Summary
Bu işlem insan gelişimi sırasında gözlenen benzemektedir kontrol noktaları geçerek telencephalic nöronlar verir. Hücreler, kendiliğinden ayırt etmek için izin nöral soy doğru itip faktörlere maruz kalabilir, izole edilir, ve terminal farklılaşma ve olgunlaşma için izin lamelleri üzerine kaplanır.
Abstract
Burada, etkili bir şekilde insan pluripotent kök hücreleri (PSC'ler) dan telencephalic glutamaterjik nöronlar üretmek için bir aşamalı prosedürü tarif edilmiştir. Farklılaştırma prosesi hücreler bir süspansiyon kültürü içinde yerleştirilmiş iken agregatlar oluşturması için yuvarlak kümeleri haline insan PSC'ler kırılma tarafından başlatılır. Agregalar sonra spontan farklılaşma sağlamak için günde 1-4 hESC ortamda yetiştirilen. Bu süre boyunca, hücreler üç germ tabakasından herhangi haline kapasitesine sahiptir. Günde 5-8, hücrelerin nöral soy içine itmek için bir nöral indüksiyon ortamı olarak yerleştirilir. Günde 8 civarında, hücreler 6 kuyucuğu üzerine takın ve hangi zaman nöroepitelyal hücrelerin formu sırasında ayırt etmek için izin verilir. Bunlar, nöroepitelyal hücreler 17. günde de izole edilebilir. Onlar lamelleri üzerine kaplama için hazır olana kadar hücreler daha sonra neurospheres olarak muhafaza edilebilir. Herhangi caudalizing faktörü olmadan bir temel ortam kullanılarak, nöroepitelyal hücreler specifie olansonra daha verimli dorsal telencephalic ataları ve glutamaterjik nöronları içine ayrılabilirler telencephalic öncüleri, içine d. Genel olarak, bizim sistem bu nöronların gelişimi ve onları etkileyen hastalıklar çalışma araştırmacılar için insan glutamaterjik nöronlar oluşturmak için bir araç sağlar.
Introduction
İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) de dahil olmak üzere insan pluripotent kök hücreleri (PSC'ler), nöronlar 1-3 dahil olmak üzere vücuttaki her hücre tipi, oluşturmak için kapasitesine sahiptir. Insan PSC'ler çeşitli nöronal alt tipinin farklılaşması yönlendirilmiş rejeneratif tıpta bu hücrelerin uygulama için anahtar tutar. Geliştirme sırasında fonksiyonel nöronal subtiplerinin nesil nöral soyunun indüksiyon, rostro-kaudal ekseni boyunca bölgesel progenitörlerinin şartname ve 4,5 bölgesel öncü hücrelerden post-mitotik nöron tiplerinin farklılaşması içeren karmaşık bir süreçtir. 2001 yılında başlayarak, çeşitli sistemleri nöronal alt 6,7 sonraki nesil için bir platform sağladı hESC gelen nöral soy üretmek için kurulmuştur. Gelişimsel ilkeler, spinal motor nöronlar 8-12, orta beyin dop gibi birçok nöron tiplerinin dayanarakaminerjik nöronlar 13-15 ve nöral retina hücreleri 16,17 verimli insan PSC'ler gelen belirtildi. Bu in vivo gelişimi sırasında bu tür nöron özellikleri için önemli olan kritik morphogens uygulanarak gerçekleştirilmiştir. Diğer protokoller de farklılaşma 21 tanıtmanıza yardımcı olacak gibi küçük moleküller veya diğer hücre türleri ile ortak kültür tarafından ek faktörler 18-20 kullanılarak nöron içine hESC farklılaşma teşvik etmek geliştirilmiştir.
İnsan neokorteks derece gelişmiş ve öğrenme, bellek ve bilişsel işlev 22,23 önemli bir rol oynamaktadır glutamaterjik nöronlar da dahil olmak üzere pek çok hücre tipi içerir. Kültür glutamaterjik nöronlar üreten ilk adım telencephalic progenitör hücrelerin belirtmektir. Yoshiki Sasai grubunun ilk serumsuz suspensio kullanarak fare EKH (mESCs) den telencephalic öncüllerinin yönetti farklılaşma bildirdiDKK1 varlığında (Wnt sinyal inhibe eden) yanı sıra LeftyA (boğum sinyalleme inhibe eden) 24 n kültürü. Daha sonra, bizimki de dahil olmak üzere çeşitli gruplar da serum serbest orta 25-27 insan PSC'ler gelen telencephalic öncüllerinin belirtimi bildirdin. Insan PSC'ler dan telencephalic öncüleri kuşak eksojen morphogens ve bunların öncüleri üreten verim kullanımı mESCs 26,27 dan daha çok daha yüksek olduğu gerektirmez. Burada, iyi Zhang'ın grubu 7 tarafından kurulmuştur nöral indüksiyonu için kimyasal olarak tanımlanmış sistem tarif edilmiştir. Ekzojen caudalizing faktörlerin yanı sıra, bu aynı protokol verimli bir şekilde insan PSC'ler 27 telencephalic öncüleri oluşturur. Bunlar ataları sonra Wnt ve sonik kirpi (SHH) arasında sinyal düzenleyerek dorsal veya ventral ataları olarak ayrılabilirler. Dorsal öncüllerinden daha glutamaterjik nöronlar e farklılaşabilmektedirfficiently 27. Buna ek olarak, bu protokol, aynı zamanda hastalıkların büyük bir dizi eylem için aynı zamanda potansiyel tedavilerinin mekanizma keşfetmek için kullanılabilir hastaya özel nöron üretimi sağlayan insan iPSCs 28 den glutamaterjik nöronların üretimi için iyi sonuç . Bunun yanı sıra, sistem aynı zamanda telencephalon da farklı nöronal tiplerinin gelişimi ve özellikleri keşfetmek için bir platform sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. İnsan Pluripotent Kök Hücre Agrega Üretimi (D1-D4)
- İnsan pluripotent kök hücreleri temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 4 ng / ml) ile desteklenmiş HESC orta varlığında, fare embriyo fibroblast (MEF) besleyiciler üzerinde kültürlenmiştir. Kültür 5-7 gün sonra, koloniler büyük ama yine de ayrışmamış olduğunda, bir sonraki adım için hazırsınız.
- Enzim çözeltisi önce hazırlanmalıdır. Bir 50 ml tüp içinde, DMEM/F12 ortamı içine bir 1 mg / ml konsantrasyonda dispase (veya kollagenaz) çözülür. Isınmış iken bu çözümler en iyi şekilde karıştırmak için, 10-15 dakika için bir 37 ° C su banyosu içine orta ve enzim içeren tüp yerleştirmek ve sonra bir Steriflip filtre kullanarak sterilize edin.
- Hücrelerin medyumuyla kapalı aspire DMEM/F12 ile durulayın, ve de bu kapalı aspire. HESC için 3-5 dk (iPSCs için en fazla 10 dakika) için inkübatör her iyi ve yere dispase 1 ml ekleyin. Alınan hücreleri mikroskobun altına bak; zamankenarları hafifçe kıvırın / biraz karanlık görünmesi, hücrelerin sonraki adım için hazırsınız. Bu 3 dakika sonra hücreler kontrol ve gerektiğinde geri koymak en iyisidir. Ilk defa bu protokolü kullanıldığında, bunun mümkün olduğu kadar çabuk dispase gelen hücreleri çıkarmak için önemli olduğu gibi aynı anda hücre yalnızca tek bir plaka ile başlamak için en iyisidir.
- Hücrelerinden dispase kapalı aspire. Yavaşça (hücreler bu aşamada çok hassas olan ve nispeten kolayca plaka kapalı gelecek) dispase durulayın amacıyla her bir kuyunun DMEM/F12 orta 1.5 ml ekleyin. DMEM/F12 kapalı aspire ve her bir kuyucuğa HESC orta 1.5 ml eklenir.
- Hücreleri ayırmak ve parçalamak için, (dikey) sağ alt köşesine doğru bir 10 ml'lik cam pipet ucu yerleştirin iyi (hücreler dokunmadan) ve pipet yukarı taşımak ve aşağı - yukarı stoke yakın olmalıdır Devam etmeden aşağı inme. Da diğer tarafında erişildikten sonra, yatay korkunç içinde tekrarction.
- Bütün hücre süspansiyonu içinde olduğunda, 15 ml tüp yerleştirmek ve 2 dakika boyunca 200 x g santrifüj onları. Tüpün altına bir hücre pelet olmalıdır. Pelet yukarıda orta kapalı aspire.
- Agregalar halinde tutmak için kullanılmalıdır hücre kültürü şişesi büyüklüğü hücre orijinal miktarının bağlıdır. HESC ortam 50 ml kullanılmalıdır ile hESC 6 kuyu (1 plaka olarak), bir non-T75 doku kültürü şişesi tedavi edildi. 37 adımda 1.6 şişeyi ve inkübe hücreleri aktarın ° C.
- Hücre artıkları kurtulmak amacıyla, hücre orta ve şişeye yaklaşık 12 saat sonra değiştirilmesi gerekir. Bunu yapmak için, (2 dakika boyunca 200 x g) aşağı dönüş hücreler, bir 50 ml tüp içine orta / hücrelerin her yerleştirmek ve orta yaşlı kapalı aspire. Daha sonra, yeni T75 şişesi içine hücreleri ve yerine taze ortam HESC 50 ml eklenir. Hücreler daha sonra bu aynı prosedürü (günde 5 kadar) sonrasında günlük beslenebilir.
- 50 ml'lik bir tüpe hücre / orta aktarın ve 200 x g'de 2 dakika süre ile hücreler santrifüj. Sonraki, süpernatant kapalı aspire ve nöral indüksiyon orta (NIM) 50 ml T75 şişesi yeni (tedavi olmayan doku kültürü) için hücreleri aktarmak.
- NIM hücreleri içinde olduğunda, orta yarısı iki günde bir değiştirilmesi gerekir. Agregalar bir kaç dakika sonra kendi üzerinde bir 50 ml konik tüp alt (hiçbir santrifüj gerekli) yatacaktır yere yeterince büyük olmalıdır. NIM (D7-D8 toplam) içinde 2-3 gün sonra, hücreler plaka için hazır olur. Laminin veya fetal sığır serumu (FBS) hücreleri levhaları tutturmak için yardımcı olmak için kullanılabilir.
- Doku kültürü ve toplam sayısı, her diğer herhangi bir temas olmadan birkaç gün daha plaka üzerinde büyümeye gerekir olarak gerekli olan 6 oyuklu plakalar hücre yoğunluğuna bağlıdır tedavi edildi. Ortalama olarak, bir gelen hücreleriT75 şişesi hücrelerin değerinde 04-06 Haziran hakkında kuyucuğu verecektir.
- Laminin kullanıyorsanız, ug / ml kat 6-plaka (~ 0.5 ml /) için 10-20 NIM içinde seyreltin. 6-kuyucuğu (kuyu başına ~ 20-30 agrega) üzerine 2-3 saat, plaka hücre agrega için kaplama sonra. Agrega eklenmiş sonra, NIM 1.5 ml ekleyin.
- FBS kullanılması durumunda,% 90 NIM ve% 10 FBS (1.5 ml / çukur) oluşan bir karışım hazırlanır. Her kuyucuğa hücreleri ile orta 1.5 ml ekleyin, hafifçe agrega yaymak için ileri ve geri plaka sallamak ve hücreler küvözde O / N eklemenize izin verir. FBS kaldırmak için ertesi sabah, orta (2 ml / NIM arasında) değiştirmek için emin olun.
- Kaplama olmanın bir veya iki gün sonra, her agrega bir tek tabaka oluşturacak şekilde yayılır. Birkaç gün içinde, bu hücrelerin çoğunun merkezlerinin morfolojik kolumnar hücreleri (uzunlamasına) benzer görünecektir. Bu dönemde, her gün NIM değiştirin. Bazı PSC hatları (especially IPSC), daha az verimli kolumnar hücreleri oluşabilir. Bu durumda, 2. aĢama sırasında BMP ve TGF inhibitörleri (Dorsomorphin 29, 2 mcM az SB431542 19) ek yardımcı olabilir.
- Gün 14-17 civarında, kolumnar hücreler daha kompakt görünecektir. Bazen bu hücreler içinde görünür lümen sırtlar veya halkalar oluşturabilirler. Kolumnar morfolojisi yanı sıra, bu aşamada hücreler gibi PAX6 ve SOX1 12,26 olarak nöroepitelyal belirteçleri, ifade eder.
- Izolasyon başlamadan önce, bir ilk mevcut olmayan herhangi nöroepitelyal hücresi olup olmadığını belirlemek için hücreleri incelemek gerekir. Objektif bir işaretleyici olmayan nöroepitelyal koloniler belirtmek için kullanılabilir. Bunlar daha sonra bir pipet ucu ile kazıyarak ortadan kaldırılabiliyor.
3. Telencephalic progenitörlerinin Nesil (D17-D24)
- Kolonilerin merkezleri nöroepitelyal hücreleri içerir ve koloni geri kalanından izole edilmelidir. Bu kullanılarak yapılabilirBir mikropipet ve steril 1 ml filtrelenmiş pipet. Basınç küçük bir miktar koloni merkez kısmına uygulandığı zaman, bu genel olarak oldukça kolay kapalı kaldırır. Koloninin dış kısmı yanı ayırmak izin için dikkatli olun. Merkezlerinde inatçı olmak ve kendi Çıkmıyor, onlar steril kaput bir mikroskop altında bir iğne kullanarak onları eksize edilerek kaldırılabilir. 15 ml tüp kolonilerin merkezi kısımları aktarın ve 2 dakika boyunca 200 xg'de döndürün.
- Orta hücre dışı aspire edilmelidir. (A vitamini, 1:50 olmadan) B27 ilavesi ile NIM 10 ml T25 içeren şişenin tedavi edilen hücrelerin değerinde iki plaka sonra olmayan bir doku kültürü ile aktarılabilir. Hücrelerin bir plaka başına ortam yaklaşık 5-10 ml kullanımı.
- Hücreler ertesi güne izlendi, bunlar görünüm gibi bir alan olmalıdır. Genellikle periferik hücreler olduğu gibi, yeni bir şişeye (NIM ve B27, 1:50 varlığında) bu hücrelerin aktarımı için gerekli olangizlice ve balonun altına eklemek hangi.
- Neurospheres sonra B27 (1:50) ile desteklenmiş NIM kullanılarak bir hafta için süspansiyon içinde kültüre edilmesi gerekmektedir. Hücre dayanıklılık desteklemek ve proliferasyonu, siklik AMP (cAMP, 1 uM) birlikte insülin büyüme faktörü (IGF1, 10 ng / ml) için süspansiyon kültürü sırasında ortam içine ilave edilebilir. Bu noktada, neurospheres telencephalic ataları içeren (FOXG1 +) ve terminal farklılaşma için lamelleri üzerine kaplanacaktır hazırız.
4. Telencephalic Nöronlar (D25 +) içine ilave Farklılaşma
- Hücreler kaplama için poly-ornithine/laminin kaplanmış lamelleri (24 oyuklu plakalar) hazırlayın. Lameller ilk olarak temizlenir ve daha sonra manevra-ornitin ile kaplanmış (0.1 mg / ml, 37 ° C, O / N, ve dondurucuda saklanabilir) belirlenir.
Poly-ornitin kaplama:- Lamelleri sterilize edilmesi: Bir içinde lamelleri yerleştirinbeher nitrik asit içeren ve yavaşça bir saat davlumbaz sallayın. , Nitrik asit dökerek DI su ile birkaç kez yıkayın ve en az 15 dakika süreyle DI akan su altında lamelleri bırakın. % 95 etanol içinde lamelleri yerleştirin ve ya RT 30 dakika (hemen kullanıyorsanız) veya etanol içinde mağaza için sallayın.
- Steril bir başlık, bir 6-kuyulu plakanın kapak içine steril lamelleri ihtiva eden 50 ml'lik tüp içeriğini boşaltınız. Sterilize forseps kullanarak, bir defada bir lamel pick up ve tek bir iyi bir 24-plaka dik ayarlanır. Her bir oyuğa, bir lamel sahip olacak şekilde tekrar edin.
- Onlar tamamen kurumasını sonra lamelleri her bir kuyunun içinde düz düşmüş kadar plakaları dokunun. Sonraki her bir lamel 100 ul poli-ornitin (0.1 mg / steril dH 2 O ml) eklenir ve plakalar 37 inkübe O / N ° C.
- Ertesi gün, inkübatör plakaları kaldırmak ve onları RT soğumaya bırakın. (T kenarından itibaren her bir lamel kapalı poli-ornitin aspireO lamel) sürecinde lamelleri dokunmayın veya çizmemeye emin. Lamelleri yıkamadan önce yaklaşık 30 dakika kurumasını bekleyin.
- De her 1 ml steril dH 2 O ekleyin, 10 dakika bekletin, ve her kuyudan suyu aspire. Bu yıkama iki kez daha yineleyin. Plakaları tamamen kurumasını sonra (izinli kaputu kapalı kapsar) alüminyum folyo ile kapatın, üzerinde kapak yerleştirin ve -20 ° C'de mağaza
- Laminin ile ceket lamelleri için, sadece kendisi lamel (dokunma sıvı olması dikkat ederek her bir poli-ornitin tedavi lamel sinir farklılaşma orta ve laminin (20 ug / ml 'lik nihai konsantrasyon) karışımı 50 ul ekle ve dökülüp değil kapalı). Bağlanma için hücreler hazırlanması için 1-2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe.
- Hücreler kaplama için poly-ornithine/laminin kaplanmış lamelleri (24 oyuklu plakalar) hazırlayın. Lameller ilk olarak temizlenir ve daha sonra manevra-ornitin ile kaplanmış (0.1 mg / ml, 37 ° C, O / N, ve dondurucuda saklanabilir) belirlenir.
- Toplayın ve bir 15 ml tüp 2 dakika süreyle 200 xg'de neurospheres santrifüj. Süpernatantı kapalı aspire. <li>
- DMEM-F12 hücreleri ile durulayın ve tekrar hücre santrifüjlenir. Neurospheres düzgün takmak için çok büyük iseler, bu aşamada Accutase ile ayrışmış olabilir.
- Accutase kullanılıyorsa: DMEM-F12 hücreleri ile yıkama işleminden sonra, neurospheres Accutase (~ 2 mL) eklenerek ve 3 dakika için 37 ° C sıcaklıkta inkübe hücreleri tarafından küçük kümeleri için ayrılmış bulunmaktadır. Daha sonra, tripsin inhibitörü (~ 2 ml) ile aynı miktarda ekleyin ve 3 dakika boyunca 200 x g santrifüj hücreleri. Hücreler daha sonra NDM içerisinde yeniden asıltılanır ve bir P200 pipet kullanılarak ayrılmalıdır. Küçük kümeler daha sonra önceden kaplanmış lamelleri üzerine kaplama yapılabilir.
- Orta çoğunluğu kapalı aspire ve seçerek daha kolay hale gelir, böylece orta bir kaç damla içinde bir 6 santimetrelik bir petri tabağına üzerine hücreleri yerleştirin. Her ön kaplı lamel 4-5 neurospheres ekleyin. İlk laminin kapalı aspire etmek gerek yoktur.
- Neurospheres en az 2-4 saat boyunca takmak edelim. Bir kez onlar varttached da daha fazla orta (0.5 ml / lamel) ilave edilmelidir. Bu sinir B27 (1:50) ile desteklenmiş farklılaşma, orta cAMP (1 uM) ve nörotrofik faktörler (BDNF, GDNF ve IGF Tüm ng / ml 10) oluşmalıdır. Bu noktada, ortamın yarısı her diğer gün değiştirilebilir ve bu hücrelerin birkaç ay boyunca muhafaza edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, bir protokol çeşitli kritik adımlarda telencephalic glutamaterjik nöronlar içine insan PSC'ler farklılaştırmak için: PSC agregatların oluşumuyla, nöroepitelyal hücrelerin indüksiyonu, telencephalic progenitörlerinin nesil ve telencephalic nöronlar içine bu progenitörlerinin terminal farklılaşma (Şekil 1) vardır tarif edilmiştir. Bu sistem telencephalic ataları ve glutamaterjik nöronları nesil güçlü ve verimlidir. Bir örnek (Şekil 2) gibi, caudalizing faktörlerin ilavesi olmadan hESC sinir soy 27 içine ayırt edilmiştir. 24 gün sonrası farklılaşma anda, nöral öncüleri çoğunluğu FOXG1 (telencephalon tarafından ifade edilen bir transkripsiyon faktörü) için pozitif ama telencephalic ataları başarıyla (Şekil 2B) oluşturulduğunu düşündüren HOXB4 (arka beyin ve omurilik hücreleri için bir belirteç) negatif idi. Bu telencephalic progenitörler p dorsal olarak PAX6 ifadesi (dorsal ataları tarafından ifade edilen bir belirteç) (Şekil 2E) tarafından belirtilen fenotipi, ama NKX2.1 (ventral ataları için bir belirteç) (Şekil 2F) ossess. Daha fazla farklılaşma takiben, bu telencephalic dorsal progenitörlerin glutamaterjik işaretleyici TBR1 (yaklaşık% 80) 27 pozitif olan glutamaterjik nöronlar, ayrışmıştır. TBR1 için pozitif boyandı Nöronlar da nöronal belirteçler βIII-tübülin (Şekil 2G) veya mikrotübül ilişkili protein 2 (map2, Şekil 2H) pozitifti. Bu hücreler aynı zamanda kültür telencephalic glutamaterjik nöronlar (Şekil 2I) verimli nesil düşündüren veziküler glutamat taşıyıcısı 1 (vGLUT1), olgun glutamaterjik nöronlar için bir belirteç, dile getirdi.
highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50321/50321fig1.jpg "/>
Şekil 1. Nöronal farklılaşma süreci için şematik bir zaman çizelgesi.
Şekil 2. Nöronal farklılaşma sırasında birkaç kritik aşamalarında hücreleri vurgulayarak Görüntüler. (A) İnsan EKH 4 gün boyunca kültüre edildi. ESC agregatları (B) ve nöroepitelyal hücreleri (C) oluşumu gösteren Aşama görüntüler. 24 günün sonunda hESC ikinci farklılaştırma sonra, NE hücrelerin çoğunluğunun FOXG1 edildi + ancak HOXB4 - (D). Telencephalic ataları (FOXG1 +) PAX6 + (E) ama NKX2.1 vardı - (F) farklılaşma 1 ay sonra. İki ek sonralameller üzerine hücreler arasında ayrım hafta (6 hafta içinde toplam), çoğu glutamaterjik işaretleyici TBR1 (G, H) hem de nöronal belirteçler βIII-tubulin (G) ve map2 (H) için pozitif boyandı. Farklılaşma sekiz hafta sonra, hücreler olgun glutamaterjik işaretleyici, vGLUT1 (I) pozitifti. Ölçek çubukları: 100 um (A), 50 um (BI). (DI izni ile bizim önceki yayının 27 adapte edilmiştir).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nöral farklılaşma sürecinde çok kritik adımlar vardır. Aksi takdirde hücrelerin önceden nöronal olmayan soy olma yolunda önyargılı olabilir, çünkü insan PSC'ler pluripotent olduğundan emin olmak için önemlidir. Bu, bu tür Oct4, Sox2, Nanog, ve Tic-1-60 olarak 1-3 pluripotency belirteçler karşı antikorlar ile insan PSC'ler lekeleme ile teyit edilebilir. İnsan PSC'ler onları pasajlanmasını sonra çok iyi ekleyiniz yoksa, ROCK inhibitörü (Y27632) yardım eklenebilir. Sistemde hücre pluripotent tutma zorluğu sahip olanlar, bazı potansiyel sorunları kalite / yoğunluk MEF hücrelerin yanı sıra, partiden partiye varyasyon olabilir olarak kullanılan KOSR bir yeri vardır. EMB besleyici hücreleri yukarıdaki protokole PSC'ler korumak için kullanılabilir olmasına rağmen, bu yöntem ayrıca besleyici içermeyen sistemleri kullanılarak kültive edilir PSC'ler için çalışır.
Hücreler PSC agregatlar oluşturması için kırık ediliyor, bu lim önemlidirsadece birkaç dakika için onların dispase pozlama (kenarları yuvarlak olacaktır). IPSCs kenarına (10 dk) EKH (3-5 dk) daha genellikle uzundur önce aldığı zaman uzunluğu. Bu hücreler bu zarar ve hatta hücrelerini öldürmek gibi çok uzun süre enzim olmayan sağlamak için bir seferde insan PSC'ler sadece bir tabak dispase eklemek en uygunudur. Hücreler PSC toplam aşamasında olan sonra, bir düşük yoğunlukta hücreler tutmak için önemlidir. PSC agregalar kaplı olduğunda yoğunluğu da oldukça önemlidir. Bu hücreler önümüzdeki birkaç gün içinde plaka üzerinde genişleyecek ve önlemler onlar büyük büyümek sonra onlar dokunmak olmayacak emin olmak için alınmalıdır. Eki adımı (2.2) sırasında, bu gen ifadesi etkileyebilecek gibi hücrelerin FBS uzun süre maruz kalma yok olmasını sağlamak için zorunludur. Nöroepitelyal hücreler izole edilmeden önce, bir daha saf üretmek için sırasıyla nöronal olmayan kümeleri kazıyın için de önemlidirhücre popülasyonları. Biri kendi hücrelerinin nöronal soyu giriyoruz olmadığını karakterize etmek isteseydi, çeşitli faktörler Pax6 veya Sox1 gibi baktı olabilir. Pax6 nöral farklılaşma sırasında etrafında günde 10 açar ve Sox1 dönüşler farklılaşma 12,26,30 2 hafta sonra tarafından.
Bu protokol nöral farklılaşma ön planda olduğu bu özetlediği insan sinir sisteminin gelişimi sırasında gerçekleşecek birçok adımlar olarak. Caudalizing faktörleri (retinoik asit, bazik FGF) kullanımı olmaksızın, nöroepitelyal hücreleri verimli bir şekilde nöroektodermin hücreleri ilk gelişimi in vivo 31 boyunca bir fenotip elde etmek rostral denk telencephalic ataları, içinde farklılık gösterir. Bunlar telencephalic progenitörlerin hücreleri 27 dorsalizes endojen Wnt sinyal nedeniyle dorsal fenotipe sahip. Bu sistem daha sonra glutamaterjik hücre içine daha fazla farklılaşmış olabilir dorsal ataları üretirs. Bu hücre tipi çok önemli olmakla birlikte, hiç bu sistem oluşturma yeteneğine sahip olduğu tek hücre tipi anlamına gelmiyor. Örneğin, SHH ve buna ek olarak bu GABAerjik hücrelere 27,32 ayrım sağlayan hücreler ventralize gösterilmiştir. Hatta bu hESC elde GABAerjik nöronlar farelere nakledilen ve beyin lezyonları 32 nedeniyle lokomotor kusurları düzeltmek mümkün olduğunu edilebilir olduğu görüldü. Bu makale gösterilen protokoldür aşamalı kontrol noktalarından geçer Çünkü, bu sadece geliştirme ve hayal gücümüzü anlayışımız ile sınırlıdır insan sinir sistemi içinde hücrelerin geniş bir dizi üretmek için bir araç sunmaktadır.
PSC'ler insan nöronlar oluşturma yetisi bir temel bilim yanı sıra bir klinik açıdan hem de kapı çok sayıda açar. Postmortem doku kaynaklar sınırlıdır ve insan PSC farklılaşma araştırmacılar bir verim alınmasını sağlar, oysa kalite, değişebilirçalışmak için hücrelerin sınırsız ve tutarlı kaynağı. Indüklenmiş pluripotent kök hücre (IPSC) teknolojisi 1,3,33,34 gelişiyle, şimdi çeşitli hastalıklara 35-38 olanlarda dahil olmak üzere hasta fibroblastlardan hESC benzeri hücreler elde etmek mümkündür. Grubumuzun 28 gibi pek çok diğerleri tarafından gösterildiği gibi, IPSC gelen nöronların başarılı nesil olmuştur ve uzun hastalık ve kalkınma için insan modelleri aranan olanlar için benzersiz ve kullanışlı bir araç olmaya devam edecektir. Buna ek olarak, çeşitli gruplar PSC-türevi nöronlar hastalık sürecinin 36,37,39-42 belirli yönleri model olabilir ve bu nedenle terapötik bileşikler 43 taranması için kullanılabileceğini göstermiştir. Bu durum, özellikle, çünkü bunların 8% 44 klinik olarak etkili olduğu gösterilmiştir sadece yaklaşık ile birlikte merkezi sinir sistemi için aday ilaç test etmek için iyi bir model sistemi olmadan teşvik etmektedir. Ancak, bu yöntem ve diğerleri gibi dramatik inci geliştirmek için yardımcı olabilirsayıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar cömertçe FOXG1 antikor sağlamak için Dr Y. Sasai teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Connecticut Kök Hücre Araştırma Hibeler (08-SCB-UCHC- 022 ve 11-SCB24) ve Spastik Parapleji Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Gibco | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | 10828-028 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | 25030 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 1140-050 | |
| 2-Mercapt–thanol (14.3 M) | Sigma | M-7522 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine) | Sigma | 116K5103 | |
| Laminin (human) | Sigma | L-6274 | |
| Laminin (mouse) | Invitrogen | 23017-015 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Collagenase | Invitrogen | 17104-019 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| ROCK Inhibitor | Stemgent | 04-0012 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Invitrogen | 13256-029 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075 | |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| Foxg1 antibody | Dr. Y. Sasai | ||
| Hoxb4 antibody (1:50) | Developmental Studies Hybridoma Bank | I12 | |
| Pax6 antibody (1:5000) | Developmental Studies Hybridoma Bank | PAX6 | |
| Nkx2.1 antibody (1:200) | Chemicon | MAB5460 | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| vGLUT1 antibody (1:100) | Synaptic Systems | 135302 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | PrepoTech Inc. | 450-02 | |
| Glial derived neurotrophic factor (GDNF) | PrepoTech Inc. | 450-10 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | PrepoTech Inc. | 100-11 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | D-0260 | |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D | 1845-SH | |
| 50 ml tubes | Becton Dickinson (BD) | 352098 | |
| 15 ml tubes | BD | 352097 | |
| 6 well plates | BD | 353046 | |
| 24 well plates | BD | 353047 | |
| T25 flasks (untreated) | BD | 353009 | |
| T75 flasks (untreated) | BD | 353133 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| 6 cm Petri dishes | BD | 353004 | |
| 9'' glass pipetes | Fisher | 13-678-20D | |
| Steriflip filters (0.22 μM) | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM) | Millipore | SCGPU10RE | |
| Phase contrast microscope (Observer A1) | Zeiss | R2625 | |
| Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150) | Thermo Electron Corporation | ||
| Biosafety hood (Sterilgard III Advance) | The Baker Company | ||
| Centrifuge (5702 R) | Eppendorf |
References
- Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes. Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).
- Wilson, S. I., Edlund, T. Neural induction: toward a unifying mechanism. Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).
- Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).
- Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).
- Singh Roy, N., Nakano, T., et al. Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells. Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).
- Lee, H., Shamy, G. A., et al. Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons. Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).
- Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).
- Li, X. J., Du, Z. W., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
- Perrier, A. L., Tabar, V., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).
- Roy, N. S., Cleren, C., et al. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).
- Yan, Y., Yang, D., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
- Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).
- Osakada, F., Ikeda, H., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells. Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).
- Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Chambers, S. M., Qi, Y., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).
- Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
- Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. Patterning of the embryonic forebrain. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).
- Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus. Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).
- Watanabe, K., Kamiya, D., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).
- Watanabe, K., Ueno, M., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
- Li, X. J., Zhang, X., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136, 4055-4063 (2009).
- Zeng, H., Guo, M., et al. Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 5, e11853 (2010).
- Kim, D. S., Lee, J. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).
- Zhang, X., Huang, C. T., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).
- Stern, C. D. Initial patterning of the central nervous system: how many organizers. Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).
- Ma, L., Hu, B., et al. Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice. Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).
- Li, W., Wei, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
- Lowry, W. E., Richter, L., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
- Ebert, A. D., Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).
- Kiskinis, E., Eggan, K. Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).
- Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation. Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).
- Walsh, R. M., Hochedlinger, K. Modeling Rett syndrome with stem cells. Cell. 143, 499-500 (2010).
- Egawa, N., Kitaoka, S., et al. Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates. Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).
