Oprensning og microRNA profilering af Exosomer basis af blod og Kultur Medier
Summary
Tilstedeværelsen af stabile microRNA (miRNA) i exosomes har skabt enorm interesse som en ny form for intercellulær kommunikation, for deres potentielle anvendelighed som biomarkører og som en vej til terapeutisk intervention. Her viser vi exosome oprensning fra blod og kultur medier efterfulgt af kvantitativ PCR til at identificere miRNA, der transporteres.
Abstract
Stabile miRNA er til stede i alle kroppens væsker og nogle cirkulerende miRNA er beskyttet mod nedbrydning ved binding i små vesikler kaldet exosomes. Exosomer kan fusionere med plasmamembranen, der medfører overførsel af RNA og proteiner til målcellen. Deres biologiske funktioner omfatter immunrespons, antigenpræsentation og intracellulær kommunikation. Levering af miRNA, der kan regulere genekspression i modtagerlandene celler via blodet har åbnet nye muligheder for target intervention. Ud over at tilbyde en strategi for levering af medicin eller RNA terapeutiske midler, kan exosomal indhold tjene som biomarkører, der kan støtte i diagnosticering, bestemme behandlingsmuligheder og prognose.
Her vil vi beskrive proceduren for kvantitativ analyse af miRNA og messenger RNA (mRNA) fra exosomes udskilles i blod og celledyrkningsmedier. Oprensede exosomer vil være præget med western blot analyse for ExosOmal markører og PCR for mRNA af interesse. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) og immunogold mærkning vil blive anvendt til at validere exosomal morfologi og integritet. Totalt RNA vil blive oprenset fra disse exosomes at sikre, at vi kan studere både mRNA og miRNA fra den samme prøve. Efter validering RNA integritet ved Bioanalyzer, vil vi udføre en medium gennemløb kvantitativ real-time PCR (qPCR) for at identificere den exosomal miRNA hjælp Taqman Low Density Array (TLDA) kort og genekspressionsstudier for udskrifter af interesse.
Disse protokoller kan anvendes til at kvantificere ændringer i exosomal miRNA i patienter, gnavermodeller og celledyrkningsmedier før og efter farmakologisk intervention. Exosomal indhold varierer på grund af kilden til oprindelse og de fysiologiske forhold af celler, der udskiller exosomes. Disse variationer kan give indsigt i, hvordan celler og systemer håndtere stress eller fysiologiske forstyrrelser. Vores repræsentative data viser variations i miRNA stede i exosomer oprenset fra muse blod, humant blod og cellekulturmedier.
Her vil vi beskrive proceduren for kvantitativ analyse af miRNA og messenger RNA (mRNA) fra exosomes udskilles i blod og celledyrkningsmedier. Oprensede exosomer vil være præget med western blot analyse for exosomal markører og PCR for mRNA'er af interesse. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) og immunogold mærkning vil blive anvendt til at validere exosomal morfologi og integritet. Totalt RNA vil blive oprenset fra disse exosomes at sikre, at vi kan studere både mRNA og miRNA fra den samme prøve. Efter validering RNA integritet ved Bioanalyzer, vil vi udføre en medium gennemløb kvantitativ real-time PCR (qPCR) for at identificere den exosomal miRNA hjælp Taqman Low Density Array (TLDA) kort og genekspressionsstudier for udskrifter af interesse.
Disse protokoller kan anvendes til at kvantificere ændringer i exosomal miRNA in patienter gnaver modeller og celledyrkningsmedier før og efter farmakologisk intervention. Exosomal indhold varierer på grund af kilden til oprindelse og de fysiologiske forhold af celler, der udskiller exosomes. Disse variationer kan give indsigt i, hvordan celler og systemer håndtere stress eller fysiologiske forstyrrelser. Vores repræsentative data viser variationer i miRNA stede i exosomer oprenset fra muse blod, humant blod og cellekulturmedier
Introduction
Korte kodende miRNA modulere genekspression ved binding til mål-mRNA'et. Frø sekvens komplementaritet ~ 7 basepar giver miRNA at binde til mål-mRNA resulterer i inhibering af translation eller i reduktion i stabiliteten af mRNA, som begge kan resultere i nedsat ekspression af målproteinet 1.. Forskning i det sidste årti har utvetydigt bevist en fundamental rolle for miRNA i mediering cellulære funktioner. Der har desuden været en betydelig indsats rettet mod dissekere miRNA medierede molekylære ændringer underliggende forskellige sygdomme 2,3. Desuden nylige identifikation af stabile miRNA i kropsvæsker 4-6 banede vejen for deres anvendelse som nye biomarkører kan underkastes klinisk diagnose.
Én form for miRNA transport i kropsvæsker er via exosomes, små blærer, der bærer mRNA, proteiner, lipidmediatorer og miRNA til modtager celler via systemisk blod circulation 7-14. Dette resulterer i modulering af genekspression i recipientceller og repræsenterer en ny mekanisme for cellulær kommunikation. For eksempel kan celler modulere immun-regulerende processer ved at udskille og / eller absorberende exosomer indeholdende biomolekyler involveret i inflammation, såsom interleukin-1β (IL1β), tumornekrosefaktor-α (TNF), transformerende vækstfaktor-β5 (TGFβ5), og de miRNA, der regulerer disse gener 13.. Som afvigende miRNA udtryk er et fælles træk i en række humane sygdomme, disse molekyler tilbyde nye spændende muligheder for opdagelse og validering af nye terapeutiske mål 2.
Cirkulerende miRNA er til stede i alle kropsvæsker, og det er kendt, at sammensætningen af exosomer er forskellige baseret på kildecellerne hvorfra de blev frigivet. Således tilbyder de en vej til at studere den fysiologiske status af cellerne, og hvordan cellerne alter signalering selvts som reaktion på stress, herunder sygdomme. Studere ændringer i exosome sammensætning kan give indsigt i signaltransduktion og undersøge deres potentielle anvendelighed som biomarkører eller terapeutisk intervention ruter.
Her vil vi vise, rensning af exosomer fra flere kilder er baseret på offentliggjorte protokoller. Disse exosomer vil blive anvendt til RNA-isolering efterfulgt af qPCR at identificere og måle niveauet af miRNA i exosomer.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol, viser vi kvantificering af miRNA og mRNA fra exosomes oprenses ved differentialcentrifugering fra blod og kultur medier. Exosomer har forskellige komponenter afhængigt af deres oprindelse og er involveret i en række biologiske funktioner, herunder immunrespons, antigen præsentation, intracellulære kommunikation og overførsel af RNA og proteiner 9,11,12,19,20. Mens størrelse og form er en afgørende faktor for exosome renhed, en række papirer viser EM data exosomer indikerer at disse v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af midler fra Rita Allen Foundation tilskud til Seena Ajit. Forfatterne vil gerne anerkende Erika Balogh og Dr. Soumitra Ghoshroy fra University of South Carolina Electron Microscopy Center for instrument brug, videnskabelig og teknisk bistand.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) | BD Diagnostics | 366643 | For exosome purification from human blood |
| EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) | BD Diagnostics | 367841 | For exosome purification from mouse blood |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | For miRNA isolation from total blood |
| miRVana microRNA isolation kit | Ambion | AM1561 | |
| Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | For TLDA cards |
| Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp human pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman MicroRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| Tumor necrosis factor (primer probe) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Vascular endothelial growth factor A (primer probe) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | For mRNA |
| HSP70 antibody | Abcam | ab94368 | For western blot |
| Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | For electron microscopy |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
| Copper 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Table 1. Table of specific reagents. |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell research. 18, 997-1006 (2008).
- Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PloS one. 3, e3148 (2008).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature. 2, 282 (2011).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
- Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
- Ramachandran, S., Palanisamy, V. Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication. Wiley Interdiscip Rev. RNA. , (2011).
- Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors. Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).
- Ludwig, A. K., Giebel, B. Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
- Masyuk, A. I., et al. Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).
- Fauré, J., et al. Exosomes are released by cultured cortical neurones. Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).
- Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PloS one. 7, e34653 (2012).
- Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).
- Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).
- El-Andaloussi, S., et al. Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nature. 7, 2112-2126 (2012).
- Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo. J. Immunol. 189, 777-785 (2012).
- Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. Extracellular microRNA: A new source of biomarkers. Mutat. Res. , (2011).
- Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics. Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).
- Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids. Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).
