Summary
वेंट्रिकुलर मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) जल्दी भ्रूण में मस्तिष्क के विकास के दौरान neuroepithelial और मस्तिष्क cortical पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं bathes. यहाँ हम अलग अलग उम्र के कृंतक भ्रूण से वेंट्रिकुलर सी.एस.एफ. अलग क्रम में अपने जैविक समारोह की जांच करने के लिए विकसित की विधि का वर्णन है. इसके अलावा, हम हमारे मस्तिष्क cortical explant विच्छेदन और संस्कृति तकनीक है कि संस्कृति मध्यम या सी.एस.एफ. की न्यूनतम मात्रा के साथ explant विकास के लिए अनुमति देता है प्रदर्शित करता है.
Abstract
सी.एस.एफ. विकास और वयस्कता भर में एक गतिशील अलग proteome के साथ एक जटिल तरल पदार्थ है. भ्रूण के विकास के दौरान, नवजात सी.एस.एफ. पूर्वकाल न्यूरल ट्यूब के बंद होने पर एमनियोटिक द्रव से differentiates. सी.एस.एफ. मात्रा तो neuroepithelial पूर्वज ventricles और रंजित plexus उत्पन्न सीएसएफ अस्तर कोशिकाओं के रूप में बाद के दिनों में बढ़ जाती है. भ्रूण सी.एस.एफ. संपर्कों शिखर, विकासशील मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के वेंट्रिकुलर सतह. सी.एस.एफ. विकासशील मस्तिष्क के विस्तार के लिए महत्वपूर्ण तरल दबाव प्रदान करता है और महत्वपूर्ण वृद्धि वितरित तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के लिए एक अस्थायी विशिष्ट तरीके में कारकों को बढ़ावा देने की है. सी.एस.एफ. की समारोह की जांच, यह रक्त या विकासशील telencephalic ऊतक से संदूषण के बिना भ्रूण सी.एस.एफ. की शुद्ध नमूनों को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ, हम एक वेंट्रिकुलर भ्रूण सी.एस.एफ. की अपेक्षाकृत शुद्ध कि नमूनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अलग तकनीक का वर्णनमास स्पेक्ट्रोमेट्री, प्रोटीन वैद्युतकणसंचलन, और सेल और प्राथमिक explant संस्कृति सहित प्रयोगात्मक assays की एक विस्तृत श्रृंखला. हम प्रदर्शन कैसे काटना और संस्कृति झरझरा polycarbonate झिल्ली पर cortical explants क्रम में मीडिया या सी.एस.एफ. की कम मात्रा के साथ विकसित cortical ऊतक बढ़ने. इस विधि के साथ, प्रयोगों अलग उम्र या शर्तों से सीएसएफ का उपयोग कर लक्ष्य कोशिकाओं पर सी.एस.एफ. proteome के जैविक गतिविधि की जांच करने के लिए किया जा सकता है.
Introduction
सी.एस.एफ. एक जटिल तरल पदार्थ है कि विकासशील 1-6 neuroepithelium bathes और आवश्यक दबाव 7 और विकास को बढ़ावा देने के विकासशील मस्तिष्क 8-12 के लिए संकेत देता है. मस्तिष्क के विकास के दौरान सी.एस.एफ. अध्ययन, हम चूहे या माउस भ्रूण के विकास से 6,9 के विकास के विभिन्न चरणों के दौरान वेंट्रिकुलर सी.एस.एफ. को अलग करने के लिए तकनीक विकसित की है. अलगाव का पिछला तरीकों एक गिलास सूक्ष्म सुई का उपयोग और एक 1,2 सूक्ष्म सुई लगानेवाला का उपयोग कर सी.एस.एफ. अलग भी शामिल हैं. हमारे विधि एक गिलास विंदुक सूक्ष्म केशिका टिप ऊतक प्रवेश में सुधार के लिए एक ultrafine बिंदु बनाने के लिए निकाला गया है जिसका उपयोग किया जाता है. कांच विंदुक सूक्ष्म केशिका एक aspirator से जुड़े तो कि निलय सी.एस.एफ. संग्रह दबाव कोमल परिवर्तन के साथ नियंत्रित किया जा सकता है. सी.एस.एफ. संकेतों के स्टेम सेल के प्रभावों की जांच करने के लिए, हम मस्तिष्क cortical explants टुकड़े करना, उन्हें polycarbonate झिल्ली पर जगह है, और उन्हें उचित घन पर फ्लोटLTURE मध्यम सी.एस.एफ. 9 नमूनों के साथ पूरक. इस तकनीक के साथ मीडिया के कम संस्करणों टिशू कल्चर के लिए पर्याप्त मात्रा में, सी.एस.एफ. 9 के एक कुशल उपयोग के लिए अनुमति देता है.
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Protocol
1. भ्रूण अलगाव / तैयारी
इस तकनीक माउस या चूहा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में हम सी.एस.एफ. संग्रह तकनीक और माउस भ्रूण मस्तिष्क के साथ मस्तिष्क cortical explant विच्छेदन प्रदर्शित करता है. हम चूहों बनाम चूहों कि सामान्य तकनीक के भीतर मौजूद हैं के लिए किसी भी महत्वपूर्ण मतभेदों पर टिप्पणी नहीं करेंगे. भ्रूण उम्र मचान प्रणाली के लिए, E1 चूहों के लिए प्लग के दिन के रूप में वर्गीकृत किया जाता है, और E0.5 चूहों के लिए प्लग के दिन के रूप में वर्गीकृत किया गया है.
- Sylgard सिलिकॉन elastomer के साथ एक सूक्ष्म विच्छेदन पकवान तैयार. Sylgard 184 सिलिकॉन elastomer एक दो भाग तरल घटक, भाग एक और भाग बी भाग एक और भाग बी वजन या मात्रा द्वारा एक 10:1 अनुपात में मिलाया जाता है के रूप में आपूर्ति की है. बाद तरल घटक मिश्रित कर रहे हैं, एक पेट्री डिश में sylgard elastomer डालना पकवान की पूरी सतह को कवर. कुछ हवाई बुलबुले मौजूद है कि इलाज की प्रक्रिया के दौरान नष्ट करना होगा हो सकता है. पेट्री डिश ढक्कन प्लेस और elastom अनुमति देने केएर का इलाज करने के लिए. elastomer कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए ठीक किया जा सकता है, या तेजी से इलाज के लिए उच्च तापमान (उदाहरण के लिए 37 ° सी) में. एक बार तरल घटकों जमना, विच्छेदन पकवान का उपयोग करने के लिए तैयार है. पकवान कई प्रयोगों के लिए बार बार इस्तेमाल किया जा सकता है कि यह अच्छी तरह से प्रक्रिया के बाद साफ है.
- माइक्रो केशिका विंदुक (सुई) की तैयारी. माइक्रो केशिका pipettes गर्मी लगाने से तैयार कर रहे हैं और एक Narishige PC-10 ऊर्ध्वाधर निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ micropipette डांड़ी का उपयोग खींच: एक कदम खींच, # 2 58 सेट हीटर, 100 छ पुल वजन. micropipette के ठीक टिप ध्यान से टूट रहा है ठीक 55 संदंश का उपयोग. परिणामस्वरूप सुई की औसत भीतरी व्यास 85 मीटर है.
- Aspirator विधानसभा सी.एस.एफ. आकांक्षा के लिए तैयार है. सम्मिलित करें सूक्ष्म सवार केशिका सुई में सूक्ष्म केशिका pipettes के साथ प्रदान की. वैकल्पिक रूप से, aspirator ट्यूब विधानसभा कि टी जुड़ा हुआ है के अंत करने के लिए एक प्लास्टिक डिस्पोजेबल फिल्टर देतेसूक्ष्म केशिका विंदुक ओ. Aspirator विधानसभा के विपरीत छोर पर स्थिति में गैसकेट के माध्यम से सुई धक्का.
- कूड़े से एक माइक्रो विच्छेदन Sylgard साथ तैयार पकवान अलग भ्रूण स्थानांतरण.
- अतिरिक्त भ्रूण झिल्ली और ऊतकों निकालें इतना है कि भ्रूण स्पष्ट रूप से उजागर हो रहा है. प्रत्येक ऊतक परत पहले गर्भाशय की दीवार और फिर पत्या ठीक iridectomy कैंची (यानी ललित विज्ञान उपकरण 15000-02) का उपयोग कर dissected किया जा. प्रत्येक आरोपण साइट पर, 1 गर्भाशय की दीवार, तो पत्या गर्भाशय की लंबी अक्ष के समानांतर छिन्न कर सकते हैं, और चीरा तो आगे खोला जा सकता है ठीक संदंश का उपयोग. आँवल एक समान चीरा के बाद हटाया जा सकता है, भ्रूण झिल्ली को उजागर. देखभाल प्रयोग किया जाना चाहिए इतना है कि भ्रूण झिल्ली छिन्न या नहीं की हवा निकाल दी हैं.
- बाँझ हैंक्स संतुलित नमक समाधान (HbSS) से धो और आसपास के एक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विंदुक एक kimwipe या फिल्टर का उपयोग भ्रूण से अधिक तरल पदार्थ को हटानेकागज त्रिकोण में कटौती.
2. Ventricular सी.एस.एफ. संग्रह
- विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे भ्रूण कल्पना: माउस के लिए, भ्रूण अपने पक्ष पर बिछाने किया जाना चाहिए, जैसे कि एक विकासशील भ्रूण के बाण के समान दृश्य है. चूहे E16 या पुराने भ्रूण के साथ, अपनी पृष्ठीय स्पाइनल कॉलम पर भ्रूण की स्थिति, इसकी सबसे लंबे समय planar आयाम के साथ कपाल लांगुलिय दिशा करने के लिए एक से, के रूप में यदि भ्रूण अपनी पीठ पर झूठ बोल रही है. इस तरीके में सी.एस.एफ. दोनों सही और बाएँ पार्श्व वेंट्रिकल से एकत्र किया जा सकता है.
- लगातार को पार्श्व वेंट्रिकल, mesencephalic निलय, या महाकुण्ड में विंदुक माइक्रो केशिका डालने, neuroepithelial कोशिकाओं से संपर्क नहीं एक बार विंदुक डाला गया है करने का प्रयास है. माउस E14.5 या पुराने भ्रूण के लिए, सी.एस.एफ. सही वेंट्रिकल से aspirated जा सकता है और फिर सुई हटा दिया और बाएं वेंट्रिकल में डाला. और भ्रूण में न्यूरल ट्यूब ventricles की प्रत्यक्षता की वजह से युवा E14.5 की तुलना में,पूरे सी.एस.एफ. मात्रा अक्सर एक एकल सुई प्रविष्टि के साथ पार्श्व ventricles से aspirated जा सकता है. हालांकि, यह हमेशा मामला नहीं है के रूप में विकास और समय जोड़ने ventricles की प्रत्यक्षता थोड़ा भिन्न हो सकते हैं, कर सकते हैं और इसलिए, सूक्ष्म केशिका विंदुक भी महाकुण्ड में डाला जा सकता है के लिए अधिक से अधिक सी.एस.एफ. मात्रा इकट्ठा.
- एक बार माइक्रो केशिका विंदुक को पार्श्व वेंट्रिकल, mesencephalic निलय, या महाकुण्ड में डाला जाता है, ध्यान से और धीरे विंदुक में सी.एस.एफ. aspirating शुरू, या तो सूक्ष्म सवार का उपयोग करने के लिए नकारात्मक दबाव बनाने और सी.एस.एफ. aspirate, या एक प्रदान करके कोमल नकारात्मक दबाव है कि इस तरह के सी.एस.एफ. धीरे एक धीमी और नियंत्रित फैशन में सूक्ष्म केशिका विंदुक में प्रवाह शुरू होता है मुँह के द्वारा बनाई गई है. हम अनुशंसा करते हैं कि दर्शक इन तरीकों पर संस्थागत नीतियों के बारे में अपने स्थानीय अधिकारियों के साथ जांच.
- नकारात्मक दबाव लागू करते हैं और सूक्ष्म केशिका विंदुक में सी.एस.एफ. इकट्ठा जारी.E16.5/E17 या छोटे के माउस और चूहा दोनों भ्रूण में, यह संभव है कि माइक्रो केशिका विंदुक पुराने भ्रूण में अंदर है कि सिर की तरफ पर बनाने divot की उपस्थिति से निलय पतन थोड़ा (नियम आदि का) पालन करना, मस्तिष्क के बड़े आकार की वजह से, यह संभव नहीं हो सिर टूट (नियम आदि का) पालन करना हो सकता है.
- लागू करने का दबाव बंद करो और धीरे पार्श्व वेंट्रिकल से सूक्ष्म केशिका विंदुक हटा दें.
- धीरे कि बर्फ पर ठंडा कर दिया गया एक Eppendorf ट्यूब में सीएसएफ नमूना निष्कासित.
- जानवरों की एक पूरी कूड़े से सी.एस.एफ. इकट्ठा जारी है और एक ही ट्यूब में नमूने पूल.
- 10,000 XG में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए किसी भी contaminating कोशिकाओं को हटाने के लिए अपकेंद्रित्र.
- Neuroepithelial कोशिकाओं या लाल रक्त कोशिकाओं contaminating के किसी भी लक्षण के लिए नमूनों का विश्लेषण. प्रदूषण के लक्षण आम तौर पर बादल या लाल / गुलाबी दिखने द्रव, या एक रक्त tinged हाजिर के साथ एक गोली की उपस्थिति के संकेत हैं. Centrifugation के बाद, सीएसएफ कोशिकाओं या सेलुलर मलबे का कोई सबूत के लिए microscopically विश्लेषण कर सकते हैं. अगर वहाँ संदूषण के संकेत मिल रहे हैं द्रव खारिज किया जाना चाहिए. नियंत्रण के रूप में एक अतिरिक्त, गोली सामग्री भी कोशिकाओं के लिए दाग किया जा सकता है. एक साफ सी.एस.एफ. नमूना सेल संस्कृति, cortical संस्कृति, स्पेक्ट्रोमेट्री, पश्चिमी धब्बा, एलिसा, और अन्य assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. स्पष्ट सी.एस.एफ. एक नया बाँझ Eppendorf ट्यूब में स्थानांतरित किया जाना चाहिए. नमूना अब विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, अन्य नमूने, या तस्वीर तरल नाइट्रोजन के साथ जमे हुए के साथ जमा और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ठंड और तरल पदार्थ की छोटी नमूने के विगलन एक छोटी मात्रा में कमी और प्रोटीन एकाग्रता में परिवर्तन में हो सकता है. यह नमूने सुखाने फ्रीज से बचा जा सकता है.
3. Cortical Explant विच्छेदन
- स्थानांतरण E14.5 भ्रूण एक माइक्रो विच्छेदन Sylgard साथ तैयार पकवान पर कूड़े से अलग.
- अतिरिक्त भ्रूण झिल्ली और ऊतकों से भ्रूण निकालें के रूप में 1.5 चरण में वर्णित है. <li> धो बाँझ हैंक्स संतुलित नमक (HbSS) समाधान और आसपास के एक विंदुक का उपयोग भ्रूण से अधिक तरल पदार्थ को हटाने के साथ.
- गर्भाशय ग्रीवा के भ्रूण के बाकी (चित्रा 1 ए) से सिर अलग क्षेत्र के माध्यम से काटना.
- एक ठीक स्केलपेल (नेत्र चाकू) का उपयोग करते हुए, नीचे खोपड़ी के midline में कटौती. ठीक संदंश के साथ इस चीरा के प्रत्येक पक्ष समझ और त्वचा को हटा दें. अगले, iridectomy कैंची का उपयोग करने के लिए एक चीरा है कि विकासशील कपाल के midline की लंबाई रन बना. बाद में, विकासशील खोपड़ी के पूर्वकाल और कूल्हों छोर से दो अतिरिक्त चीरों, दूरी के लगभग 1/3. ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए कपाल की "फ्लैप" समझ है कि विच्छेदन के इस हिस्से से परिणाम है, और विकासशील खोपड़ी के ऊतक को हटाने, प्रांतस्था (चित्रा 1 बी) को उजागर.
- स्केलपेल द्विविभाजित midline साथ मस्तिष्क का प्रयोग विमान मध्य sagital में, सही और बाएँ cortical गोलार्द्धों (आंकड़े अलग1 बी, सी). पिया और रेशेदार छोड़ दिया प्रांतस्था संलग्न करने के लिए कर रहे हैं, और ड्यूरा साथ विकासशील खोपड़ी के साथ हटा दिया जाता है.
- प्रत्येक cortical गोलार्द्ध अलग तैयार करो. इतनी है कि आप ganglionic श्रेष्ठता और विकासशील प्रांतस्था (1C आंकड़े, डी) देख सकते हैं गोलार्द्ध औसत दर्जे का पक्ष रखें.
- स्केलपेल का प्रयोग, cortical विकासशील घ्राण बल्ब लांगुलिय neuroepithelium के माध्यम से एक राज्याभिषेक चीरा बनाने के लिए. इस चीरा पार्श्व और औसत दर्जे ganglionic eminences के पूर्वकाल सीमा पर शुरू करना चाहिए, और विकासशील cortical आरंभ (चित्रा 1E) के पूर्वकाल सिंगुलेट क्षेत्र के माध्यम से विस्तार.
- एक और राज्याभिषेक बस पार्श्व ganglionic श्रेष्ठता (चित्रा 1F) के पीछे सीमा को दुम का चीरा. यह चीरा भी ganglionic श्रेष्ठता के पार्श्व सीमा से विकासशील cortical आरंभ की औसत दर्जे की दीवार का विस्तार करना चाहिए.
- Cortical "प्रालंब" crea वापस लेनाटेड दो 3.7 और 3.8 कदम में बनाया है, प्रांतस्था यांत्रिक क्षति से बचने के लिए एक 200 μl pipettor साथ दिया HbSS की एक धारा से एक स्केलपेल या कोमल दबाव का उपयोग चीरों के द्वारा. फिर विकासशील प्रांतस्था (आंकड़े 1G, एच) से पार्श्व ganglionic श्रेष्ठता अलग सीमा के साथ एक अनुप्रस्थ चीरा. फिर, दूर neocortex जहां पार्श्व cortical सतह interhemispheric दीवार मिलता है के शीर्ष पर विकसित हिप्पोकैम्पस और औसत दर्जे का telencephalon के cortical हेम काटना.
- विकासशील प्रांतस्था (1H चित्रा) से पार्श्व ganglionic श्रेष्ठता अलग सीमा के साथ एक अनुप्रस्थ चीरा.
- किसी भी अतिरिक्त dissected ऊतक है कि dissected cortical explant से Sylgard प्लेट पर निकालें. एक ताजा HbSS बफर के साथ कोमल pipetting पर उपयोग करने के लिए दूर किसी भी अतिरिक्त ऊतक dissected विंदुक कर सकते हैं. dissected प्रांतस्था मस्तिष्कावरणीय ओर नीचे का सामना करना पड़ रहा है (1 मैं चित्रा) के साथ अब है.
- एक प्लैटिनम तार एक गिलास विंदुक जुड़े पाश तैयार. एक जोड़ प्लैटिनम कांच विंदुक के अंत में डाला तार के साथ कांच विंदुक गर्मी. प्लैटिनम तार पाश के अंत घुमा, लूप के आकार या बढ़ाया जा सकता है और कमी आई है, और पाश वांछित explant के आकार फिट करने के लिए आकार का हो सकता है. (यह पहले से तैयार किया जा सकता है और reused.)
- प्लैटिनम तार के अंत गर्मी पाश बाँझ बनाना.
- Dissected cortical explant अलग और कोमल pipetting द्वारा अतिरिक्त HbSS मीडिया को निकालने के लिए, तार लूप के साथ प्रयोग करने के लिए एक छोटी सी राशि छोड़कर.
- एक 4 सेमी व्यास इमेजिंग पकवान में 1 सेमी polycarbonate झिल्ली रखें.
- प्लैटिनम तार पाश की ओर का प्रयोग, धीरे प्रांतस्था फ्लिप इतना है कि मस्तिष्कावरणीय पक्ष का सामना करना पड़ रहा है.
- विच्छेदन पकवान बंद लूप के बीच में explant रखने और आंतरिक हीड्रास्टाटिक बलों का उपयोग करने के लिए cortical explant, लिफ्टएक फ्लैट विमान पर explant उठा.
- धीरे polycarbonate झिल्ली पर explant जगह, और प्लैटिनम तार पाश दूर उठा है कि इस तरह के explant वेंट्रिकुलर सतह झिल्ली के साथ संपर्क बनाने के साथ एक फ्लैट विमान पर झिल्ली पर बनी हुई है.
- धीरे झिल्ली उठा और झिल्ली के तहत सी.एस.एफ. या अन्य मीडिया के 50 μl विंदुक.
- इमेजिंग पकवान कवर एक humidified माध्यमिक कंटेनर में जगह है, और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं 5% सीओ 2 में 24 घंटे के लिए जारी सेल प्रसार और explant विकास का समर्थन चित्रा 2 अंतिम cortical explant पकवान की तैयारी के एक योजनाबद्ध दर्शाया गया है.
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Representative Results
सी.एस.एफ. संग्रह एक स्पष्ट, पारदर्शी द्रव उपज चाहिए. खून से संदूषण का कोई सबूत नहीं है, के रूप में एक लाल या पीले रंग Aspirate और Eppendorf ट्यूब में tinged द्रव द्वारा प्रदर्शन करना चाहिए. वहाँ भी Aspirate और Eppendorf ट्यूब में ऊतक के कोई सबूत नहीं होना चाहिए. जब सी.एस.एफ. centrifuged है, एक भी सी.एस.एफ. microscopically का आकलन कर सकते हैं सुनिश्चित करें कि वहाँ कोई संदूषण है. अगर वहाँ संदूषण के संकेत मिल रहे हैं, सी.एस.एफ. खारिज किया जाना चाहिए. एक E14.5 माउस कूड़े से एक 10-15 μl सी.एस.एफ. इकट्ठा करने की आशा तालिका 1 सी.एस.एफ. की औसत मात्रा में विभिन्न भ्रूण उम्र से दोनों चूहों और चूहों में औसत कूड़े आकार से एकत्र दर्शाया गया है. कर सकते हैं. जब शुद्ध सीएसएफ के नमूनों को एकत्र किया गया है, सी.एस.एफ. विभिन्न तकनीकों का एक नंबर का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया जा सकता है 3 चित्रा एक प्रतिनिधि चांदी दाग माउस E14.5 सी.एस.एफ. की 2ug का उपयोग कर जेल से पता चलता है.
सेरेब्रल cortical explants बुद्धि विकसित किया जा सकता हैज सी.एस.एफ. की मात्रा अधिक यदि आवश्यक हो तो यह है कि कुल मात्रा 50 μl बेसल मध्यम चित्रा 4 अलग प्रतिनिधि 24 घंटे के लिए 100% भ्रूण सी.एस.एफ. की 50 μl के साथ हो explants से पता चलता है. explants के लिए जीवित रहने के लिए दिखाया गया है और 100% सी.एस.एफ. के साथ पैदा करना और एक ही गर्भावधि 9 वेंट्रिकुलर साथ, उम्र के रूप में immunoreactivity द्वारा phospho histone (PH3) H3, कोशिका विभाजन की एक मार्कर, संकेत में ऊतक ऊतक विज्ञान कृंतक भ्रूण के समान है सतह, BrdU, डीएनए संश्लेषण, वेंट्रिकुलर क्षेत्र के साथ समावेश, और Tuj1, विकासशील cortical थाली में एक neuronal मार्कर के एक मार्कर.
| Sprague Dawley कूड़े भ्रूण उम्र | कूड़े प्रति वॉल्यूम | CD1 कूड़े भ्रूण आयु | कूड़े प्रति वॉल्यूम |
| E13 | 30-50 μl | E10.5 | 15-20 μl |
| E14 | 40-75 μl | E12.5 | 15-20 μl |
| E16 | 50-90 μl | E14.5 | 10-15 μl |
| E18 | 40-75 μl | E16.5 | 5-10 μl |
तालिका 1 सी.एस.एफ. की औसत मात्रा मानक आकार litters से प्राप्त.
चित्रा 1. योजनाबद्ध सेरेब्रल Cortical Explant विच्छेदन रूपरेखा.
चित्रा 2. Final डिश तैयार करने के योजनाबद्ध आरेख.
चित्रा 3. चांदी माउस E14.5 सीएसएफ के दाग यह एक प्रतिनिधि रजत 2ug माउस E14.5 सी.एस.एफ. प्रोटीन Invitrogen से 4-12% पर बीआईएस Tris NuPAGE ढाल जेल चलाने के दाग. सिल्वर SilverQuest रजत धुंधला हो जाना किट के साथ 5 मिनट 40 सेकंड के लिए विकसित किया दाग.
चित्रा 4. E15 चूहे cortical 24 घंटे के लिए हो explants मस्तिष्क cortical 100% भ्रूण सी.एस.एफ. में 24 घंटे के लिए हो explants के प्रतिनिधि छवियों हैं. ये explants Carnoy विधि, sectioned आयल द्वारा तय किया गया है, और immunostaining लिए तैयार है. (लाल) PH3, और Tuj1 (हरा), BrdU (नीला).
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Discussion
वेंट्रिकुलर सी.एस.एफ. संग्रह के लिए वर्णित विधि स्थिर प्रोटीन और सेलुलर 9 assays के एक संख्या में लगातार गतिविधि रचना के साथ भ्रूण सी.एस.एफ. की अपेक्षाकृत शुद्ध नमूनों झुकेंगे. एक अच्छा संग्रह तकनीक और दस E14.5 चूहों के कूड़े के आकार के साथ, एक सी.एस.एफ. की 10-15 μl इकट्ठा करने की उम्मीद कर सकते हैं, और E16 चूहों के एक कूड़े से एक सी.एस.एफ. की 50-90 μl के बारे में इकट्ठा की उम्मीद कर सकते हैं. इस संग्रह तकनीक सावधान अवलोकन, centrifugation, और सेलुलर मलबे या रक्त रंगत के किसी भी सबूत के साथ नमूने की discarding द्वारा रक्त और ऊतक से प्रदूषण को कम करता है. हम तरल पदार्थ का विश्लेषण किया है microscopically सेलुलर या centrifugation बाद सी.एस.एफ. के भीतर मलबे कोशिकाओं के लिए आकलन, और पाया कि नमूनों कि centrifugation के बाद कोई गोली सेलुलर संक्रमण से मुक्त हैं. मस्तिष्क के ऊतकों के विकास की proteome या दूषित सीएसएफ (नहीं दिखाया डेटा) के नमूने, सी.एस.एफ. निकासी की इस पद्धति का उपयोग करने के लिए इसके विपरीत,सी.एस.एफ. proteome किसी भी mitochondrial प्रोटीन नहीं होते हैं जब एक बड़े पैमाने पर 6 स्पेक्ट्रोमीटर के साथ विश्लेषण किया.
Telencephalic vesicles और न्यूरल ट्यूब के भीतर वेंट्रिकुलर सी.एस.एफ. की शारीरिक, स्थानीयकरण का एकमात्र तरीका अलगाव विकासशील त्वचा, खोपड़ी, और telencephalon के माध्यम से बेध है के आधार पर. इसलिए, इन ऊतकों के माध्यम से सुई प्रविष्टि संभव संदूषण के लिए एक स्रोत है. सुई की नोक के रूप में संभव के रूप में पतला हो सकता है, जैसे कि सुई के माध्यम से ऊतक और निलय में आसानी से डाला जा सकता है. माइक्रो केशिका विंदुक निलय में सुई की प्रविष्टि दौरान सुई के बोर के भीतर ऊतकों को एकत्र कर सकते हैं. भ्रूण की उम्र पर निर्भर करता है, और अगर रंजित plexus निलय के भीतर विकसित किया गया है, यह महत्वपूर्ण है विंदुक में aspirate रंजित plexus की सामग्री नहीं. हालांकि, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए पर्याप्त है कि इस तरह के सी.एस.एफ. टी में एकत्र नकारात्मक दबाव बनानेवह आसपास के मस्तिष्क के ऊतकों के विकास या रंजित plexus परेशान बिना विंदुक. ऊतक संदूषण की उपस्थिति विदारक खुर्दबीन के नीचे कल्पना एक गिलास को कवर पर्ची के साथ एक गिलास स्लाइड पर सी.एस.एफ. pipetting और सीधे सेलुलर मलबे के लिए visualizing, हो सकता है.
तरीकों हम सी.एस.एफ. अलगाव के लिए वर्णन सी.एस.एफ. की अपेक्षाकृत शुद्ध नमूने उपलब्ध कराने के रूप में हम आज के लिए निर्धारित किया है. जब दूषित सीएसएफ के नमूनों मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग विश्लेषण किया गया है, वे mitochondrial प्रोटीन (नहीं दिखाया डेटा) की उपस्थिति का पता चला है. तकनीक में एक अंतर्निहित दोष है कि सी.एस.एफ. खोपड़ी और प्रांतस्था विकासशील puncturing द्वारा प्राप्त किया जाता है, और इसलिए कोशिकाओं और ऊतकों सी.एस.एफ. में मौजूद हो सकता है. सीएसएफ centrifuging, परख करने की क्रिया के लिए एक गोली, और microscopically खुर्दबीन के नीचे सी.एस.एफ. का विश्लेषण करके, हम सी.एस.एफ. अलगाव के लिए एक तरीका है कि सी.एस.एफ. की अपेक्षाकृत शुद्ध नमूने पैदावार अनुकूलित है.
तकनीक चया वेंट्रिकुलर भ्रूण सी.एस.एफ. संग्रह और मस्तिष्क cortical explants वर्णित किया गया है और एक भ्रूण माउस के लिए फिल्म में दिखाया गया है. हालांकि, इस तकनीक सभी भ्रूण कृन्तकों से वेंट्रिकुलर सी.एस.एफ. संग्रह और मस्तिष्क cortical explants के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और दोनों चूहों और चूहों के लिए लागू कर दिया गया है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि वेंट्रिकुलर सी.एस.एफ. की अलगाव के लिए विशेष रूप से डिजाइन किया गया था, और सी.एस.एफ. की subarachnoid अंतरिक्ष में संग्रह के लिए इरादा नहीं है.
मस्तिष्क cortical explants के लिए तकनीक के लिए मीडिया के एक कम मात्रा के साथ explants भ्रूण सी.एस.एफ. अलग - अलग प्रयोगों के लिए उपलब्ध की सीमित मात्रा को देखते हुए, विकसित करने में सक्षम होना करने के लिए बनाया गया था. माध्यम की छोटी मात्रा 50 μl explants 24 घंटे के लिए मज़बूती से विकसित किया था. कभी कभी, explants अब की तुलना में 24 घंटा के लिए सुसंस्कृत थे, सबसे लंबे समय तक 72 घंटा होने की अवधि के साथ. अब प्रयोगों के साथ, यह सबसे अच्छा है विकास मीडिया को हर 24 घंटे के पूरक हैं. एक बार गिरफ्तारी explantsसमय की अवधि के लिए वांछित सुसंस्कृत ई, explants immunofluoresence सहित विभिन्न assays के एक नंबर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, पैदा neurospheres, कोशिका मृत्यु, या शाही सेना निष्कर्षण.
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Disclosures
लेखक का घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.
Acknowledgments
हम NIH (पुरस्कार NS072192 MKL R00 संख्या, HD029178 AS.L., और 2 RO1 CAW NS032457) से समर्थन के लिए आभारी हैं. MKL बच्चों के अस्पताल के बोस्टन कैरियर विकास / फैलोशिप हार्वर्ड मेडिकल स्कूल शोर फैलोशिप और अल्फ्रेड पी. स्लोअन फाउंडेशन के एक बंदे के प्राप्तकर्ता है. CAW हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट के एक अन्वेषक है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wiretrop II capillary needles | Drummond Scientific | #5-000-2020 | |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | #184 SIL ELAST kit | |
| Aspirator tube assembly | Sigma | #A5177-5EA | |
| Disposable filter | Venturi or local pharmacy | not available | Standard cigarette filter |
| Roundstock opthalmic knife (15 degree stab knife) | World Precision Instruments, Inc. | #500250 | |
| 35mm glass bottomed culture dish | MatTek Corp. | #P35G-1.5-14-C | |
| Platinum-iridium wire | Tritech Research | #PT-9010-010-3FT | |
| Nuclepore Track-Etch Membrane | Whatman | #09-300-57 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Fisher Scientific | #SH30031.FS | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | #15000-02 |
References
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