Summary
De aanwezigheid van stabiele microRNA (miRNA) in exosomes heeft immense belangstelling gegenereerd als een nieuwe wijze van intercellulaire communicatie, voor hun potentiële nut als biomarkers en als een route voor therapeutische interventie. Hier laten we zien exosome zuivering van het bloed en de cultuur media, gevolgd door kwantitatieve PCR om miRNA's worden vervoerd identificeren.
Abstract
Stabiele miRNA's zijn aanwezig in alle lichaamsvloeistoffen en sommige circulerende miRNA's worden beschermd tegen afbraak door vastlegging in kleine blaasjes genaamd exosomes. Exosomes kunnen fuseren met de plasmamembraan leidt tot de overdracht van RNA en eiwitten aan de doelcel. Hun biologische functies zijn immuunrespons antigeenpresentatie en intracellulaire communicatie. Levering van miRNAs die genexpressie kan reguleren in de ontvangende cellen via het bloed heeft nieuwe wegen voor doel interventie geopend. Naast het aanbieden van een strategie voor de levering van drugs of RNA therapeutische middelen, kunnen exosomaal inhoud dienen als biomarkers die kunnen helpen bij de diagnose, het bepalen van behandelingsmogelijkheden en prognose.
Hier zullen we de procedure beschrijven voor het kwantitatief analyseren van miRNAs en messenger RNA (mRNA) uit exosomes uitgescheiden in het bloed en de media voor celkweek. Gezuiverde exosomes zal worden gekarakteriseerd met behulp van western blot analyse voor exosomal markers en PCR voor mRNA's die van belang zijn. Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) en immuno labeling wordt gebruikt om exosomal morfologie en integriteit valideren. Totaal RNA wordt gezuiverd van deze exosomes om ervoor te zorgen dat we zowel mRNA en miRNA uit hetzelfde monster kunnen bestuderen. Na RNA integriteit valideren door Bioanalyzer, zullen we een middelgrote doorvoer kwantitatieve real time PCR (qPCR) uit te voeren om de exosomaal miRNA met Taqman Low Density Array (TLDA) kaarten en genexpressie studies voor transcripties van belang te identificeren.
Deze protocollen kunnen worden gebruikt om wijzigingen in exosomal miRNAs kwantificeren patiënten diermodellen en celkweekmedium voor en na farmacologische interventie. Exosomaal inhoud variëren afhankelijk van de bron van herkomst en de fysiologische omstandigheden van cellen die afscheiden exosomes. Deze variaties kunnen inzicht geven over hoe cellen en systemen omgaan met stress of fysiologische verstoringen. Onze representatieve gegevens tonen variations in miRNAs presenteren exosomes gezuiverd uit muizen bloed, menselijk bloed en menselijke celkweek media.
Hier zullen we de procedure beschrijven voor het kwantitatief analyseren van miRNAs en messenger RNA (mRNA) uit exosomes uitgescheiden in het bloed en de media voor celkweek. Gezuiverde exosomes zal worden gekarakteriseerd met behulp van western blot analyse voor exosomaal markers en PCR voor mRNA's van belang zijn. Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) en immuno labeling wordt gebruikt om exosomal morfologie en integriteit valideren. Totaal RNA wordt gezuiverd van deze exosomes om ervoor te zorgen dat we zowel mRNA en miRNA uit hetzelfde monster kunnen bestuderen. Na RNA integriteit valideren door Bioanalyzer, zullen we een middelgrote doorvoer kwantitatieve real time PCR (qPCR) uit te voeren om de exosomaal miRNA met Taqman Low Density Array (TLDA) kaarten en genexpressie studies voor transcripties van belang te identificeren.
Deze protocollen kunnen worden gebruikt om veranderingen in exosomaal miRNAs kwantificeren in patiënten, knaagdier modellen en celcultuurmedia voor en na farmacologische interventie. Exosomaal inhoud variëren afhankelijk van de bron van herkomst en de fysiologische omstandigheden van cellen die afscheiden exosomes. Deze variaties kunnen inzicht geven over hoe cellen en systemen omgaan met stress of fysiologische verstoringen. Onze representatieve gegevens tonen variaties in miRNAs presenteren exosomes gezuiverd uit muizen bloed, menselijk bloed en menselijke celcultuurmedia
Introduction
Korte noncoding miRNAs moduleren genexpressie door te binden aan het doelwit mRNA. Zaad sequentiecomplementariteit van ~ 7 basenparen kunnen miRNA te binden aan het doel-mRNA resulteert in de remming van translatie of vermindering van de stabiliteit van het mRNA, die beide kunnen leiden tot verminderde expressie van het doeleiwit 1. Onderzoek van de afgelopen tien jaar heeft ondubbelzinnig een fundamentele rol voor miRNAs bewezen in het bemiddelen cellulaire functies. Er is ook een aanzienlijke inspanning gericht op het ontleden van miRNA gemedieerde moleculaire veranderingen ten grondslag liggen aan diverse ziekten 2,3. Bovendien recente identificatie van stabiele miRNAs in lichaamsvloeistoffen 4-6 maakte de weg vrij voor het gebruik ervan als nieuwe biomarkers vatbaar voor klinische diagnose.
Het ene vervoermiddel miRNA in lichaamsvloeistoffen is via exosomes, kleine blaasjes die mRNA's dragen, proteïnen, lipiden bemiddelaars, en miRNAs aan ontvanger cellen via systemische bloion 7-14. Dit resulteert in modulatie van genexpressie in ontvangende cellen en vertegenwoordigt een nieuw mechanisme van cellulaire communicatie. Bijvoorbeeld kunnen cellen immuun-regulerende processen moduleren secreteren en / of absorberen van exosomen bevattende biomoleculen van inflammatie zoals interleukine-1β (IL1β), tumor necrosis factor-α (TNFa), transformerende groeifactor-β5 (TGFβ5) en de miRNAs dat deze genen reguleren 13. Zoals afwijkende miRNA expressie is een gemeenschappelijk kenmerk in een verscheidenheid van ziekten bij de mens, deze moleculen bieden opwindende nieuwe mogelijkheden voor de ontdekking en validatie van nieuwe therapeutische doelwitten 2.
Circulerende miRNAs zijn in alle lichaamsvloeistoffen en het is bekend dat de samenstelling van exosomes verschilt zich uitgaande van de cellen waaruit ze werden vrijgelaten. Zo bieden zij een laan naar de fysiologische toestand van de cellen te bestuderen en hoe de cellen zelfs alter signaleringts in reactie op stress, waaronder ziekten. Studeren veranderingen in exosome samenstelling kan inzicht geven in signaaltransductie en onderzoeken hun potentiële nut als biomarkers of therapeutische interventie routes.
Hier zullen we de zuivering van exosomes uit meerdere bronnen op basis van gepubliceerde protocollen te tonen. Deze exosomes zullen worden gebruikt voor RNA-isolatie gevolgd door qPCR om de niveaus van miRNAs in de exosomes identificeren en te meten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten met bloedmonsters van de mens en knaagdieren werden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante richtlijnen, verordeningen en regelgevende instanties. Proefpersonen werden ingeschreven na het geven van geïnformeerde toestemming zoals goedgekeurd door de Drexel University College of Medicine Institutional Review Board en alle procedures voor het onderzoek uitgevoerd met dieren werden goedgekeurd door Drexel's Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1. Exosome Zuivering van het bloed (~ 5,5 uur)
TIPS
- We resuspendeer exosomes van het ene buisje bloed (~ 10 ml menselijk bloed en ~ 2 ml muis bloed) in 300 ul RNA lysisbuffer uit de Mirvana miRNA isolatie kit.
- Om exosomes van celkweekmedium zuiveren, wordt het medium gecentrifugeerd bij 500 xg gedurende 10 min. om cellen te verwijderen en tevens gefiltreerd door een 0,22 urn filter na centrifugeren bij 12.000 x g. De exosome zuivering van celcultuurmediaeen verdunning in PBS, de PBS wassen of de tweede ultracentrifuge stap niet nodig.
- Indien de gezuiverde exosomes wordt gebruikt voor proteomics studies, het toevoegen van een sucrose gradiënt centrifugatie stap na ultracentrifugatie stap zal de hoeveelheid eiwit aggregaten en verontreinigingen 15 verminderen.
- De waargenomen morfologie van exosomes kan afhankelijk van de bron en de verwerkingsstappen voor TEM. We hadden niet in acht nemen van de komvormige morfologie voor exosomes die eerder toegeschreven aan verschillen in de steekproef verwerking 9,15. Onze TEM beelden waaronder de immunogoud etikettering zijn vergelijkbaar met eerdere rapporten uit verschillende bronnen, waaronder bloed, gal en corticale cultuur afgeleid exosomes 9,16,17.
- Omkeren EDTA gecoate buis met daarin het bloed 5x en plaats rechtop bij kamertemperatuur gedurende 10-60 minuten.
- Centrifugeer bij 2000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Verzamel de bovenste laag, het plasma, in 15 ml buizen en blijf op ijs.
- Verdun fluïdum met een gelijk volume PBS. Centrifugeer 30 minuten bij 2000 xg bij 4 ° C.
- Transfer naar centrifugebuizen, voeg 1X PBS voor een totaal volume van 24 ml en centrifugeer 45 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C.
- Transfer naar ultracentrifuge buizen en centrifugeer 2 uur bij 110.000 xg bij 4 ° C.
- Resuspendeer pellet in PBS en centrifugeer 1 uur bij 100.000 xg bij 4 ° C.
- Resuspendeer pellet in geschikte buffer (RNA lysisbuffer).
- Resuspendeer in PBS of RIPA buffer respectievelijk elektronenmicroscopie en western blot analyse.
2. RNA-zuivering met een aangepaste Mirvana miRNA Isolation Kit (~ 1 uur)
TIPS
- Bereid de ruimte voor het isoleren van RNA door het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), vlakken schoon te vegen en pipetten met RNase Zap, en met steriele filter tips en buizen.
- Een on-column DNase behandelingsstap toevoegen verwijdert sporen van DNA die aanwezig kunnen zijn. Afhankelijk van de bron van exosomes is DNA gerapporteerd afwezig in exosomes gezuiverd uit een aantal bronnen, waaronder muizen en humane cellijnen mast 8 maar chromosomaal DNA sequenties zijn in exosomes gezuiverd uit medium van gekweekte cardiomyocyten 18 gedetecteerd.
- We verminderde het volume wasoplossing 1-350 pl (stap 2.4) omdat de verkoper geeft alleen voldoende wasoplossing 1 gedurende een 700 ul toevoeging. Indien het volume niet wordt verminderd er niet voldoende oplossing links voor het gebruik van de volledige inhoud kit. Overige stappen werden uitgevoerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
- Voeg 1/10 volume van miRNA Homogenaat Additive (30 pl) en incubeer op ijs gedurende 10 minuten.
- Extraheer met een volume van zuur-fenol: chloroform gelijk aan het initiële volume lysaat. Centrifugeer en herstellen van de bovenste fase in een nieuwe buis.
- Voeg 1,25 volumes 100% ethanol (375 ul). Vortex. Toepassen op cartridge filteren en centrifugeer 15 sec bij 10000 x g.
- Voeg de helft van de aanbevolen hoeveelheid miRNA Wash Oplossing 1 (350 pl) en centrifugeer 15 sec bij 10000 x g.
- Voeg 10 ul DNase 1-70 pi buffer RDD (Qiagen) voor elk monster. Voeg 80 ul kolom en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg Wash Solution 1 (350 pl) en centrifugeer 15 sec bij 10.000 x g.
- Voeg Wash Solution 2/3 (500 ul) en centrifugeer 15 sec bij 10.000 x g. REPEAT.
- Elueer met 40 pl 95 ° C nuclease-vrij H2O
- Bepaal de concentratie van het RNA en verdun het RNA tot 100 ng / ul.
3. miRNA profilering van Exosomes van Blood Met behulp Taqman Low Density Array (TLDA) Kaarten (~ 6,5 uur)
TIPS
- Bereid de ruimte voor het isoleren van RNA door het dragen van PBM, vlakken schoon te vegen en pipetten met RNase Zap, en met steriele filter tips en buizen.
- Pre-amplificatie (pre-amp) stap wordt aanbevolen voor 1-350 ng RNA (350-1,000 ng monsters niet pre-amp stap na cDNA synthese vereist). Het is belangrijk om te bepalen of pre-amp is noodzakelijk voor uw steekproef, omdat je alle monsters moeten behandelen onder gelijke omstandigheden. Pre-amp stap voegt kosten en de Ct-waarden hebben een lager aanvaardbaar cut off (32 ipv 40).
- Het is nuttig om de cDNA reactie strip buizen bereiden in plaats van een plaat, afhankelijk van het aantal kaarten die kunnen worden uitgevoerd in een enkele dag. Dit zal bevriezen en ontdooien van cDNA monsters die niet worden verwerkt op dezelfde dag minimaliseren.
- Exosomes verzameld uit verschillende bronnen hebben verschilhuren hoeveelheden RNA. Met dit protocol kunt maximaal 3 pi RNA template voor de synthese van cDNA reactie. Afhankelijk van de bron, de hoeveelheid exosomaal RNA die kunnen worden geïsoleerd kunnen worden beperkt. Terwijl een typische weefsel genoeg RNA zou opleveren dat cDNA zou worden gemaakt van 100 ng RNA in 3 ul volume, exosomes uit menselijk bloed of celcultuurmedia bevatten vaak minder RNA en cDNA moet worden gemaakt van minder uitgangsmateriaal. Het muizenbloed exosomes bevatten hogere niveaus van RNA en ten minste 100 ng in 3 ui kan worden verkregen.
- Ter voorbereiding cDNA uit gezuiverde RNA met behulp van Megaplex Zwembaden reverse transcriptase primers (Poule A en Poule B bevatten primers voor de miRNAs op microfluïdische kaarten array A en B), ontdooi de reactie componenten op het ijs.
- Label twee RNase-free 1,5 ml buizen voor RT-reactie met zwembad A primers of Pool B primers en componenten toe te voegen in de grafiek orde. Voeg minstens een extra hoeveelheid bestanddelen voor 2 of meer reacties of een master mix zoals door thij vendor.
| RT reactie Component | Component Concentratie | Volume voor 1 steekproef (totaal V / sample = 4,5 pi) |
| Nuclease-vrij water | 0,20 pi | |
| Megaplex RT buffer (10X) | 1X | 0.80 pi |
| dNTPs (100 mM) | 4.4 mM | 0,20 pi |
| MgCl2 (25 mM) | 5 mM | 0.90 pi |
| RNase Inhibitor (20U/μl) | 2 U | 0.10 pi |
| Megaplex RT Primers A of B (10X) | 1X | 0.80 pi |
| MultiScribe reverse transcriptase | 75 U | 1.50 pi |
- Omkeren buizen 6 keer en centrifuge kort. Dan, pipet 4,5 pi RT-reactie mengsel in MicroAmp 8-tube strips of een 96-wells MicroAmp optische reactie plaat.
- Voeg 100 ng RNA en het volume op 3 pi met DEPC behandeld water of voeg 3 ul totaal RNA, roer met de pipet tip, en sluit de buizen of platen. Spin kort en incubeer op ijs gedurende 5 minuten.
- Laad de reactie in de PCR-apparaat en voer het uit onder de volgende voorwaarden (zoals aanbevolen door de Applied Biosystems Megaplex Zwembaden protocol):
| Stadium | Temp | Tijd |
| Cyclus (40x) | 16 ° C | 2 min |
| 42 ° C | 1 min | |
| 50 ° C | 1 sec | |
| Houden | 85 ° C | 5 min |
| Houden | 4 ° C | ∞ |
- WINKEL cDNA bij -20 ° C (goed tenminste een week) of blijven pre-Amp stap kan worden opgeslagen gedurende een week.
- Ontdooien PreAmp primers voor Poule A en Poule B op ijs en zwenken om te mengen. Werveling Taqman Pre-Amp meester mixen en te houden op het ijs ook.
- Volg de grafiek toevoegen van ten minste een extra volume van componenten voor 2 of meer reacties of maak een master mix zoals aanbevolen door de leverancier.
| Pre-Amp Reactie Component | Volume voor 1 steekproef |
| Nuclease-vrij water | 7,5 pl |
| Taqman PreAmp Master Mix (2X) | 12,5 ul |
| Megaplex PreAmp Primers A of B (10X) | 2,5 pl |
- Pipetteer 2,5 pl RT product in MicroAmp 8-tube strips of een 96-wells MicroAmp optische reactie plaat en afzien van 22,5 ul PreAmp reactiemix in elk putje.
- Seal de plaat, incubeer op ijs 5 min en dan laadt het monster in de PCR-apparaat. Uitgevoerd onder de volgende omstandigheden.
| Stadium | Temp | Tijd |
| Houden | 95 ° C | 10 min |
| Houden | 55 ° C | 2 min |
| Houden | 72 ° C | 2 min |
| Cyclus (12x) | 95 ° C | 15 sec |
| 60 ° C | 4 min | |
| Houden | 99.9 ° C | 10 min |
| Houden | 4 ° C | ∞ |
- Na de voorversterker reactie is voltooid, kort de buizen of platen gecentrifugeerd en vervolgens voeg 75 ul 0.1X TE pH 8,0 aan elk putje of buis.
- Verzegelen en mix en spin kort. Bewaar het verdunde product gedurende een week bij -20 ° C of verder naar de plaat te laden.
- Combineren de volgende in een RNase-free 1.5 ml buis op ijs.
| Bestanddeel | Volume voor 1 kaart |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG (2X) | 450 pl |
| Verdunde voorversterker product | 9 pl |
| Nuclease-vrij water | 441 pl |
- Omkeren van de buis te mengen en centrifuge kort. Verdeel 100 pi PCR-mix in elke haven van de Taqman MicroRNA Array kaart.
- Centrifugeer de kaart 2 x 1.000 x g gedurende 1 min. Sluit de kaart en voer het uit met behulp van de sjabloon van de primers in de Applied Biosystems handleiding en de 384 goed Taqman Low Density Array instellingen. We maken gebruik van Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR-systeem.
4. mRNA analyse door Taqman (~ 1,5 uur)
- Om qPCR reactie te bereiden, meng de reactie componenten in de volgorde in de grafiek. Alle monsters worden geanalyseerd met primer probes voor het gen van belang evenals 18S rRNA als de normalizer gen.
| Taqman Reaction Component | Volume voor 1 steekproef |
| Nuclease-vrij water | 7 pl (aanpassen op basis van individuele steekproef) |
| Taqman Fast Master Mix (2X) | 10 gl |
| TaqMan Primer sondes (20x) | 1 ui |
| cDNA van 100 ng RNA | 2 & mu, L (aanpassen op basis van individuele steekproef) |
- Voer de 96 wells plaat met behulp van de Fast 96-blok, zoals aanbevolen door de fabrikant (Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na scheiding van exosomen uit bloed of celkweek media, kan de zuiverheid van de exosomes worden getest door elektronenmicroscopie (EM) en western blot (Figuren 1A en 1B). We bevestigden onze exosome preparaten uit verschillende bronnen met EM en western blot met verschillende antilichamen. Figuur 1A toont EM beelden bevestigen dat exosomes intact met een diameter van ~ 30 -100 nm en bevatten CD81 door immuno labeling. Veelgebruikte exosomaal markers zijn Hsp70 en tetraspannin familie glycoproteïnen CD63, CD81 en CD9 14. Na bevestiging van de integriteit van het gezuiverde exosomes, voerden wij Western blot voor Hsp70 in fig. 1B en toonde dat exosomes Hsp70 bevatten terwijl alleen medium (negatieve controle) niet. De Bioanalyzer trace blijkt dat exosomes geïsoleerd uit RAW kweekmedium bevatten verschillende RNAs, maar grote hoeveelheden ribosomaal RNA die typisch in RNA van volledige bevattencel (figuur 1C). Figuur 1D toont qPCR analyse van mRNA uit volbloed en exosomes afkomstig van bloed. Wij zijn in staat om 500 ng exosomaal RNA te isoleren van ~ 10 ml humaan bloed met behulp van Mirvana miRNA isolatie kit. De qPCR resultaten wijzen op de aanwezigheid van mRNA dat codeert voor TNFa en vasculaire endotheliale groeifactor A (VEGFA) in gezuiverde exosomes als in volbloed.
Behalve voor qPCR genexpressie studies, werd totaal RNA ook gebruikt voor miRNA profilering. De miRNA TLDA kaart versie 3.0 bevat primer probes voor ~ 758 miRNAs waaronder de endogene controle RNA U6. Met de toevoeging van de pre-amplificatiestap, de verkoper adviseert 30 ng RNA een TLDA kaart uitvoeren. Dit is nuttig voor het analyseren van RNA exosomes gezuiverd uit serum of humaan bloed die typisch lagere opbrengsten dan gezuiverd uit muizenbloed. Het miRNA analyse getoond in figuur 2 werd uitgevoerd met 250 ng RNA van muisbloedexosomes en 15-30 ng exosomaal RNA uit menselijk bloed of aorta endotheelcellen (HAOEC). Onze resultaten wijzen op de aanwezigheid van 89 miRNAs in exosomes verzameld uit muizenbloed, 209 miRNAs in menselijk bloed exosomes, en 199 miRNAs in exosomes uit humane celkweek media. Representatieve gegevens voor zes miRNAs wordt weergegeven als delta Ct-waarde genormaliseerd om de endogene U6-RNA voor knaagdieren bloed (Figuur 2A), menselijk bloed (Figuur 2B) en HAOEC celkweekmedia (figuur 2C). Terwijl miR-126 en miR-200c waren afwezig in exosomes van respectievelijk knaagdieren bloed of HAOEC media, de overige vier miRNA's zijn aanwezig in alle drie de monsters in verschillende hoeveelheden. Ten opzichte van exosomes gezuiverd uit celkweek media, miR-223 wordt uitgedrukt op hogere niveaus in exosomes van mens en knaagdier bloedmonsters.
Figuur 1. Transmission elektronenmicroscopie (TEM), Western blot analyse en qRT-PCR voor mRNA middels exosomes gezuiverd uit verschillende bronnen. A) TEM beeld van muisbloed exosomes gesuspendeerd in 1% glutaaraldehyde (links) of RAW-cel afgeleide exosomes geresuspendeerd in 4% paraformaldehyde, gemerkt met 10 nm goud en konijn-anti-CD81 (rechts) en gespot op formvar koolstof beklede roosters voor EM . analyse (schaal bar = 100 nm) B) Western analyse van HSP70 in exosomes gezuiverd uit muizenbloed of exosome-vrije media + / -. 24 uur incubatie met RAW 264.7 muizen cellen en geresuspendeerd in RIPA buffer C) Bioanalyzer analyse van totaal RNA gezuiverd van exosomes afgeleid van RAW 264.7 celcultuurmedia D) Totaal RNA gezuiverd uit volbloed en exosomes verkregen van een representatieve menselijke controle werd gebruikt om de expressie van TNF en VEGFA vergelijken. Klik hierom een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Relatieve expressie van miRNA fractie in exosomes. Drempelcyclus (CT-waarde) is een relatieve maat voor de concentratie van een individuele miRNA in de PCR reactie en lagere CT waarde geeft een hogere expressie. qPCR waarden voor zes detecteerbare exosomaal miRNAs werden genormaliseerd om U6-RNA en de delta Ct-waarden werden geplot voor exosomes uit drie bronnen. Een negatieve waarde geeft een hogere expressie in deze figuur. Exosomes van knaagdieren bloed (A) en het menselijk bloed (B) uitgedrukt HSA-miR-223 op een hoger niveau dan de controle, terwijl exosomes uit HAOEC celkweekmedia (C) uitgedrukt HSA-miR-223 op een lager niveau dan de controle. Hsa-miR-226 was afwezig knaagdieren bloed exosomes en HSA-miR-200c was afwezig HAOEC exosomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol, tonen we de kwantificering van miRNAs en mRNA's van exosomes gezuiverd door differentiële centrifugatie uit bloed en cultuur media. Exosomes hebben verschillende componenten afhankelijk van hun oorsprong en zijn betrokken bij een aantal biologische functies, waaronder immuunrespons antigeenpresentatie, intracellulaire communicatie, en de overdracht van RNA en eiwitten 9,11,12,19,20. Terwijl and size bepalend is exosome zuiverheid, een aantal documenten met EM-gegevens van exosomes blijkt dat deze vesicles kunnen variëren in grootte en morfologie gebaseerd op de bron waaruit ze worden ook afgescheiden en de wijze van bevestiging en imaging 9 , 15. De geaccepteerde maat voor exosomes van 30-100 nm is een gemiddelde bereik dat een kleine populatie van exosomes met een grotere diameter afhankelijk van de bron 21,22, een reden dat verschillende methoden worden gebruikt om exosomal zuiverheid valideren omvat. Afgescheiden miRNAs hebben veel vereiste Features goede biomarkers 23 naast zijn potentiële therapeutische doelen voor diverse ziekten 2,3,24. Deze zuivering methode geeft een niet-invasieve manier om tijdelijke biologische veranderingen in exosomaal inhoud karakteriseren van verschillende lichaamsvloeistoffen terwijl miRNA profilering door qPCR geeft een uitgebreid overzicht van miRNA inhoud 2. Meer dan 4.500 eiwitten, 1.639 mRNAs, 764 en 194 miRNAs lipiden bekend koppelen exosomes 25 ( www.exocarta.org ) en in sommige gevallen, heeft veranderingen in de niveaus van deze biomoleculen reeds verbonden ziektetoestanden. In onze studies, de exosomes gezuiverd uit menselijk bloed had vele miRNAs gemeen met exosomes gezuiverd van media uit gekweekte humane cellijnen, maar significante verschillen ten opzichte van exosomaal miRNA's gevonden in de muis bloed. Hoewel er voorbeelden van miRNAs die slechts een mRNA targeten vele miRNAs functie om de niveaus van multip gedeeltelijk verminderenle richt leidt tot een sterke fysiologische respons. Karakteriseren zowel mRNA en miRNA dat in exosomes wonen geeft uniek inzicht in exosome-gemedieerde informatie-overdracht en de rol van circulerende miRNA's in het bemiddelen veranderingen in genexpressie. Zuivering en karakterisering van exosomen uit verschillende bronnen zullen nuttig zijn bij het identificeren van moleculaire signaturen in verband met deze secretorische blaasjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door fondsen van Rita Allen Stichting subsidie aan Seena Ajit. De auteurs willen graag Erika Balogh en Dr Soumitra Ghoshroy erkennen van de Universiteit van South Carolina Electron Microscopy Center te gebruiken instrument, wetenschappelijke en technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) | BD Diagnostics | 366643 | For exosome purification from human blood |
| EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) | BD Diagnostics | 367841 | For exosome purification from mouse blood |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | For miRNA isolation from total blood |
| miRVana microRNA isolation kit | Ambion | AM1561 | |
| Acid-Phenol: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | For TLDA cards |
| Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp human pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman MicroRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| Tumor necrosis factor (primer probe) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Vascular endothelial growth factor A (primer probe) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | For mRNA |
| HSP70 antibody | Abcam | ab94368 | For western blot |
| Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | For electron microscopy |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
| Copper 300 mesh carbon formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Table 1. Table of specific reagents. | |||
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell research. 18, 997-1006 (2008).
- Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PloS one. 3, e3148 (2008).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature. 2, 282 (2011).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
- Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
- Ramachandran, S., Palanisamy, V. Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication. Wiley Interdiscip Rev. RNA. , (2011).
- Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors. Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).
- Ludwig, A. K., Giebel, B. Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
- Masyuk, A. I., et al. Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).
- Fauré, J., et al. Exosomes are released by cultured cortical neurones. Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).
- Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PloS one. 7, e34653 (2012).
- Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).
- Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).
- El-Andaloussi, S., et al. Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nature. 7, 2112-2126 (2012).
- Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo. J. Immunol. 189, 777-785 (2012).
- Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. Extracellular microRNA: A new source of biomarkers. Mutat. Res. , (2011).
- Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics. Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).
- Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids. Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).
