-analyse hhv.
2.. RNA Oprensning ved hjælp af en modificeret Mirvana miRNA Isolation Kit (~ 1 time)
TIPS
- Forbered området for at isolere RNA ved at bære personlige værnemidler (PPE), tørrer overflader og pipetter med RNase Zap og med sterile filter tips og rør.
- Tilføjelse af en on column DNase behandling trin fjerner spor af DNA, der kan være til stede. Afhængigt af kilden til exosomer, er DNA blevet rapporteret at være fraværende i exosomer oprenset fra nogle kilder, herunder mus og humane mast cellelinier 8 men kromosomale DNA-sekvenser er blevet påvist i exosomer oprenset fra medierne af dyrkede cardiomyocytter 18.
- Vi har reduceret mængden af vaskeopløsning 1-350 pi (Trin 2.4 nedenfor), fordi sælgeren giver kun nok Wash løsning 1 for én 700 pi tilføjelse. Hvis volumen ikke reduceres der ikke er tilstrækkelig løsning tilbage for at bruge hele kit indhold. Resterende trin blev udført ifølge producentens anbefalinger.
- Tilføj 1/10 voLume af miRNA homogenatet Additive (30 ul), og der inkuberes på is i 10 min.
- Uddrag med et volumen af syre-phenol: chloroform lig med det oprindelige lysat volumen. Centrifuger og inddrive den øverste fase i en frisk rør.
- Tilføj 1,25 volumener 100% ethanol (375 ul). Vortex. Anvend til at filtrere patron og centrifuger 15 sekunder ved 10.000 x g..
- Tilsæt halvdelen af anbefalede volumen miRNA Wash Solution 1 (350 ul) og centrifuger 15 sekunder ved 10.000 x g..
- Tilsæt 10 ul DNase 1-70 pi buffer RDD (Qiagen) for hver prøve. Der tilsættes 80 pi til kolonne og inkuberes 15 minutter ved stuetemperatur.
- Tilføj Vaskeopløsning 1 (350 ul) og centrifugeres 15 sekunder ved 10.000 x g.
- Tilføj Vaskeopløsning 2/3 (500 ul) og centrifugeres 15 sekunder ved 10.000 x g. GENTAG.
- Der elueres med 40 ul 95 ° C nuklease-fri H 2 O.
- Bestemme koncentrationen af RNA og fortynde RNA til 100 ng / ul.
3.. miRNA profilering af Exosomer fra Blood Brug Taqman Low Density Array (TLDA) Cards (~ 6,5 timer)
TIPS
- Forbered området for at isolere RNA ved at bære PPE, aftørring overflader og pipetter med RNase Zap og med sterile filter tips og rør.
- Pre-forstærkning (forforstærker) trin anbefales til 1-350 ng RNA (350-1.000 ng prøver ikke kræver pre-amp skridt efter cDNA syntese). Det er vigtigt at afgøre, om forforstærker er nødvendig for din prøve, fordi du skal behandle alle prøver på lige vilkår. Forforstærker trin tilføjer omkostninger og Ct-værdier har en lavere acceptabel afbrød (32 i stedet for 40).
- Det er nyttigt at forberede cDNA reaktion i striben rør i stedet for en plade afhængig af antallet af kort, der kan køre på en enkelt dag. Dette vil minimere fryse-tø af cDNA prøver, vil ikke blive behandlet på den samme dag.
- Exosomer indsamlet fra forskellige kilder har forskelleje mængder RNA. Denne protokol tillader maksimalt 3 pi RNA skabelon for cDNA syntese reaktionen. Afhængigt af kilden, mængden af exosomal RNA, kan isoleres måske begrænset. Mens en typisk væv ville give nok RNA, cDNA ville ske fra 100 ng RNA i 3 gl volumen, exosomes fra humant blod eller cellekulturmedier ofte indeholder mindre RNA og cDNA skal være fremstillet af mindre udgangsmateriale. Museblod exosomer indeholder højere niveauer af RNA og mindst 100 ng i 3 pi kan opnås.
- At fremstille cDNA ud fra oprensede RNA ved anvendelse megaplex Pools omvendt transkriptase primere (Pulje A og Pulje B indeholder primere for miRNA på mikrofluide kort array A og B), tø reaktionskomponenterne på is.
- Label to RNase-fri 1,5 ml rør til RT reaktion med Pool A primere eller Pulje B primere og føje komponenter i figur orden. Tilføje mindst én ekstra mængde af komponenter til 2 eller flere reaktioner eller lave en master mix som anbefalet af than sælger.
| RT-reaktionen Komponent | Component Koncentration | Volumen til 1 prøve (samlet V / prøve = 4,5 ul) |
| Nuklease-frit vand | 0,20 pi | |
| Megaplex RT puffer (10X) | 1X | 0,80 pi |
| dNTP'er (100 mM) | 4,4 mM | 0,20 pi |
| MgCl2 (25 mM) | 5 mM | 0,90 pi |
| RNase Inhibitor (20U/μl) | 2 U | 0.10 pi |
| Megaplex RT primerne A eller B (10X) | 1X | 0,80 pi |
| MultiScribe Revers transkriptase | 75 U | 1.50 pi |
- Invert rør 6 gange og centrifuge kortvarigt. Derefter pipette 4,5 pi RT reaktion blandes ind MicroAmp 8-rør strimler eller en 96-brønds MicroAmp optisk reaktion plade.
- Tilføj 100 ng af RNA og justere lydstyrken til 3 pi med DEPC behandlet vand eller tilføje 3 pi total RNA, omrøres med pipettespidsen og forsegle rør eller plade. Spin kortvarigt og inkuberes på is i 5 min.
- Indlæs reaktionen i PCR maskinen og køre det under følgende forhold (som anbefalet af Applied Biosystems Megaplex Pools protokol):
| Stage | Temp | Time |
| Cycle (40x) | 16 ° C | 2 min |
| 42 ° C | 1 min | |
| 50 ° C | 1 sek | |
| Hold | 85 ° C | 5 min |
| Hold | 4 ° C | ∞ |
- Opbevar cDNA ved -20 ° C (god for mindst en uge) eller fortsætte med at præ-Amp skridt, som kan opbevares i en uge.
- Tø Preamp primere til Pool A og Pool B på is og vend for at blande. Swirl Taqman Pre-Amp Master Mix og holde på is også.
- Følg diagrammet tilsætning af mindst én ekstra mængde af komponenter til 2 eller flere reaktioner eller lave en master mix som anbefalet af leverandøren.
| Pre-Amp reaktion Komponent | Volumen for 1 prøve |
| Nuklease-frit vand | 7,5 gl |
| Taqman PreAmp Master Mix (2x) | 12,5 pi |
| Megaplex preamp Primere A eller B (10X) | 2,5 pi |
- Pipette 2,5 pi RT product i MicroAmp 8-rørs strips eller en 96-brønds MicroAmp optisk reaktion plade og dispensere 22,5 pi PreAmp reaktion mix i hver brønd.
- Forsegle skiltet, inkuberes på is 5 min og derefter indlæse prøven i PCR maskinen. Kør under følgende betingelser.
| Stage | Temp | Time |
| Hold | 95 ° C | 10 min |
| Hold | 55 ° C | 2 min |
| Hold | 72 ° C | 2 min |
| Cycle (12x) | 95 ° C | 15 sek |
| 60 ° C | 4 min | |
| Hold | 99,9 ° C | 10 min |
| Hold | 4 ° C | ∞ |
- Efter preamp reaktion er færdig, kortvarigt centrifugeres rørene eller plade og derefter tilføje 75 pi 0,1 x TE pH 8,0 til hver brønd eller rør.
- Seal og bland og spin kortvarigt. Opbevar den fortyndede produkt i en uge ved -20 ° C eller fortsætte med at indlæse pladen.
- Kombiner følgende i et RNase-fri 1,5 ml rør på is.
| Component | Volumen for 1 card |
| Taqman Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG (2x) | 450 pi |
| Fortyndet forforstærkerindstillinger produkt | 9 pi |
| Nuklease-frit vand | 441 pi |
- Vend røret at blande og centrifugeres kortvarigt. Der overføres 100 pi PCR i enkelte havne i den Taqman MicroRNA Array-kort.
- Centrifugeres kort 2 x 1.000 xg i 1 min. Seal kortet og køre det ved hjælp af skabelon med primere i Applied Biosystems vejledning og 384 brønde TaqMan Low Density Array-indstillinger. Vi bruger Applied Biosystems 7900HT Hurtig Real-Time PCR systemet.
4.. mRNA Analyse ved Taqman (~ 1,5 time)
- For at forberede qPCR reaktion, blande reaktionskomponenterne i den rækkefølge i diagrammet. Alle prøverne analyseres med primer prober for genet af interesse samt 18S rRNA som normalizer genet.
| TaqMan Reaktion Komponent | Volumen for 1 prøve |
| Nuklease-frit vand | 7 pi (justere baseret på individuel prøve) |
| Taqman Fast Master Mix (2x) | 10 ul |
| TaqMan Primer sonder (20x) | 1 pi |
| cDNA fra 100 ng RNA | 2 & mu, L (justere baseret på individuel prøve) |
- Kør plade med 96 brønde med Fast 96-brønds blok som anbefalet af producenten (Applied Biosystems 7900HT Hurtig Real-Time PCR System).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter isolere exosomer fra blod eller celledyrkningsmedier, kan renheden af exosomer afprøves ved elektronmikroskopi (EM) og Western blot (figur 1A og 1B). Vi bekræftede vores exosom præparater fra forskellige kilder med EM og western blot ved hjælp af flere antistoffer. 1A viser EM billeder bekræfter, at exosomer er intakte med en diameter på ~ 30 -100 nm og indeholder CD81 ved immunguld mærkning. Almindeligt anvendte exosomal markører er Hsp70 og tetraspannin familie glycoproteiner CD63, CD81 og CD9 14.. Efter bekræftelse af integriteten af de oprensede exosomer, udførte vi western blot for Hsp70 i figur 1B og påviste, at exosomer indeholder Hsp70 mens medier alene (negativ kontrol) ikke gør. Den Bioanalyzer spor viser, at exosomer isoleret fra RAW cellekulturmedier indeholder en række RNA'er, men ikke indeholder store mængder af ribosomale RNA'er, der er typiske i RNA fra helecelle (figur 1C). Figur 1D viser qPCR analyse af mRNA fra fuldblod og exosomer afledt fra blod. Vi er i stand til at isolere 500 ng exosomal RNA fra ~ 10 ml humant blod ved hjælp Mirvana miRNA isolation kit. QPCR resultater indikerer tilstedeværelsen af mRNA'er der koder TNFa og vaskulær endotel vækstfaktor A (VEGFA) i renset exosomer samt i fuldblod.
Ud over qPCR til genekspressionsstudier blev total RNA også anvendes til miRNA. MiRNA TLDA card version 3.0 indeholder primer sonder til ~ 758 miRNA herunder endogene kontrol RNA U6. Med tilføjelsen af den præ-amplifikationen anbefaler sælger 30 ng RNA til at køre en TLDA kort. Dette er nyttigt til at analysere RNA fra exosomer oprenset fra serum eller humant blod, som typisk har lavere udbytter end dem oprenset fra muse blod. MiRNA analyse vist i figur 2 blev udført med 250 ng RNA fra museblodexosomes og 15-30 ng exosomal RNA fra humant blod eller aortaendotelceller (HAOEC). Vores resultater indikerer tilstedeværelsen af 89 miRNA i exosomer indsamlet fra museblod, 209 miRNA i humant blod exosomes og 199 miRNA i exosomes fra humane cellekulturmedier. Repræsentative data for seks miRNA vises som delta Ct-værdi normaliseret til den endogene U6 RNA for gnaver blod (figur 2A), humant blod (figur 2B) og HAOEC cellekultur medier (figur 2C). Mens miR-126 og miR-200c var fraværende i exosomes fra gnaver blod eller HAOEC medier henholdsvis de resterende fire miRNA er til stede i alle tre prøver i varierende mængder. Forhold til exosomer oprenset fra cellekulturmedier, er miR-223 udtrykkes ved højere niveauer i exosomer fra humane og gnaver blodprøver.
Figur 1. Transmission elektronmikroskopi (TEM), western blot-analyse og QRT-PCR for mRNA'er med exosomer oprenset fra forskellige kilder. A) TEM billede af museblod exosomer resuspenderes i 1% glutaraldehyd (venstre) eller RAW celleafledt exosomes resuspenderes i 4% paraformaldehyd, mærket med 10 nm guld og kanin-anti CD81 (til højre) og spottet på Formvar carbon-belagt gitre for EM . analyse (skala bar = 100 nm) B) Western-analyse af HSP70 i exosomer oprenset fra muse blod eller exosome-frie medier + / -. 24 timers inkubation med RAW 264.7 murine celler og resuspenderet i RIPA-buffer C) Bioanalyzer analyse af totalt RNA oprenset fra exosomer afledt fra RAW 264.7 celledyrkningsmedier D) Total RNA oprenset fra fuldblod og exosomer opnået fra en repræsentativ menneskets kontrol blev anvendt til at sammenligne ekspressionsniveauerne af TNFa og VEGFA. Klik herfor at se større figur.
Figur 2. Relativ Angivelse af miRNA fraktion findes i exosomes. Threshold cyklus (CT-værdi) er et relativt mål for koncentrationen af et enkelt miRNA i PCR reaktion og lavere CT værdi angiver højere udtryk. qPCR værdier for seks påviselige exosomal miRNA blev normaliseret til U6 RNA og delta Ct-værdier blev afbildet for exosomes fra tre kilder. En negativ værdi angiver højere udtryk i denne figur. Exosomer fra gnaver blod (A) og humant blod (B) udtrykt HSA-miR-223 i højere niveauer end kontrol, mens exosomer fra HAOEC cellekultur medier (C) udtrykt HSA-miR-223 på lavere niveauer end kontrol. Hsa-miR-226 var fraværende fra gnavere blod exosomes og HSA-miR-200c var fraværende fra HAOEC exosomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol, viser vi kvantificering af miRNA og mRNA fra exosomes oprenses ved differentialcentrifugering fra blod og kultur medier. Exosomer har forskellige komponenter afhængigt af deres oprindelse og er involveret i en række biologiske funktioner, herunder immunrespons, antigen præsentation, intracellulære kommunikation og overførsel af RNA og proteiner 9,11,12,19,20. Mens størrelse og form er en afgørende faktor for exosome renhed, en række papirer viser EM data exosomer indikerer at disse vesikler kan variere i størrelse og morfologi baseret på den kilde, hvorfra de secerneres samt metoden til fiksering og billeddannelse 9 , 15.. Den accepterede størrelse for exosomer af 30-100 nm er et gennemsnitligt område, der omfatter en lille population af exosomer med en større diameter, afhængigt af kilden 21,22, en grund til, at flere metoder anvendes til at validere exosomal renhed. Udskilte miRNA har mange fornødne features af gode biomarkører 23 ud over at være potentielle terapeutiske mål for forskellige sygdomme 2,3,24. Denne rensning metode giver en noninvasiv måde at karakterisere tidsmæssige biologiske forandringer i exosomal indhold fra en række forskellige kropsvæsker, mens miRNA profilering af qPCR giver et samlet overblik over miRNA indhold 2.. Over 4.500 proteiner, 1.639 mRNA'er, 764 miRNA og 194 lipider er kendt for at associere med exosomer 25 ( www.exocarta.org ) og i nogle tilfælde har ændringer i niveauet af disse biomolekyler allerede blevet knyttet til sygdomstilstande. I vores undersøgelser havde exosomer oprenset fra humant blod mange miRNA til fælles med exosomer oprenset fra medierne fra dyrkede humane cellelinjer, men signifikante forskelle fra exosomal miRNA fundet i museblod. Mens der er eksempler på miRNA, der er målrettet kun ét mRNA, mange miRNA fungerer delvist at reducere niveauerne af multiple mål fører til en stærk fysiologisk respons. Beskriver både mRNA og miRNA, der bor i exosomes giver unik indsigt i exosome-medieret informationsoverførsel og den rolle af cirkulerende miRNA i formidling ændringer i genekspression. Oprensning og karakterisering af exosomer fra en række kilder vil være gavnligt at identificere molekylære signaturer forbundet med disse sekretoriske vesikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af midler fra Rita Allen Foundation tilskud til Seena Ajit. Forfatterne vil gerne anerkende Erika Balogh og Dr. Soumitra Ghoshroy fra University of South Carolina Electron Microscopy Center for instrument brug, videnskabelig og teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) | BD Diagnostics | 366643 | For exosome purification from human blood |
| EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) | BD Diagnostics | 367841 | For exosome purification from mouse blood |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | For miRNA isolation from total blood |
| miRVana microRNA isolation kit | Ambion | AM1561 | |
| Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | For TLDA cards |
| Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp human pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman MicroRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| Tumor necrosis factor (primer probe) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Vascular endothelial growth factor A (primer probe) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | For mRNA |
| HSP70 antibody | Abcam | ab94368 | For western blot |
| Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | For electron microscopy |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
| Copper 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Table 1. Table of specific reagents. | |||
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell research. 18, 997-1006 (2008).
- Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PloS one. 3, e3148 (2008).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature. 2, 282 (2011).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
- Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
- Ramachandran, S., Palanisamy, V. Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication. Wiley Interdiscip Rev. RNA. , (2011).
- Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors. Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).
- Ludwig, A. K., Giebel, B. Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
- Masyuk, A. I., et al. Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).
- Fauré, J., et al. Exosomes are released by cultured cortical neurones. Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).
- Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PloS one. 7, e34653 (2012).
- Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).
- Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).
- El-Andaloussi, S., et al. Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nature. 7, 2112-2126 (2012).
- Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo. J. Immunol. 189, 777-785 (2012).
- Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. Extracellular microRNA: A new source of biomarkers. Mutat. Res. , (2011).
- Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics. Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).
- Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids. Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).
