Summary
Somitogenesis एक लयबद्ध विकास की प्रक्रिया है कि स्थानिक पैटर्न हड्डीवाला भ्रूण के शरीर धुरी. इससे पहले, हम इस प्रक्रिया ड्राइव कि चक्रीय जीन निरीक्षण करने के लिए फ्लोरोसेंट संवाददाताओं का उपयोग करने वाले ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों का विकास किया. यहाँ, हम संस्कृति विट्रो में समय के साथ इन लाइनों और छवि उनके दोलनों से कोशिकाओं छितरी हुई है.
Abstract
विभाजन रीढ़ में एक आवधिक और अनुक्रमिक morphogenetic प्रक्रिया है. शरीर की धुरी के साथ somites बुलाया ऊतक के ब्लॉक का यह लयबद्ध गठन विकासशील भ्रूण patterning एक आनुवंशिक थरथरानवाला का सबूत है. Zebrafish में, intracellular घड़ी ड्राइविंग विभाजन नकारात्मक प्रतिक्रिया छोरों में आयोजित उसका / Hes प्रतिलेखन कारक परिवार के सदस्यों के शामिल है. हमने हाल ही में presomitic mesoderm (पी एस एम) में दोलनों की spatio-अस्थायी पैटर्न पुनरावृत्ति कि चक्रीय जीन her1 के लिए ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट संवाददाता लाइनों उत्पन्न किया है. इन लाइनों का प्रयोग, हम एक पृथक पी एस एम कोशिकाओं के भीतर विभाजन घड़ी दोलनों की वास्तविक समय विश्लेषण की अनुमति देता है कि इन विट्रो संस्कृति प्रणाली विकसित की है. ट्रांसजेनिक भ्रूण से पी एस एम के ऊतकों को हटाने और फिर गिलास नीचे व्यंजन पर क्षेत्रों oscillating से कोशिकाओं dispersing द्वारा, हम प्रतिदीप्ति संकेत के समय चूक इमेजिंग से के लिए उपयुक्त संस्कृतियों उत्पन्नव्यक्तिगत घड़ी कोशिकाओं. यह दृष्टिकोण अपने सेल स्वायत्त और ऊतक स्तर गुण प्रतिष्ठित और विच्छेदित करने की अनुमति, अभूतपूर्व एकल कक्ष संकल्प के साथ विभाजन घड़ी के प्रत्यक्ष हेरफेर के लिए एक प्रयोगात्मक और वैचारिक ढांचे प्रदान करता है.
Introduction
हड्डीवाला शरीर अक्ष, या somitogenesis साथ क्षेत्रों की आवधिक गठन, विकासशील भ्रूण में एक स्थानिक और लौकिक थरथरानवाला का सबूत है. somitogenesis नियंत्रित इष्ट तंत्र धारणा अब intracellularly चक्रीय जीन 2 के एक सेट की लयबद्ध अभिव्यक्ति के द्वारा संचालित होने लगा सेलुलर oscillators से मिलकर "घड़ी", गठन दूर ticks जिसमें एक "घड़ी और wavefront" मॉडल 1, द्वारा वर्णित है के somites presomitic mesoderm (पी एस एम) से. भ्रूण के रूप में विकसित, पी एस एम में एक परिपक्वता "wavefront" धीमा और यह 3 गुजरता के रूप में सेलुलर oscillators गिरफ्तार, पीछे की ओर regressing ऊतक के साथ संगीत कार्यक्रम में ले जाता है. साथ में, इस spatiotemporally गतिशील सिस्टम विभाजन घड़ी करार दिया है. विभाजन घड़ी अवधि स्थानीय युग्मन वें करने के लिए एकल कक्षों में आनुवंशिक थरथरानवाला से संगठन के तीन बढ़ते स्तर का अध्ययन करने के लिए वर्तमान दृष्टिकोणपर कोशिकाओं और अंत में सामूहिक पी एस एम ऊतक 4 में स्थितीय जानकारी की वैश्विक विनियमन के बीच होता है.
पिछले अध्ययनों zebrafish में सेल स्वायत्त विभाजन थरथरानवाला transcriptional दमन 5-7 के माध्यम से एक नकारात्मक प्रतिक्रिया पाश फार्म लगा रहे हैं जो factorfamily उसकी / वह प्रतिलेखन, से जीन और प्रोटीन उत्पादों के होते हैं का सुझाव देते हैं. डेल्टा / पायदान संकेतन मार्ग पड़ोसी कोशिकाओं के बीच दोलनों सिंक्रनाइज़ और जनसंख्या 8-10 का सामूहिक अवधि को नियंत्रित करता है. Tailbud में उत्पादित FGF संकेतन अणुओं zebrafish पी एस एम भर में एक ढाल बनाने के लिए दिखाई देते हैं, और इस तरह पूर्वकाल 11 में झूलते कोशिकाओं धीमा और गिरफ्तार करने में योगदान करने की धारणा रहे हैं. अब तक, somitogenesis में इन अणुओं में से प्रत्येक के कार्यात्मक भूमिका आनुवंशिक उत्परिवर्तन, morpholino इंजेक्शन, गर्मी झटका अधिक अभिव्यक्ति, और विरोधी दवा trea द्वारा जांच की गई हैघड़ी घटकों और कोशिकाओं 5,7,10,12 के बीच संकेतन के tment. इन perturbations का प्रयोग, विभाजन घड़ी समारोह ऊतक स्तर विखंड दोषों का विवरण और her1, her7, और डेल्टा की तरह चक्रीय जीनों की अभिव्यक्ति में वर्दी दोलनों के नुकसान से inferred किया गया है सी. हालांकि, लगभग इन सभी डेटा की अचल भ्रूण से कर रहे हैं और सही विभाजन घड़ी की गतिशील समारोह के लिए निहित हैं कि परिवर्तन पर कब्जा करने में विफल. हाल ही में, कई भ्रूण समय चूक इमेजिंग बदल थरथरानवाला अवधि के साथ पहली म्यूटेंट से पता चला है, लेकिन इन टिप्पणियों को भी ऊतक स्तर 7,13 पर किए गए थे. इस प्रकार, somitogenesis दौरान धारणा सेल स्वायत्त थरथरानवाला का व्यवहार नहीं रखा गया है.
स्वाभाविक प्रक्रिया एक oscillatory प्रणाली से प्रेरित है, क्योंकि somitogenesis की स्टेटिक फोटो एक अधूरी तस्वीर दे. माउस और लड़की कोशिकाओं में पहले काम से पता चला है कि प्रतिलेख के स्तरऔर प्रोटीन उत्थान और पतन, लेकिन एक लगभग 2 घंटे दोलन हर 30 या 45 मिनट के नमूने जरूरी एकत्र डेटा और 14,15 खींचा जा सकता है कि इसलिए निष्कर्ष प्रतिबंधित करता है. अन्य जैविक oscillators के अध्ययन, सबसे विशेष रूप से, circadian घड़ियों, वास्तविक समय फ्लोरोसेंट और bioluminescent पत्रकारों 16,17 का उपयोग की निगरानी करने के लिए दूर जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति का मंचन माप से ले जाया गया है. ये उपकरण एकल कक्षों 18 की घड़ी गुणों का प्रदर्शन के लिए आवश्यक हैं. Hes1 चक्रीय जीन की एक bioluminescent संवाददाता विकसित और संक्षेप में एक माउस पी एस एम कोशिकाओं 19 में बताया गया है. औसत अवधि और विचरण दोलनों इन विट्रो में कई चक्र के लिए जारी रहती है, दिखा कि कोशिकाओं की एक छोटी संख्या के लिए गणना की गई. हालांकि, इन अध्ययनों मात्रात्मक कोशिकाओं अनायास दर्ज करें या बाहर निकलने के दोलनों सकता है या नहीं, थरथरानवाला आवृत्ति और आयाम की स्थिरता और मजबूती का पता नहीं था,और कैसे कोशिकाओं उनके चरण संबंध बनाए. इसके अतिरिक्त, सेल स्वायत्त घड़ी पर भ्रूण में पाया संकेतन अणुओं के प्रभाव सीधे परीक्षण नहीं किया गया. नतीजतन, एकल कोशिका थरथरानवाला के इन मौलिक गुण पूरी तरह से अनजान रहते हैं.
हमने हाल ही में her1 अभिव्यक्ति 30 की वीनस (YFP) प्रतिदीप्ति संवाददाताओं से ड्राइव करने के लिए बीएसी recombineering 20 का उपयोग ट्रांसजेनिक मछली लाइनों का विकास किया है. ऐसी लाइनों वे एम्बेडेड और अस्थायी गतिशीलता और her1 के स्थानिक पैटर्न पुनरावृत्ति कर रहे हैं जिसमें बरकरार गुणसूत्र लोकस की नियामक cues के शोषण. इस सफलता विवो में विकासशील zebrafish भ्रूण में जीन अभिव्यक्ति की वास्तविक समय की निगरानी के लिए अनुमति देता है. मौलिक सेल स्वायत्त दोलनों के गुण और कैसे इस तरह अभिव्यक्ति समय के साथ नियंत्रित किया जाता है का अध्ययन करने के लिए, हमने हाल ही में इन विट्रो में पी एस एम कोशिकाओं से अलग करने और रिकॉर्ड करने के लिए एक विश्वसनीय विधि विकसित की है. इस आद्यकर्नल हम हम एकल कक्षों में zebrafish विभाजन घड़ी की दोलनों चिह्नित कर सकते हैं, जहां से बिखरे सेल संस्कृतियों, उत्पन्न करने के लिए हमारे ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइनों का उपयोग किया कैसे करें. हम इस तरह बकाया स्थिर या ऊतक स्तर के विश्लेषण के साथ सुलभ नहीं थे कि क्षेत्र में सवाल है, साथ ही सीधे संकेतन अणुओं और inhibitors के साथ एकल कक्ष के स्तर पर विभाजन घड़ी में हेरफेर निपटने कर सकते हैं.
Protocol
1. विच्छेदन पहले
- विच्छेदन से पहले दिन में, ट्रांसजेनिक एलील के लिए विषमयुग्मजी zebrafish जोड़े का एक incross से भ्रूण प्राप्त करते हैं.
- 28 ओ सी में methylene नीले बिना E3 के माध्यम से भ्रूण उठाएँ ढाल मंच (6 घंटा बाद निषेचन) तक.
- 20 ओ सीओ / एन को methylene नीले बिना E3 के माध्यम से भ्रूण स्थानांतरण वे tailbud चरण तक पहुंचने के लिए एक बार 20 ओ सी में, भ्रूण घंटा प्रति 1 विखंड बनेगी. 20 ओ सी में 17-20 घंटा ओ / एन के बाद, भ्रूण विच्छेदन प्रोटोकॉल की शुरुआत में निम्नलिखित सुबह चरण 5 से 8 विखंड पर होना चाहिए.
- उपकरण और विच्छेदन के लिए आवश्यक अभिकर्मकों इकट्ठे.
- भ्रूण और ऊतक के हस्तांतरण के लिए आग पॉलिश ग्लास विंदुक
- भ्रूण से chorions को हटाने के लिए ठीक संदंश की जोड़ी
- विच्छेदन के लिए Sylgard लेपित 35 मिमी पकवान - एक 35 मिमी डिश में Sylgard बहुलक डालो और एक 37 डिग्री सेल्सियस में ओ / एन इलाज का उपयोग अच्छी तरह से विच्छेदन बनाओठीक बहुलक की एक छोटी मात्रा निकालने के लिए एक सुई टिप. डिश साफ किया और बाद में पुन: उपयोग किया जा सकता है.
- पी एस एम ऊतक हेरफेर के लिए बढ़ाई, चपटा टंगस्टन तार उपकरण
- संस्कृति के पी एस एम के वांछित टुकड़ों को काटने के लिए माइक्रो स्केलपेल
- Trypsin ऊष्मायन के लिए 35 मिमी प्लास्टिक पकवान
- 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त l15 मध्यम
- 0.25% trypsin / EDTA समाधान
- प्रसार के लिए Sigmacoted जेल लोडिंग युक्तियाँ
- Methylene नीले बिना E3 मध्यम युक्त प्लास्टिक पेट्री डिश.
- Fibronectin1 सब्सट्रेट (पीबीएस में 10 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ गिलास नीचे इमेजिंग पकवान कवर. विच्छेदन के दौरान कोट करने के लिए बेंच पर पकवान छोड़ दें.
- पहचानने के लिए उपयुक्त प्रतिदीप्ति फिल्टर और सॉर्ट सकारात्मक ट्रांसजेनिक भ्रूण (5 से 8 विखंड चरण) के साथ त्रिविमेक्ष का प्रयोग करें.
- प्रतिदीप्ति चैनल के तहत YFP अभिव्यक्ति के लिए presomitic mesoderm (पी एस एम) (चित्रा 1 ए) का परीक्षण करके ट्रांसजेनिक भ्रूण को पहचानें. प्रतिदीप्ति थानेदारuld tailbud को पिछले गठन विखंड से क्षेत्र में दिखाई दे सकता है. प्रतिभाशाली संकेत के साथ भ्रूण का चयन करें; वंश की 25% transgene की 2 प्रतियां ले जाने समयुग्मक भ्रूण होना चाहिए. जरूरत की पहचान की भ्रूण की संख्या प्रयोग के आधार पर भिन्न होता है. एक विच्छेदित tailbud टुकड़ा औसत पर, 1,000 कोशिकाओं निकलेगा. आमतौर पर, कुछ अतिरिक्त सकारात्मक भ्रूण मामले में त्रुटियों को विच्छेदन के दौरान बना रहे हैं उपयोगी होते हैं.
- संकेत से, विशेष रूप से जर्दी सेल में, किसी भी autofluorescence भेद करने के लिए एक स्थितीय संदर्भ के रूप में प्रेषित प्रकाश का प्रयोग करें.
- Methylene नीले बिना E3 के माध्यम से युक्त एक अलग प्लास्टिक पेट्री डिश के लिए सकारात्मक भ्रूण स्थानांतरण.
2. पी एस एम विच्छेदन और प्रसार
- विच्छेदन के लिए भ्रूण तैयार करें.
- एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे, ठीक संदंश का प्रयोग, ध्यान E3 के माध्यम से प्रत्येक भ्रूण से जरायु हटा दें. भ्रूण को नुकसान या जर्दी सेल को बाधित करने के लिए नहीं भूलें. भरें सीरम के साथ l15 के माध्यम से पकवान विदारक Sylgard लेपित. संदंश या किसी अन्य फ्लैट उपकरण का उपयोग, Sylgard की सतह से किसी भी हवाई बुलबुले को दूर.
- विच्छेदन पकवान को आग पॉलिश ग्लास विंदुक का उपयोग dechorionated भ्रूण स्थानांतरण.
- तार उपकरणों का उपयोग करना, विदारक डिश के एक तरफ करने के लिए सभी भ्रूण चाल है.
- एक भ्रूण से पी एस एम काटना.
- ओरिएंट अच्छी तरह विदारक पकवान (चित्रा 1 बी) के भीतर Sylgard परत में किए गए छोटे में अपने पार्श्व पक्ष पर एक एकल भ्रूण.
- भ्रूण और जर्दी सेल के माध्यम से माइक्रो स्केलपेल, टुकड़ा का उपयोग केवल पश्चमस्तिष्क के लिए और (लाल रेखा बिंदीदार चित्रा 1 बी) भ्रूण के उदर पोल के माध्यम से पूर्वकाल.
- पकवान की ओर करने के लिए इसे दूर चलती है, अच्छी तरह से भ्रूण के पूर्वकाल टुकड़ा निकालें, और फिर पी एस एम सहित पीछे अनुभाग से दूर शेष जर्दी सेल कणिकाओं परिमार्जन करने के लिए तार उपकरणों का उपयोग करें.
- जर्दी दूर scraped किया गया है, समतल और दूर प्रयोगकर्ता से इशारा करते हुए पूर्वकाल अंत के साथ पी एस एम और प्रयोगकर्ता (चित्रा 1C) की ओर इशारा करते हुए पीछे पूरबी.
- बाहरी झिल्ली की पतली परत इस बात से खींच लिया नहीं गया है, तो दूर पी एस एम ऊतक के ऊपर से यह छील करने के लिए तार उपकरणों का उपयोग करें.
- माइक्रो स्केलपेल का उपयोग दूर ऊतक (लाल रेखा बिंदीदार चित्रा 1C) के बाकी हिस्सों से tailbud, पृष्ठरज्जु के अंत अतीत पी एस एम के सबसे पीछे टिप, काटा. नोट: पी एस एम से ऊतक के अन्य टुकड़े, उदाहरण पूर्वकाल पी एस एम के लिए करीब पिछले गठन विखंड के लिए, यह भी प्रयोगात्मक प्रश्न पर निर्भर करता है, संस्कृति में लिया जा सकता है.
- दूर विदारक क्षेत्र से पकवान के एक कोने को tailbud टुकड़ा ले जाएँ. विदारक क्षेत्र से किसी भी मलबे और अवांछित भ्रूण ऊतक खाली करने के लिए तार उपकरणों का उपयोग करें.
- अगले भ्रूण से दोहराएँ.
- कई ई से पूल tailbud टुकड़ेmbryos, प्रयोग के लिए आवश्यक हो जाएगा कि कितने कोशिकाओं पर निर्भर करता है. औसत पर, tailbud ऊतक का एक टुकड़ा 1,000 कोशिकाओं पैदावार.
- Trypsin-EDTA की एक छोटी मात्रा के साथ खाली 35 मिमी प्लास्टिक पकवान भरें.
- आग पॉलिश ग्लास विंदुक का प्रयोग, trypsin / EDTA युक्त पकवान में पकवान विदारक से tailbud टुकड़े हस्तांतरण. आरटी पर 20 मिनट के लिए trypsin / EDTA में tailbud टुकड़े सेते हैं.
- ऊतक trypsin में incubated जा रहा है, गिलास तली इमेजिंग पकवान से Fibronectin1 समाधान निकालने.
- MilliQ पानी के साथ कांच से 3 बार समाधान धो लें. प्रत्येक धोने हटाने और पकवान पूरी तरह से सूखा है सुनिश्चित करने के लिए चूषण का प्रयोग करें.
- इमेजिंग के लिए मध्यम में tailbud टुकड़े फैलाने.
- इमेजिंग पकवान में सीरम के साथ l15 के माध्यम से 100 μl पिपेट.
- एक लेपित जेल टिप का उपयोग करना संभव के रूप में छोटे रूप में एक मात्रा में trypsin / EDTA से tailbud टुकड़े को हटा दें.
- में मध्यम में tailbud टुकड़े पिपेटइमेजिंग पकवान. उन्हें तोड़ने के अलावा और मध्यम में कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए ऊपर और नीचे कई बार टुकड़े पिपेट. हवा बुलबुले परिचय नहीं सावधान रहना होगा. खुर्दबीन के नीचे सेल clumps के लिए जाँच करें और जरूरत के रूप में और अधिक फैलाने.
- निलंबन में छितरी हुई कोशिकाओं आरटी पर 20 मिनट के लिए Fibronectin1 लेपित कांच पर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें.
- इमेजिंग की शुरुआत से पहले कोशिकाओं को सीरम के साथ अतिरिक्त l15 के माध्यम से एक छोटी मात्रा में जोड़ें. बस कोशिकाओं को बाधित करने के लिए नहीं की देखभाल का प्रयोग करें.
- प्रयोगात्मक सवाल को देखते हुए, संस्कृति को किसी भी पूरक या दवा उपचार जोड़ें.
बिखरे पी एस एम कोशिकाओं के 3. इमेजिंग
- समय चूक इमेजिंग खुर्दबीन पर तापमान कक्ष में इमेजिंग पकवान सेट करें. प्रयोग के लिए वांछित तापमान को वार्नर कक्ष सेट करें. डिश छवि अधिग्रहण शुरू होने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए संतुलित करने की अनुमति दें. यदि जरूरी हुआ तो बाहरी तापमान जांच के साथ जांचने के तापमान, डिश में रखा गया. नोट: कारणतापमान और somitogenesis दर 21 स्थिर तापमान नियंत्रण के बीच संबंध एक पी एस एम कोशिकाओं में अवधि की सटीक मापन के लिए आवश्यक है.
- समय जोखिम और लाभ शोर के स्तर को अच्छा संकेत सुनिश्चित करने के लिए संतृप्ति बिना तीव्रता का एक बड़ा गतिशील रेंज प्रदान करते हैं कि जाँच करने के लिए प्रतिदीप्ति चैनल में परीक्षण छवियों मोल. इस प्रोटोकॉल का उपयोग हमारी लाइनों से उत्पन्न छितरी हुई कोशिकाओं से अर्जित एक ठेठ प्रतिदीप्ति छवि 85 की एक EM लाभ परिचालन पर एक EMCCD कैमरे के साथ एक प्रेषित प्रकाश छवि के लिए 400 मिसे और 40 मिसे की आवश्यकता है. से इसके अलावा, पूर्व amp लाभ और readout गति कैमरा भी शोर पर संकेत अधिकतम करने के लिए आवश्यक हैं.
- प्रेषित प्रकाश चैनल का प्रयोग, समय चूक अधिग्रहण के लिए कोशिकाओं के क्षेत्रों का चयन करें.
- समय के वांछित लंबाई के लिए समय चूक अधिग्रहण प्रोटोकॉल चलाएँ.
- एक प्रेषित प्रकाश और क्षेत्र के प्रति एक प्रतिदीप्ति छवि मोल. नोट: अधिग्रहण आरओ के बीच एक अंतराल सेटकोशिकाओं में विस्तारित इमेजिंग या उत्प्रेरण विषाक्तता अधिक तस्वीर विरंजन बिना अस्थायी गतिशीलता पर कब्जा करेगा कि unds. इस प्रोटोकॉल एक 2 मिनट के अंतराल का उपयोग करता है.
- कोशिकाओं, कोई सॉफ्टवेयर या हार्डवेयर त्रुटियों, आदि को ध्यान में रहना सुनिश्चित करना है कि रिकॉर्डिंग के दौरान कभी - कभी समय चूक सेट अप की जाँच करें
एक्वायर्ड समय चूक फिल्मों की 4. छवि प्रसंस्करण
- ओपन फिल्म एक इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में एक अधिग्रहीत क्षेत्र के लिए फ़ाइल. नोट: फिजी में इस प्रोटोकॉल में सभी प्रसंस्करण के लिए इस्तेमाल किया गया था.
- स्प्लिट छवियों के 2 के ढेर को बनाने के लिए एक क्षेत्र से प्रकाश और प्रतिदीप्ति फ्रेम प्रेषित.
- प्रेषित प्रकाश चैनल में एक एकल कोशिका हुए.
- प्रेषित प्रकाश चैनल में पहला फ्रेम में चयनित कक्ष के चारों ओर एक परिपत्र रॉय (ब्याज के क्षेत्र) रखें. . नोट: 1. रिकॉर्डिंग के अंत में स्वस्थ हैं कि केवल कोशिकाओं, 2 क्षेत्र के बाहर कदम नहीं है, और 3 अन्य CE के साथ संपर्क में नहीं आते हैं.LLS ट्रैक किए गए हैं.
- एक रॉय आरओआई प्रबंधक को हर कुछ तख्ते को बचाने. अंतिम फ्रेम तक सेल हुए.
- प्रतिदीप्ति चैनल पर बचाया ROIs का उपयोग तीव्रता को मापने.
- प्रतिदीप्ति ढेर चुने और बचाया ROIs के साथ, समय पर नज़र रखी सेल की तीव्रता को मापने के लिए कस्टम चक्र क्षेपक प्लग में और मैक्रो का उपयोग करें.
- मैक्रो से उत्पादन का पता लगाने की जाँच करें. ट्रेस गुणात्मक प्रतिदीप्ति समय चूक की सुविधाओं कब्जा है, एक एक्सेल वर्कशीट के लिए मूल्यों का निर्यात.
- सेल के लिए आरओआई सूची को बचाने के.
- प्रेषित चैनल में ट्रैकिंग और क्षेत्र में अन्य कोशिकाओं के लिए प्रतिदीप्ति चैनल में मापने दोहराएँ.
- प्रयोग से अतिरिक्त क्षेत्रों के लिए सभी चरणों को दोहराएँ.
Representative Results
इस प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति संकेत के समय चूक इमेजिंग (चित्रा 2) के लिए व्यवहार्य, छितरी हुई है, एक पी एस एम कोशिकाओं की संस्कृतियों पैदा करता है. हमारे transgene जिसका चक्र उत्पादन और गिरावट के आधे घंटे के आदेश पर भ्रूण में अंतर्जात जीन और प्रोटीन, के लिए इसी तरह की गतिशीलता के साथ होता है एक पत्रकार उत्पन्न करता है. इसकी वजह से तेजी से कारोबार करने के लिए, एकल कक्षों में YFP संकेत विरंजन कम करने के लिए जल्दी से पता चला है और प्रत्येक oscillatory चक्र की सुविधाओं पर कब्जा करने के लिए एक उच्च अस्थायी समाधान के साथ किया जाना चाहिए. इसके अलावा, संकेत के सापेक्ष मंदता दिया, संस्कृति और अधिग्रहण की स्थिति को ध्यान से संवेदनशील और मजबूत परिणाम सुनिश्चित करने के लिए देखते हैं. . गिलास नीचे संस्कृति बर्तन कोटिंग के लिए इस्तेमाल किया 1 एक ईसीएम सब्सट्रेट: हम इमेजिंग के लिए इष्टतम पी एस एम सेल संस्कृतियों पैदा करने में महत्वपूर्ण होने के लिए निम्नलिखित कारकों पाया है. 2. विच्छेदन और इमेजिंग मध्यम के लिए सीरम के अलावा. संभोग HETE के बाद लिया पहचान भ्रूण से पी एस एम के 3. विच्छेदनजिसका वंश संभावित transgene की 2 प्रतियां ले rozygous जोड़े. प्रतिदीप्ति संकेत के कुशल पर कब्जा सुनिश्चित करने के लिए एक उच्च NA उद्देश्य का उपयोग कर एक इष्टतम बढ़ाई सीमा के भीतर 4. छवि अधिग्रहण,. 5. पृष्ठभूमि शोर में योगदान कर सकता है कि उतार चढ़ाव तीव्रता को कम करने के लिए एक ठोस राज्य प्रकाश स्रोत के साथ रोशनी. 6. एक बेहद संवेदनशील ईएम सीसीडी कैमरा के साथ संकेत का पता लगाने संकेत readout को अधिकतम करने के लिए.
उप इष्टतम संस्कृतियों रिकॉर्डिंग के दौरान गोल और स्वस्थ रहना नहीं है कि कोशिकाओं में शामिल होंगे. हम हमारे ईसीएम सब्सट्रेट, zebrafish fibronectin1 का एक टुकड़ा पाली lysine या laminin जैसे अन्य आमतौर पर इस्तेमाल किया substrates की तुलना में, एक undifferentiated पी एस एम की तरह राज्य में कोशिकाओं रहता धारणा है कि. हम परीक्षण अन्य substrates कोशिकाओं रिकॉर्डिंग के पाठ्यक्रम पर कांच और oscillating फ्लोरोसेंट संकेत के नुकसान पर समतल करने का कारण बना. हम यह भी पाया कि विच्छेदन के दौरान मध्यम करने के लिए सीरम के अलावा, प्रसार,और रिकॉर्डिंग न केवल हदबंदी के लिए इस्तेमाल किया trypsin बुझाने के लिए महत्वपूर्ण था, लेकिन यह भी कारण सुधार सेल व्यवहार्यता की संभावना पृष्ठभूमि पर प्रतिदीप्ति तीव्रता, वृद्धि हुई है. एकल कक्षों से इष्टतम संकेत पर कब्जा सुनिश्चित करने के लिए हम एक उच्च एनए के साथ विशेष रूप से प्रतिदीप्ति इमेजिंग (जीस योजना NeoFluor श्रृंखला) के लिए बनाया गया एक 40x उद्देश्य का इस्तेमाल किया. हम भी एक ठोस राज्य प्रकाश स्रोत शोर छवियों के लिए योगदान है कि पृष्ठभूमि के उतार चढ़ाव को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है जो पारंपरिक पारा लैंप, की तुलना में अधिक स्थिर रोशनी प्रदान की है. इन संशोधनों मजबूत परिणाम सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं.
इस प्रोटोकॉल का उपयोग हम उम्मीद करते हैं कि किसी दिए गए क्षेत्र में कोशिकाओं के बहुमत रिकॉर्डिंग के दौरान कुछ बिंदु पर फ्लोरोसेंट रहे हैं जिसमें संस्कृतियों. हम फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को आमतौर पर रिकॉर्डिंग के दौरान कभी कभी काफी चलता - फिरता गोल रहते हैं और कर रहे हैं. फ्लोरोसेंट कोशिकाओं सहित कुछ कोशिकाओं, रिकॉर्डिंग के दौरान apoptotic बन सकता है. इन कोशिकाओं को किसी भी एक से बाहर रखा गया हैnalysis. हम भी अन्य कोशिकाओं के साथ संपर्क में आते हैं कि कोशिकाओं को बाहर या देखने के क्षेत्र के बाहर ले जाएँ. प्रेषित प्रकाश चैनल में स्वस्थ कोशिकाओं की संख्या की गणना के द्वारा मापा औसत पर, हम 10 घंटे की रिकॉर्डिंग के अंत तक क्षेत्र प्रति सेल संख्या में 12% की कमी देखते हैं. इस नुकसान कोशिका मृत्यु और क्षेत्र से बाहर चले गए हैं कि कोशिकाओं दोनों शामिल हैं. इन निरंतर देखते हुए हम, औसत पर, आम तौर पर 5 ट्रैक फ्लोरोसेंट व्यवहार्य और दृश्य रहना कि क्षेत्र प्रति कोशिकाओं, और शर्त के अनुसार 6 क्षेत्रों रिकॉर्ड कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, 4 की स्थिति के साथ एक प्रयोग 24 कुल खेतों आमतौर पर हालत के बारे में प्रति 30 नज़र रखी कोशिकाओं का अधिग्रहण किया और होगा. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त l15 के माध्यम से मानक इमेजिंग शर्तों के तहत, हम पी एस एम कोशिकाओं (4 प्रयोगात्मक replicates से n = 101 कोशिकाओं) 3 ± 1 चोटियों (2 का मतलब है और मानक विचलन के साथ, 2 और 7 चोटियों के बीच उत्पादन कर सकते हैं कि लगता है -3 चक्र). मंझला शिखर संख्या है, साथ ही 25% प्रतिशतक, 2 चोटियों और 75% प्रतिशतक मैं है3 चोटियों है. हमारे अर्द्ध स्वचालित ट्रैकिंग और विश्लेषण का उपयोग करना, हम जल्दी से चित्रा -2 में दिखाया गया एक प्रतिनिधि सेल का पता लगाने के साथ, व्यक्ति पी एस एम कोशिकाओं के लिए समय निशान के ऊपर प्रतिदीप्ति तीव्रता उत्पन्न कर सकते हैं. इन कच्चे निशान तो ऐसे आवृत्ति, आयाम, चक्रों की संख्या, और चोटियों के समय के रूप में oscillating पी एस एम कोशिकाओं के गुणों की मात्रात्मक माप बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
~ 5 विखंड चरण में YFP प्रतिदीप्ति व्यक्त ट्रांसजेनिक zebrafish भ्रूण की उनके विच्छेदन के ट्रांसजेनिक भ्रूण और schematics के चित्रा 1. पहचान. (ए) पार्श्व दृश्य. छवि प्रेषित प्रकाश और प्रतिदीप्ति चैनल का ओवरले है. तीर एल की ओर, पी एस एम के दौरान, tailbud की नोक पर शुरू संकेत के क्षेत्रों का संकेत AST विखंड का गठन. इनसेट इसके विकास पर और इन विवो व्यवहार में अधिक जानकारी के लिए Soroldoni एट अल. 30 को देखें. पहले विच्छेदन के दौरान कटौती करने से पहले भ्रूण के पार्श्व दृश्य (बी) योजनाबद्ध. बिंदीदार लाल रेखा पहली कट इंगित करता है (संवाददाता transgene की एक योजनाबद्ध दिखाता है बस tailbud जर्दी granules और इसके पूर्वकाल पीछे अक्ष के साथ उन्मुख epidermal परत, को निकालने के बाद चपटा पी एस एम के. (सी) योजनाबद्ध दृश्य के पीछे की जर्दी सेल. बिंदीदार लाल रेखा टिप दूर करने के लिए दूसरी कट इंगित करता है, हालांकि पश्चमस्तिष्क भर में बनाया प्रसार और संस्कृति के लिए tailbud की. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
07fig2.jpg "/>
चित्रा 2. एक छितरी पी एस एम संस्कृति में एक एकल कोशिका से प्रतिनिधि छवियों और निशान. (ए) असेंबल की एक 6 घंटे समय चूक रिकॉर्डिंग में एक भी पी एस एम सेल के प्रकाश छवियों संचारित. सेल रिकॉर्डिंग के दौरान पूरे गोल और स्वस्थ रहता है ध्यान दें. (बी) एक एकल पी एस एम सेल से प्रतिदीप्ति छवियों के असेंबल इसी. सेल की तीव्रता में चोटियों रिकॉर्डिंग के पाठ्यक्रम पर गिने जा रहे हैं. इस सेल पर रखा एक रॉय से मापा समय के साथ (सी) औसत तीव्रता. मान फिजी में लिखा चक्र क्षेपक प्लग में और कस्टम मैक्रो का उपयोग कर 2 मिनट प्रति एक के एक फ्रेम दर के साथ एक फिल्म से हर फ्रेम से ले रहे हैं. तीव्रता में चोटियों फिर ट्रेस भर में गिने जा रहे हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Discussion
भ्रूण के विकास के पाठ्यक्रम पर जगह लेता है कि एक सेलुलर प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए, जीव आमतौर पर पूरे भ्रूण के संदर्भ में एक दृष्टिकोण का उपयोग. हालांकि, पूरी तरह से एक एकल कोशिका एक विकासात्मक समय सीमा के भीतर कैसे बर्ताव को समझने के लिए, की जांच करने और अलगाव में व्यक्ति की कोशिकाओं उपद्रव करने के लिए एक विधि भी बेहद फायदेमंद है. ट्रांसजेनिक zebrafish भ्रूण का उपयोग छितरी पी एस एम सेल संस्कृतियों पैदा करके हम अब सीधे एक मात्रात्मक रास्ते में विभाजन घड़ी में आनुवंशिक दोलनों की सेल स्वायत्त प्रकृति का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण है. यह स्थितियों की एक किस्म के तहत कोशिकाओं के सैकड़ों की संख्या में हमारे फ्लोरोसेंट रिपोर्टर में दोलनों की गतिशीलता को मापने के लिए संभव है.
संस्कृति में एकल कक्षों का मनाया अवधि बरकरार भ्रूण में somitogenesis अवधि से अधिक समय है. हम संस्कृति में एक अक्षुण्ण पी एस एम explant भी था, सुझाव बरकरार भ्रूण (नहीं दिखाया डेटा) की तुलना में धीमी दोलनों कि प्रदर्शन का निरीक्षणटी अलग कक्षों में मनाया लंबी अवधि के प्रसार से नुकसान के लिए बस की वजह से नहीं है. एक चर अवधि और आयाम हमारी एकल कोशिका समय श्रृंखला के अधिकांश में मनाया जाता है. इस परिवर्तनशीलता के स्रोत अज्ञात है, लेकिन विभाजन घड़ी की गति बनाने सर्किट के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रकट करना चाहिए.
इस विधि के साथ हम पूरे भ्रूण में जांच करने के लिए चुनौती दे रहे हैं कि आनुवंशिक सेलुलर स्तर पर विभाजन का घटक है, और पते के प्रश्नों का अध्ययन कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, हमारे संस्कृतियों के लिए विकासशील भ्रूण में पाए ज्ञात संकेतन अणुओं की नियंत्रित अलावा द्वारा, हम एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परख में एकल पी एस एम सेलुलर थरथरानवाला पर उनके प्रभाव की जांच कर सकते हैं. हमारे पी एस एम संस्कृति प्रणाली इन दोलनों रोकना क्या कारकों, अकेले, कारक, या संयोजन में इन कोशिकाओं में दोलनों को बढ़ावा देने का क्या एक कठोर मूल्यांकन के लिए दरवाजे खोलता है, और इस तरह के अणुओं के बीच परस्पर क्रिया का परीक्षण करने के लिए. हाथ में इन उपकरणों के साथ, हम करने के लिए लक्ष्यपूरे भ्रूण में परीक्षण किया जा सकता है कि भविष्यवाणियों उत्पन्न करने के लिए एकल कक्षों में प्रकाशित ऊतक स्तर के डेटा, साथ ही उपयोग परिणामों पर आधारित हैं कि somitogenesis के मौजूदा मॉडलों का मूल्यांकन.
हमारे ज्ञान करने के लिए, इस एकल कक्षों में प्रतिदीप्ति की तीव्र समय चूक रिकॉर्डिंग के लिए पहली zebrafish प्राथमिक सेल संस्कृति प्रोटोकॉल है; इस प्रोटोकॉल के आगे विकास और शोधन संभव इसमें कोई संदेह नहीं है. अन्य प्रोटोकॉल अक्सर पत्रकारों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट और दीर्घकालिक इमेजिंग 27-29 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि स्थिर सेल लाइनों उत्पन्न करने के लिए zebrafish भ्रूण का उपयोग करें. स्थिर लाइनों ऐसे circadian घड़ी के रूप में विकास के समय, से बंधा नहीं है कि एक प्रक्रिया इमेजिंग के लिए उपयोगी होते कोशिकाओं जबकि उनके oscillatory, पूर्वज राज्य में अभी भी कर रहे हैं, जबकि भ्रूण विभाजन का प्रश्न तत्काल इमेजिंग जरूरी है. कोशिकाओं oscillating रोक लेते हैं, वे ऊतक में, एक विखंड में शामिल किया जाएगा जब एक विभेदित सेल भाग्य मान, और. यह पो हैसही कारक या इन विट्रो में मौजूद कारकों के साथ हम काफी लंबे समय अवधि टिप्पणियों, एकाधिक अनुक्रमिक perturbations, या उच्च throughput प्रदर्शन को सक्षम करने, oscillatory रहेगा पी एस एम की तरह zebrafish सेल संस्कृति लाइनों उत्पन्न कर सकता है कि ssible.
हम समय चूक इमेजिंग के लिए छितरी कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृतियों की तैयारी की इस विधि स्थिर zebrafish सेल लाइनों का उपयोग पंहुचा नहीं है कि एक विकासात्मक समय सीमा के भीतर होता है कि किसी भी सेलुलर प्रक्रिया के अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है कि उम्मीद है. विच्छेदन के माध्यम से या FACS के माध्यम से या तो उपयुक्त ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइनों से अलग विकास के चरणों में अलग सेल प्रकार के अलगाव भ्रूण हदबंदी के बाद, शुरू करने की कोशिकाओं को दे सकती है. कोशिकाओं के भ्रूण मूल द्वारा निर्देशित संस्कृति की स्थिति, के कुछ अनुकूलन, आवश्यक हो सकता है. ट्रांसजेनिक zebrafish की तेजी से बढ़ती संग्रह के साथ यह लचीला और संवेदनशील प्रोटोकॉल के संयोजन सेलाइनों, हम शास्त्रीय आनुवंशिक और embryological तरीकों के लिए पूरक है कि इन विट्रो विकास जीव विज्ञान दृष्टिकोण की सुविधा की उम्मीद है.
Disclosures
लेखक योगदान:
ABW विकसित और प्रसार, संस्कृति, इमेजिंग, और सेल ट्रैकिंग प्रोटोकॉल परिष्कृत. डी एस ट्रांसजेनिक लाइनों उत्पन्न करने और इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के डिजाइन का निरीक्षण किया. एओ अलग कर देना करने के लिए प्रारंभिक सबूत के सिद्धांत प्रयोगों का बीड़ा उठाया और संस्कृति में छवि पी एस एम कोशिकाओं. जेएस समय चूक फिल्मों से प्रतिदीप्ति तीव्रता मापने के लिए इस्तेमाल फिजी में सर्कल क्षेपक प्लगइन उपकरण लिखा था. ABW और ACO पांडुलिपि लिखा था.
Acknowledgments
यह काम एक EMBO दीर्घकालिक फैलोशिप (ABW) द्वारा समर्थित किया गया था, एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन इंटरनेशनल Postdoctoral रिसर्च फैलोशिप (ABW), मैक्स प्लैंक गेसेलशाफ्ट (ABW, डी एस, जे एस, ACO), एक खोदता-बी बी फैलोशिप (एओ), और (ACO डी एस,) यूरोपीय समुदाय सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम STG-207634 के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद. हम पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणी के लिए रवि देसाई धन्यवाद. हम भी zebrafish Fibronectin1 टुकड़ा, देखभाल और हमारे मछली लाइनों और इमेजिंग समर्थन के लिए MPI-सीबीजी प्रकाश माइक्रोस्कोपी सुविधा के रखरखाव के लिए MPI-सीबीजी मछली सुविधा स्टाफ के उत्पादन के लिए MPI-सीबीजी प्रोटीन अभिव्यक्ति सुविधा को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epifluorescence microscope | Olympus | Model: SZX16 | |
| Epifluorescence microscope | X-cite Illumination | Series: 120Q | |
| Dissection microscope | Olympus | Model: SZX12 | |
| Fine forceps no. 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Glass transfer pipettes | Assistent | 567/2 | |
| 35 mm plastic petri dishes | Greiner | 627102 | |
| 60 mm plastic petri dishes | Greiner | 628102 | |
| Sylgard polymer | SASCO | 266727 | |
| Manipulation tools | Made in-house | For description of manipulation tools Ref. 22 | |
| Microsurgical knife | World Precision Instruments | 500249 | |
| L15 medium | Invitrogen | 57322 | |
| Penicillin/streptomyocin | PAA | P11-010 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 257322 | |
| 0.05% trypsin / 0.02% EDTA | PAA | L11-004 | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 253188 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | 254589 | |
| Micropipette set | Gilson International | F167300 | |
| Zebrafish Fibronectin1 70 kD fragment | MPI-CBG protein facility | Generated in-house from construct based on previously published work Ref. 23-25 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek (single well) | P35G-1.5-14-C | |
| Glass bottom imaging dishes | Greiner (CellView -multi-well) | 262502 | |
| E3 medium without methylene blue | Made in-house | From The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 | |
| Plastic transfer pipettes | Ratiolab | 260011 | |
| Warner heating/cooling chamber | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
| EM-CCD camera | Andor | Model: iXOn 888 | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Zeiss | Model: Axiovert 200M | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | NeoFluor 40x, NA 0.75 | ||
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Lumencor Light Engine | Model: Spectra X | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | BrightLine HC 575/15 | F39-575 |
References
- Cooke, J., Zeeman, E. C. A clock and wavefront model for control of the number of repeated structures during animal morphogenesis. J Theor Biol. 58, 455-476 (1976).
- Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock. Development. 139, 625-639 (2012).
- Dequeant, M. L., Pourquie, O. Segmental patterning of the vertebrate embryonic axis. Nat Rev Genet. 9, 370-382 (2008).
- Oates, A. C., Gorfinkiel, N., Gonzalez-Gaitan, M., Heisenberg, C. P.
- Oates, A. C., Ho, R. K. Hairy/E(spl)-related (Her) genes are central components of the segmentation oscillator and display redundancy with the Delta/Notch signaling pathway in the formation of anterior segmental boundaries in the zebrafish. Development. 129, 2929-2946 (2002).
- Lewis, J. Autoinhibition with transcriptional delay: a simple mechanism for the zebrafish somitogenesis oscillator. Curr Biol. 13, 1398-1408 (2003).
- Schroter, C., Oates, A. C. Segment Number and Axial Identity in a Segmentation Clock Period Mutant. Curr Biol. 20, 1254-1258 (2010).
- Riedel-Kruse, I. H., Muller, C., Oates, A. C. Synchrony dynamics during initiation, failure, and rescue of the segmentation clock. Science. 317, 1911-1915 (2007).
- Ozbudak, E. M., Lewis, J. Notch signalling synchronizes the zebrafish segmentation clock but is not needed to create somite boundaries. PLoS Genet. 4, e15 (2008).
- Herrgen, L., et al. Intercellular Coupling Regulates the Period of the Segmentation Clock. Curr Biol. 20, 1244-1253 (2010).
- Sawada, A., et al. Fgf/MAPK signalling is a crucial positional cue in somite boundary formation. Development. 128, 4873-4880 (2001).
- Giudicelli, F., Ozbudak, E. M., Wright, G. J., Lewis, J. Setting the tempo in development: an investigation of the zebrafish somite clock mechanism. PLoS Biol. 5, e150 (2007).
- Herrgen, L., Schroter, C., Bajard, L., Oates, A. C. Multiple embryo time-lapse imaging of zebrafish development. Methods Mol Biol. 546, 243-254 (2009).
- Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquie, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int J Dev Biol. 49, 309-315 (2005).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R.
- Welsh, D. K., Imaizumi, T., Kay, S. A. Real-time reporting of circadian-regulated gene expression by luciferase imaging in plants and mammalian cells. Methods Enzymol. 393, 269-288 (2005).
- Soroldoni, D., Oates, A. C. Live transgenic reporters of the vertebrate embryo's Segmentation Clock. Curr Opin Genet Dev. 21, 600-605 (2011).
- Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Soroldoni, D., Hogan, B. M., Oates, A. C. Simple and efficient transgenesis with meganuclease constructs in zebrafish. Methods in molecular biology. 546, 117-130 (2009).
- Schroter, C., et al.
- Picker, A., Roellig, D., Pourquie, O., Oates, A. C., Brand, M.
- Mould, A. P., et al. Identification of multiple integrin beta1 homologs in zebrafish (Danio rerio). BMC Cell Biol. 7, 24 (2006).
- Mould, A. P., Koper, E. J., Byron, A., Zahn, G., Humphries, M. J. Mapping the ligand-binding pocket of integrin alpha5beta1 using a gain-of-function approach. Biochem J. 424, 179-189 (2009).
- Zhao, Q., Liu, X., Collodi, P. Identification and characterization of a novel fibronectin in zebrafish. Exp Cell Res. 268, 211-219 (2001).
- Westerfield, M. In The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Vallone, D., Santoriello, C., Gondi, S. B., Foulkes, N. S. Basic protocols for zebrafish cell lines: maintenance and transfection. Methods Mol Biol. 362, 429-441 (2007).
- Carr, A. J., Whitmore, D. Imaging of single light-responsive clock cells reveals fluctuating free-running periods. Nat Cell Biol. 7, 319-321 (2005).
- Whitmore, D., Foulkes, N. S., Sassone-Corsi, P. Light acts directly on organs and cells in culture to set the vertebrate circadian clock. Nature. 404, 87-91 (2000).
- Soroldoni, D., et al. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, DOI. 222-225 (1126).
