Summary
Den ventrikulære cerebrospinalvæsken (CSF) bader neuroepithelial og cerebral kortikale stamceller under tidlig utvikling av hjernen i embryoet. Her beskriver vi en metode utviklet for å isolere ventrikulær CSF fra gnagere embryoer i ulike aldre for å undersøke sin biologiske funksjon. I tillegg viser vi vår cerebral cortical eksplantering disseksjon og kultur teknikk som gjør det mulig for eksplantering vekst med minimale mengder kultur medium eller CSF.
Abstract
CSF er en kompleks væske med en dynamisk varierende proteom hele utvikling og i voksen alder. Under embryonal utvikling, skiller den gryende CSF fra fostervannet på nedleggelse av fremre nevralrøret. CSF-volum øker deretter i kommende dager som neuroepithelial stamceller lining ventriklene og årehinnen plexus generere CSF. De embryoniske CSF kontakter den apikale, ventrikulær overflate av neural stamceller utviklingen av hjernen og ryggmargen. CSF gir avgjørende fluidtrykk for utvidelse av utviklingen av hjernen og distribuerer viktig vekstfremmende faktorer til neurale progenitorceller i temporært-spesifikk måte. For å undersøke funksjonen av CSF, er det viktig å isolere rene prøver av embryonale CSF uten forurensning fra blod eller utviklingsland telencephalic vev. Her beskriver vi en teknikk for å isolere relativt rene prøver av ventrikulær embryonale CSF som kan brukes foret bredt spekter av eksperimentelle tester, inkludert massespektrometri, protein elektroforese, og celle og primær eksplantasjon kultur. Vi viser hvordan å dissekere og kultur kortikale explants på porøse polykarbonatmembraner for å vokse utvikle cortical vev med reduserte volumer av media eller CSF. Med denne metoden kan eksperimenter utføres med CSF fra varierende aldre eller lidelser undersøke den biologiske aktivitet av CSF proteomet på målceller.
Introduction
CSF er en kompleks væske som bader utvikle neuroepithelium 1-6 og gir viktig press 7 og vekstfremmende pekepinner for utviklingen av hjernen 8-12. Å studere CSF i løpet av hjernens utvikling, har vi utviklet teknikker for å isolere ventrikulær CSF fra utviklingsland rotte eller mus embryoer under ulike stadier av utviklingen 6,9. Tidligere metoder for isolasjon inkluderte å bruke et glass mikro-nål og isolere CSF ved hjelp av en mikro-injektor 1,2. Vår metode benytter en glass mikro-kapillær pipette hvis spissen er trukket for å skape en ultrafin punkt for forbedret vev penetrasjon. Glasset mikro-kapillær pipette er koblet til en aspirator, slik at ventrikulær CSF samlingen kan kontrolleres med milde endringer i trykket. Å undersøke stamcelle påvirkninger av CSF signaler, dissekere vi cerebrale kortikale explants, plassere dem på polykarbonatmembraner, og flyte dem på passende cuLTURE medium supplert med CSF prøver 9. Med denne teknikken, reduserte mengder media er tilstrekkelig til kultur vevet, slik at for en effektiv bruk av CSF 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Embryo Isolasjon / preparat
Denne teknikken kan brukes til mus eller rotte. I denne protokollen demonstrerer vi CSF samling teknikk og cerebral cortical eksplantering disseksjon med musen embryonale hjernen. Vi vil kommentere noen viktige forskjeller for rotter versus mus som eksisterer innenfor de generelle teknikker. For den embryonale alder iscenesettelse, er E1 klassifisert som dagen av pluggen for rotter, og E0.5 er klassifisert som dagen av pluggen for mus.
- Forbered en mikro-disseksjon tallerken med Sylgard silikonelastomer. Sylgard 184 silikonelastomer leveres som en todelt væskekomponent, del A og del B. Del A og del B blandes i forholdet 10:1 ved vekt eller volum. Etter de flytende komponenter blandes, hell sylgard elastomer i en petriskål å dekke hele overflaten av tallerken. Noen luftbobler kan være tilstede som vil forsvinne under herdeprosessen. Plasser petriskål lokket på og la elastomeh å kurere. Elastomeren kan bli herdet ved romtemperatur i 24 timer, eller ved høyere temperaturer (f.eks 37 ° C) for raskere herding. Når de flytende komponentene stivner, er disseksjon parabolen klar til bruk. Parabolen kan brukes gjentatte ganger for flere eksperimenter, forutsatt at det er renset godt etter inngrepet.
- Fremstilling av mikro-kapillar pipette (nål). Micro-kapillære pipetter er utarbeidet ved å bruke varme og trekk med en Narishige PC-10 vertikal mikropipette avtrekker med følgende innstillinger: Ett skritt pull, Heater # 2 satt til 58, 100 g trekke vekt. Den fine tuppen av micropipette er nøye klikket av ved hjelp av fine # 55 tang. Den resulterende gjennomsnittlige innvendige diameter nålen er 85 um.
- Forbered aspirator montering for CSF aspirasjon. Sett mikro-stempelet utstyrt med mikro-kapillær pipetter i kapillær nål. Alternativt, feste en plastikk engangsfilter til enden av aspirator rørenheten som er koblet to mikro-kapillær pipette. Skyves nålen gjennom pakningen i stilling på den motsatte enden av aspiratoren sammenstillingen.
- Overfør embryo isolert fra kullet til en mikro-disseksjon parabolen utarbeidet med Sylgard.
- Fjern de ekstra-embryonale membraner og vev slik at embryoet er tydelig eksponert. Hver vev lag, først livmorveggen og deretter decidua-kan dissekert bruke fine iridectomy saks (dvs. Fin Science Verktøy # 15000-02). På hvert implantasjonsstedet, første livmorveggen, deretter decidua kan radert parallelt med den lange aksen av livmoren, og snittet kan så åpnes ytterligere ved hjelp av fine pinsetter. Den decidua kan fjernes etter en lignende snitt, utsette fosterhinnene. Forsiktighet bør utvises slik at fosterhinnene ikke radert eller punktert.
- Vask med steril Hanks balanserte saltløsning (HBSS) og fjerne overflødig væske fra det omgivende embryoet ved hjelp av en pipette, samt en kimwipe eller filterklipt i trekanter.
2. Ventrikulær CSF Collection
- Visualisere embryo under disseksjon mikroskop: for mus, bør embryo være legging på sin side, slik at man har en sagittal visning av utvikling av embryo. Med rotte embryo E16 eller eldre, plassere embryo på sin dorsal ryggsøylen, langs den lengste planar dimensjon, fra en cranial til Caudal retning, som om fosteret ligger på ryggen. På denne måte CSF kan hentes fra både høyre og venstre laterale ventrikkel.
- Stadig setter mikro-kapillære pipetter inn den laterale ventrikkel, mesencephalic ventrikkel eller cisterna magna, forsøker ikke å kontakte neuroepithelial cellene når pipetten er satt inn. For mus embryo E14.5 eller eldre, kan CSF suges fra høyre ventrikkel og deretter nålen fjernes og settes inn i venstre hjertekammer. På grunn av patency av ventriklene og nevralrøret i embryoer yngre enn E14.5, denhele CSF-volum kan ofte aspirated fra den laterale ventriklene med en enkelt nål innsetting. Men dette er ikke alltid tilfelle som utviklingsmessig tider og patency av forbindelseselementene ventriklene kan variere litt, og derfor kan den mikro-kapillær pipette også settes inn i cisterna magna å samle maksimal CSF volum.
- Når mikro-kapillær pipette settes inn i laterale ventrikkel, mesencephalic ventrikkel eller cisterna magna, nøye og forsiktig begynne aspirering CSF inn i pipetten, enten ved hjelp av mikro-stempelet for å skape undertrykk og aspirere CSF, eller ved å tilveiebringe en milde undertrykk skapt av munnen slik at CSF begynner å forsiktig strømme inn i mikro-kapillær pipetten i en langsom og kontrollert måte. Vi anbefaler at betrakteren sjekker med egne lokale tjenestemenn om institusjonelle politikk på disse tilnærmingene.
- Fortsette å gjelde undertrykk og samle CSF inn i mikro-kapillær pipette.I både mus og rotte embryoer fra E16.5/E17 eller yngre, er det mulig å observere ventrikkelen kollaps litt ved utseendet av en divot forming på siden av hodet at mikro-kapillær pipette er i. I eldre embryoer, på grunn av større størrelse av hjernen, kan det ikke være mulig å observere hodet kollapser.
- Stopp legge press og fjern forsiktig mikro-kapillær pipette fra den laterale ventrikkel.
- Forsiktig utvise CSF prøven inn en Eppendorf rør som har blitt avkjølt på is.
- Fortsette å samle CSF fra en hel kull av dyr og basseng prøvene i samme rør.
- Sentrifuger ved 10.000 xg ved 4 ° C i 10 min for å fjerne eventuelle kontaminerende celler.
- Analysere prøvene for noen tegn til forurensende neuroepithelial celler eller røde blodceller. Er forurenset er vanligvis angitt med fluidet vises skyet eller rød / rosa, eller tilstedeværelse av en pellet med en blod tinged spot. Etter sentrifugering, CSF kan analyseres mikroskopisk for noen bevis for celler eller cellulære rusk. Hvis det er tegn på forurensning væsken skal kastes. Som en ekstra kontroll kan pellet innholdet også være farget for celler. En ren CSF prøve kan brukes for cellekultur, kortikal kultur, spektrometri, western blot, ELISA og andre analyser. Den klare CSF bør overføres til en ny steril Eppendorf-rør. Prøven kan nå brukes for analyse, samles med andre prøver, eller snap frosset med flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C. Frysing og tining av små prøver av fluid kan føre til et lite volum nedgang og endringer i proteinkonsentrasjon. Dette kan unngås ved frysetørking prøvene.
3. Kortikale Eksplantasjon Dissection
- Overfør E14.5 embryo isolert fra kullet til en mikro-disseksjon parabolen utarbeidet med Sylgard.
- Fjern embryo fra ekstra-embryonale membraner og vev som beskrevet i trinn 1.5. <li> Vask med steril Hanks balanserte saltløsning (HBSS) og fjerne overflødig væske fra det omgivende embryoet ved hjelp av en pipette.
- Dissekere gjennom nakken skille hodet fra resten av embryoet (figur 1A).
- Ved hjelp av en fin skalpell (ophthalmic kniv), kutte ned midtlinjen av hodebunnen. Gripe hver side av dette innsnitt med fine pinsett og fjerne huden. Deretter bruker iridectomy saks til å gjøre et snitt som går langs midtlinjen av å utvikle kraniet. Deretter gjør ytterligere to snitt, ca 1/3 av avstanden fra fremre og bakre ender i utviklingsland skallen. Bruke fine tang til å gripe de "flaps" av kraniet som følge av denne delen av disseksjon, og fjern utvikle skallen vev, utsette cortex (figur 1B).
- Bruke skalpell halvere hjernen langs midtlinjen i midten sagital flyet, skiller høyre og venstre kortikale halvkule (Tall1B, C). Pia og araknoide er igjen knyttet til hjernebarken, og dura fjernes sammen med utviklingslandene skallen.
- Forberede hver kortikale halvkule separat. Plasser halvkule mediale side opp slik at du kan se ganglieblokkere eminence og utvikle cortex (figur 1C, D).
- Bruke skalpell, gjør en koronale snitt gjennom kortikale neuroepithelium Caudal til å utvikle luktelappen. Dette snittet skal begynne på den fremre grensen av laterale og mediale ganglieblokkere eminenser, og strekker seg gjennom den fremre cingulate regionen utviklingsland kortikale rudiment (Figur 1E).
- Foreta en ny koronale snitt bare Caudal til bakre grensen av lateral ganglieblokkere eminense (Figur 1F). Dette snittet skal også strekke seg fra den laterale grensen av ganglieblokkere eminense til den mediale veggen av å utvikle kortikale rudiment.
- Trekke kortikale "klaff" created av de to snittene er gjort i trinn 3.7 og 3.8, med en skalpell eller milde press fra en strøm av HBSS leveres med en 200 pl pipetten for å unngå mekaniske skader på hjernebarken. Deretter foreta en tverrgående snitt langs grensen skille laterale Ganglionic eminense fra utviklingslandene cortex (figur 1G, H). Deretter dissekere bort fremkallende hippocampus og kortikale hem av mediale telencephalon, på toppen av neocortex der den laterale kortikale overflaten oppfyller interhemispheric veggen.
- Foreta en tverrstilt innsnitt langs grensen skille laterale Ganglionic eminense fra utviklingslandene cortex (figur 1H).
- Fjern eventuelle ekstra dissekert vev som er på Sylgard plate fra den dissekerte kortikale eksplantering. Man kan bruke milde pipettering med fersk HBSS buffer for å pipettere bort noen ekstra dissekert vev. Den dissekerte cortex er nå med meningeal ned (figur 1I).
- Utarbeide en platina wire loop koblet til et glass pipette. Varm glasset pipette med en brettet platinatråd innsatt i enden av glasset pipetten. Ved å vri enden av platinatråd loop, kan størrelsen av løkken økes eller reduseres, og løkken kan bli formet for å passe størrelsen av eksplantasjon ønsket. (Dette kan være forberedt på forhånd og gjenbrukes.)
- Varme enden av platinatråd å sterilisere loopen.
- Isolere dissekert cortical eksplantering og fjerne ekstra HBSS media ved forsiktig pipettering, og etterlater en liten mengde som skal brukes med wire loop.
- Plasser en 1 cm polykarbonatmembran i en 4 cm diameter bildebehandling parabolen.
- Bruke siden av platina wire loop, forsiktig snu cortex slik at meningeal siden vender opp.
- Løft kortikale eksplantasjon av disseksjon parabol, ved å plassere eksplantasjon midt av loopen og bruke den iboende hydrostatiske krefter tilLøft eksplantering på et plan.
- Påfør eksplantering på polykarbonatmembran, og løft platina wire loop bort slik at eksplantering forblir på membranen på et plan med den ventrikulære overflaten å ta kontakt med membran.
- Løft forsiktig membranen og pipetter 50 pl CSF eller andre medier under membranen.
- Dekker imaging parabol, plassere den i en fuktet sekundær beholder, og inkuber ved 37 ° C i 5% CO 2 i 24 timer å støtte fortsatt celleproliferasjon og eksplantasjon vekst. Fig. 2 viser en skjematisk av den endelige kortikale eksplantasjon parabolen forberedelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CSF samlingen skal gi en klar, gjennomsiktig væske. Det bør ikke være tegn til forurensning fra blod, som demonstrert av en rød eller gul farget væske i aspirer og i Eppendorf tube. Det bør også være noe bevis for vev i aspirat og Eppendorf tube. Når CSF sentrifugeres, kan man også vurdere CSF mikroskopisk for å sikre at det er ingen forurensning. Hvis det er tegn på forurensning bør CSF kastes. Fra en E14.5 mus kull, kan man forutse samle 10-15 ul CSF. Tabell 1 viser gjennomsnittlig volum av CSF samlet inn fra gjennomsnittlig kullstørrelse på både mus og rotter fra ulike embryonale aldre. Når rene CSF prøver er samlet, kan CSF bli analysert ved hjelp av en rekke forskjellige teknikker. Fig. 3 viser et representativt sølv farget under anvendelse 2UG av musen E14.5 CSF.
Cerebral cortical explants kan dyrkes viddh varierende volumer av CSF pluss en basalmedium behov slik at det totale volumet er 50 pl. Figur 4 viser representative eksplanter dyrket med 50 pl 100% embryonale CSF i 24 timer. De eksplanter har vist seg å overleve og formere med 100% CSF og har vev histologi ligner gnagere embryoer samtidig gestasjonsalder 9, som indikert ved immunreaktivitet til fosfo-histon H3 (PH3), en markør for celledeling, langs ventrikulære overflate, BrdU, en markør av DNA syntese, innlemmelse langs ventrikulær sonen og Tuj1, en neuronal markør, i utviklingsland kortikale plate.
| Sprague Dawley kullet Embryonale Age | Volum per kull | CD1 kull Embryonic Age | Volum per kull |
| E13 | 30-50 ul | E10.5 | 15-20 ul |
| E14 | 40-75 ul | E12.5 | 15-20 ul |
| E16 | 50-90 ul | E14.5 | 10-15 ul |
| E18 | 40-75 ul | E16.5 | 5-10 ul |
Tabell 1. Gjennomsnittlig Volum av CSF innhentet fra standard størrelse Kull.
Figur 1. Skjematisk Disposisjon Cerebral Cortical Eksplantasjon Dissection.
Figur 2. Prinsippskisse av Final parabolen forberedelse.
Figur 3. Sølv flekk av mus E14.5 CSF. Dette er et representativt Silver flekk av 2UG mus E14.5 CSF protein kjøre på 4-12% Bis-Tris NuPAGE gradientgel fra Invitrogen. Sølv flekken gjort med SilverQuest sølv flekker kit utviklet i 5 min 40 sek.
Figur 4. E15 rotte kortikale explants dyrket i 24 timer. Disse er representative bilder av cerebral kortikale explants dyrket i 24 timer i 100% embryonale CSF. Disse explants har blitt løst ved Carnoy metode, parafin seksjonert, og forberedt for farging. PH3 (rød), og Tuj1 (grønn), BrdU (blå).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne fremgangsmåte for ventrikulær CSF samlingen har gitt relativt rene prøver av embryonale CSF med stabil proteinkvalitet og konsekvent aktivitet i en rekke cellulære analyser 9. Med en god samling teknikk og kullstørrelse av ti E14.5 mus, kan man forvente å samle 10-15 ul CSF, og fra et kull på E16 rotter, kan man forvente å samle ca 50-90 ul CSF. Denne samlingen teknikken reduserer forurensning fra blod og vev, ved nøye observasjon, sentrifugering, og utkast av prøver med noen bevis for mobilnettet rusk eller blod skjær. Vi har analysert fluidet mikroskopisk for å vurdere for cellulær rusk eller celler i CSF etter sentrifugering, og fant at prøver som har ingen pellet etter sentrifugering er fri mot cellulær kontaminering. I motsetning til proteomet av utviklingen hjernevev eller prøver av forurenset CSF (data ikke vist), ved hjelp av denne metoden for CSF utvinning,CSF proteomet ikke inneholde noen mitokondrie proteiner når de analyseres med et massespektrometer 6.
Basert på den fysiske lokalisering av den ventrikulære CSF innenfor telencephalic vesikler og nevralrørsdefekter, den eneste metoden for isolasjon er å pierce gjennom utvikling huden, skallen, og telencephalon. Derfor er nålestikk gjennom disse vev en kilde for mulig forurensning. Spissen av nålen bør være så tynn som mulig, slik at nålen kan innføres jevnt gjennom vevet og inn i ventrikkelen. Den mikro-kapillære pipette kan samle vev inne i boringen av nålen under innføring av nålen inn i ventrikkelen. Avhengig av alderen av embryoet, og hvis choroid plexus har utviklet innen ventrikkelen, er det viktig å ikke aspirate innholdet i choroid plexus inn i pipetten. Imidlertid er det viktig å skape tilstrekkelig undertrykk slik at CSF samler inn tHan pipette uten å forstyrre omgivelsene utvikle hjernevev eller årehinnen plexus. Tilstedeværelsen av vev forurensning kan bli visualisert under disseksjonsmikroskop, ved pipettering CSF på en glass-slide med et glass dekkglass og direkte visualisering for cellulær rusk.
Metodene vi beskriver for CSF isolasjon gir relativt rene prøver av CSF som vi har besluttet å date. Når kjente kontaminerte CSF prøver har blitt analysert ved hjelp av massespektrometri, har de viste nærvær av mitokondrie proteiner (data ikke vist). En iboende feil i teknikken er at CSF oppnås ved punktering fremkallende skallen og cortex, og derfor celler og vev kan være til stede i CSF. Ved sentrifugering CSF, assay for en pellet, og mikroskopisk analyse CSF under mikroskop, har vi optimalisert en fremgangsmåte for CSF isolasjon som gir relativt rene prøver av CSF.
Teknikken feller ventrikulær embryoniske CSF samling og cerebrale kortikale eksplanter har blitt beskrevet og vist i filmen for en embryonisk mus. Imidlertid kan denne teknikken brukes for ventrikulær CSF innsamling og cerebrale kortikale eksplanter fra alle embryonale gnagere og har vært brukt på både rotter og mus. Metoden beskrevet i denne protokollen ble utviklet spesielt for isolering av ventrikulær CSF, og er ikke beregnet for samling av CSF i subaraknoidalrommet.
Teknikken for cerebrale kortikale eksplanter ble opprettet for å være i stand til å vokse med en eksplanter redusert volum av media, gitt begrensede mengder av embryonale CSF tilgjengelig for individuelle eksperimenter. Den minste volum av mediet som brukes til å dyrke eksplanter pålitelig i 24 timer var 50 ul. Innimellom, ble eksplanter kultivert for lenger enn 24 timer, med den lengste perioden som 72 timer. Med lengre eksperimenter, er det best å supplere vekstmedier hver 24 time. Når explants are kultivert for ønsket tidsperiode, kan eksplanter brukes til en rekke ulike tester, inkludert immunofluoresence, genererer neurospheres, celledød, eller RNA ekstraksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for støtten fra NIH (Award tall R00 NS072192 til MKL, HD029178 til AS.L., og 2 RO1 NS032457 til CAW). MKL er mottaker av Barnas Hospital Boston Karriereutvikling Fellowship / Harvard Medical School Shore Fellowship og en Fellow av Alfred P. Sloan Foundation. CAW er en etterforsker av Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wiretrop II capillary needles | Drummond Scientific | #5-000-2020 | |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | #184 SIL ELAST kit | |
| Aspirator tube assembly | Sigma | #A5177-5EA | |
| Disposable filter | Venturi or local pharmacy | not available | Standard cigarette filter |
| Roundstock opthalmic knife (15 degree stab knife) | World Precision Instruments, Inc. | #500250 | |
| 35mm glass bottomed culture dish | MatTek Corp. | #P35G-1.5-14-C | |
| Platinum-iridium wire | Tritech Research | #PT-9010-010-3FT | |
| Nuclepore Track-Etch Membrane | Whatman | #09-300-57 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Fisher Scientific | #SH30031.FS | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | #15000-02 |
References
- Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development. Developmental Biology. 83 (1), 193-200 (1981).
- Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A. Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos. Journal of Experimental Zoology. Part A, Comparative Experimental Biology. 301 (4), 280-289 (2004).
- Gato, A., Moro, J. A., Alonso, M. I., Bueno, D., Mano, D. L., Martin, C. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 284 (1), 475-484 (2005).
- Parada, C., Gato, A., Aparicio, M., Bueno, D. Proteome analysis of chick embryonic cerebrospinal fluid. Proteomics. 6 (1), 312-320 (2006).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome. Journal of Proteome Research. 4 (6), 2420-2428 (2005).
- Zappaterra, M. D., Lisgo, S. N., Lindsay, S., Gygi, S. P., Walsh, C. A., Ballif, B. A. A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid. Journal of Proteome Research. 6 (9), 3537-3548 (2007).
- Desmond, M. E., Jacobson, A. G. Embryonic brain enlargement requires cerebrospinal fluid pressure. Developmental Biology. 57 (1), 188-198 (1977).
- Lehtinen, M. K., Walsh, C. A. Neurogenesis at the brain-cerebrospinal fluid interface. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 653-679 (2011).
- Lehtinen, M. K., Zappaterra, M. W., Chen, X., Yang, Y. J., Hill, A. D., Lun, M., Maynard, T., Gonzalez, D., Kim, S., Ye, P., et al. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69 (5), 893-905 (2011).
- Martin, C., Alonso, M. I., Santiago, C., Moro, J. A., De la Mano, A., Carretero, R., Gato, A. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. International Journal of Developmental Neuroscience: The Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 27 (7), 733-7340 (2009).
- Martin, C., Bueno, D., Alonso, M. I., Moro, J. A., Callejo, S., Parada, C., Martin, P., Carnicero, E., Gato, A. FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells. Developmental Biology. 297 (2), 402-416 (2006).
- Zappaterra, M. W., Lehtinen, M. K. The cerebrospinal fluid: regulator of neurogenesis, behavior, and beyond. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 69 (17), 2863-2878 (2012).
