Summary

La especificación de telencefálicas neuronas glutamatérgicas a partir de células madre pluripotentes

Published: April 14, 2013
doi:

Summary

Este procedimiento produce neuronas telencefálicas pasando a través de los puntos de control que son similares a los observados durante el desarrollo humano. Las células se dejan a diferenciarse espontáneamente, están expuestas a factores que los empujan hacia el linaje neural, están aislados, y se sembraron sobre cubreobjetos para permitir la diferenciación terminal y la maduración.

Abstract

Aquí, un procedimiento por etapas para generar eficientemente telencefálicas neuronas glutamatérgicas a partir de células madre pluripotentes (PSC) se ha descrito. El proceso de diferenciación se inicia rompiendo las PSCs humanos en terrones que redondear hacia arriba hasta formar agregados cuando las células se colocan en un cultivo en suspensión. Los agregados se hacen crecer entonces en un medio de hESC 1-4 días para permitir la diferenciación espontánea. Durante este tiempo, las células tienen la capacidad de convertirse en cualquiera de las tres capas germinales. De día 5-8, las células se colocan en un medio de inducción neural para empujarlos en el linaje neural. Alrededor de 8 días, las células se dejan adherir a placas de 6 pocillos y se diferencian durante el cual la forma células neuroepiteliales. Estas células neuroepiteliales se puede aislar a día 17. Las células entonces se puede mantener como neuroesferas hasta que estén listos para ser chapada en cubreobjetos. El uso de un medio básico sin ningún factor de caudalizing, células neuroepiteliales son specified en los precursores telencefálicas, que luego pueden diferenciarse también en dorsal progenitores telencefálicas y neuronas glutamatérgicas eficiente. En general, nuestro sistema proporciona una herramienta para generar neuronas glutamatérgicas humanos para los investigadores para estudiar el desarrollo de estas neuronas y las enfermedades que les afectan.

Introduction

Las células madre pluripotentes (PSC), incluyendo tanto las células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (iPS), tienen la capacidad de generar cualquier tipo de célula en el cuerpo, incluyendo las neuronas 1-3. Diferenciación dirigida de diversos subtipos neuronales de los CRP humanos es la clave para la aplicación de estas células en la medicina regenerativa. La generación de funcionales subtipos neuronales durante el desarrollo es un proceso complejo que implica la inducción de linaje neuronal, la especificación de los progenitores regionales a lo largo del eje rostro-caudal, y la diferenciación de tipos de neuronas post-mitóticas de los progenitores 4,5 regionales. A partir de 2001, varios sistemas se han establecido para generar linaje neural de hESCs, que han proporcionado una plataforma para la posterior generación de subtipos neuronales 6,7. Sobre la base de los principios de desarrollo, varios tipos de neuronas, como las neuronas espinales motor 8-12, mesencéfalo dopneuronas aminérgicos 13-15, y células de la retina neural 16,17 se han especificado de manera eficiente PSCs humanas. Esto se realizó mediante la aplicación de morfógenos críticos que son importantes para la especificación de estos tipos de neuronas durante el desarrollo in vivo. Otros protocolos también se han desarrollado para promover la diferenciación de hESCs en neuronas usando cualquiera de los factores adicionales 18-20, tales como pequeñas moléculas o mediante el cultivo conjunto con otros tipos de células para ayudar a promover la diferenciación 21.

El neocórtex humano está muy desarrollado y contiene muchos tipos de células, incluidas las neuronas glutamatérgicas que desempeñan un papel importante en el aprendizaje, la memoria y la función cognitiva 22,23. El primer paso en la generación de neuronas glutamatérgicas en cultivo es para especificar células progenitoras telencefálicas. Yoshiki Sasai del grupo por primera vez la diferenciación dirigida de precursores telencefálicas de ratón CES (mESCs) utilizando una suspensio libre de sueron cultivo en presencia de DKK1 (que inhibe la señalización de Wnt), así como LeftyA (que inhibe la señalización nodal) 24. Posteriormente, varios grupos incluyendo el nuestro también han informado de la especificación de precursores telencefálicas de PSCs humanos en suero libre de mediano 25-27. La generación de los precursores de los CRP humanos telencefálicas no requiere el uso de morfógenos exógenas y la eficiencia en la generación de estos precursores es mucho mayor que la de mESCs 26,27. Aquí, un sistema químicamente definido para la inducción neural que estaba bien establecida por el grupo de Zhang 7 se ha descrito. Sin la adición de factores exógenos caudalizing, este protocolo eficiente genera precursores telencefálicas de PSCs humanos 27. Estos progenitores entonces se pueden diferenciar en progenitores dorsal o ventral mediante la regulación de la señalización de Wnt y sonic hedgehog (SHH). Las células progenitoras más dorsales pueden diferenciarse en neuronas e glutamatérgicafficiently 27. Además, este protocolo también funciona bien para la generación de neuronas glutamatérgicas de humano iPSCs 28, que permite la generación de pacientes específicos de neuronas que se pueden utilizar para estudiar el mecanismo de acción, así como terapias potenciales para una gran variedad de enfermedades . Por otra parte, nuestro sistema también proporciona una plataforma para explorar el desarrollo y la especificación de los diversos tipos neuronales en el telencéfalo.

Protocol

1. Generación de agregados humanos de células madre pluripotentes (D1-D4) Las células madre pluripotentes se cultivan en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) alimentadores en presencia de medio suplementado con hESC factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, 4 ng / ml). Después de 5-7 días en cultivo, cuando las colonias son grandes, pero todavía no diferenciado, que están listos para el siguiente paso. La primera solución enzimática debe estar preparado. En un tubo de 50 ml,…

Representative Results

Aquí, un protocolo para diferenciar los CRP humanos en telencefálicas neuronas glutamatérgicas a través de varios pasos críticos: la formación de agregados PSC, la inducción de células neuroepiteliales, la generación de los progenitores telencefálicas, y la diferenciación terminal de estos progenitores en neuronas telencefálicas (Figura 1) tiene han descrito. Este sistema es robusto y eficiente en la generación de los progenitores y neuronas glutamatérgicas telencefálicas. Como un ejemplo…

Discussion

Hay varios pasos críticos durante el proceso de diferenciación neural. Es importante asegurarse de que los PSCs humanas son pluripotentes, porque de lo contrario las células que ya pueden estar sesgados hacia convertirse en un linaje no neuronal. Esto se puede confirmar mediante tinción de las PSCs humanos con anticuerpos contra marcadores de pluripotencia, tales como Oct4, Sox2, Nanog, y 1-3 Tra-1-60. Si los CPs humanos no se adhieren muy bien después de pases ellos, inhibidor de ROCK (Y27632) se puede …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer al Dr. Y. Sasai para ofrecer generosamente el anticuerpo FOXG1. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de Connecticut de células madre (08-SCB-UCHC- 022 y 11 SCB24-) y la Fundación Paraplejia espástica.

Materials

Reagent Supplier Catalog #
Dulbecco’s modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) Gibco 11330-032
Knockout Serum Replacer Gibco 10828-028
L-glutamine (200 mM) Gibco 25030
Non Essential Amino Acids Gibco 1140-050
2-Mercaptoethanol (14.3 M) Sigma M-7522
Neurobasal medium Gibco 21103-049
N2 Gibco 17502-048
B27 Gibco 12587-010
Heparin Sigma H3149
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine) Sigma 116K5103
Laminin (human) Sigma L-6274
Laminin (mouse) Invitrogen 23017-015
FBS Gemini 100-106
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A-7906
Dispase Gibco 17105-041
Collagenase Invitrogen 17104-019
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
ROCK Inhibitor Stemgent 04-0012
SB431542 Stemgent 04-0010
Dorsomorphin Stemgent 04-0024
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) Invitrogen 13256-029
Trypsin inhibitor Gibco 17075
0.1% gelatin Millipore ES-006-B
Foxg1 antibody Dr. Y. Sasai  
Hoxb4 antibody (1:50) Developmental Studies Hybridoma Bank I12
Pax6 antibody (1:5000) Developmental Studies Hybridoma Bank PAX6
Nkx2.1 antibody (1:200) Chemicon MAB5460
Tbr1 antibody (1:2000) Chemicon AB9616
vGLUT1 antibody (1:100) Synaptic Systems 135302
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) PrepoTech Inc. 450-02
Glial derived neurotrophic factor (GDNF) PrepoTech Inc. 450-10
Insulin growth factor 1 (IGF1) PrepoTech Inc. 100-11
Cyclic AMP (cAMP) Sigma D-0260
Sonic hedgehog (SHH) R&D 1845-SH
50 ml tubes Becton Dickinson (BD) 352098
15 ml tubes BD 352097
6 well plates BD 353046
24 well plates BD 353047
T25 flasks (untreated) BD 353009
T75 flasks (untreated) BD 353133
Coverslips Chemiglass Life Sciences 1760-012
6 cm Petri dishes BD 353004
9” glass pipetes Fisher 13-678-20D
Steriflip filters (0.22 μM) Millipore SCGP00525
Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM) Millipore SCGPU10RE
Phase contrast microscope (Observer A1) Zeiss R2625
Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150) Thermo Electron Corporation  
Biosafety hood (Sterilgard III Advance) The Baker Company  
Centrifuge (5702 R) Eppendorf  

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Cite This Article
Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (74), e50321, doi:10.3791/50321 (2013).

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