Summary
在这里，我们描述了两个实验，已建立了学习年龄依赖性的多巴胺（DA）神经元的神经退行性疾病
Abstract
果蝇是一种有价值的模式生物，研究在神经系统的衰老和退行性病理过程。飞作为一个实验系统的优势包括其遗传的可追踪性，寿命短，观察和定量分析复杂的行为的可能性。在特定神经元群体的果蝇脑疾病相关的基因的表达，可以用来模拟人类神经变性疾病如帕金森氏症和阿尔茨海默氏症的5。
多巴胺（DA）神经元是最脆弱的神经元群体在人类大脑的老化。在帕金森氏病（PD），最常见的神经退行性运动障碍，加速多巴胺神经元丢失导致一个渐进的和不可逆的运动功能下降。除了年龄和暴露于环境毒素，加剧了特定的基因突变在编码多巴胺神经元丢失或几个基因的启动子区域的。这样的PD相关的等位基因的鉴定果蝇作为模型来研究神经退行性疾病的DA神经元在体内的利用提供了实验依据。例如，表达的PD联的人α-突触核蛋白基因在果蝇 DA能神经元的概括人类疾病的一些特点， 例如逐步多巴胺神经元丢失和运动功能下降，2。因此，这种模式已经被成功地用于识别潜在的治疗靶点，PD 8。
在这里，我们描述了两个实验，通常被用来研究果蝇 DA能神经元年龄相关的神经退行性疾病：攀岩惊吓引起的负趋地响应和整个成人脑酪氨酸羟化酶免疫的基础上安装检测监控DA能神经元的数量在不同的年龄段。在这两种情况下， 在体内表达的UAS吨ransgenes，特别是在DA能神经元，可以实现使用酪氨酸羟化酶（TH）启动子-Gal4的驱动线3，10。
Introduction
这里描述的检测的特异性依赖于使用的Gal4的利用，以达到特定的多巴胺能神经元中的表达3的酪氨酸羟化酶基因的调节序列的飞线。酪氨酸羟化酶催化的第一和多巴胺合成的限速步骤。 TH免疫反应性在成体果蝇脑中多巴胺，TH一个很好的候选，以确定在体内的多巴胺神经元（见实施例6）重叠。此外，比其他Gal4的线（如DdcGal4），其中包含从多巴脱羧酶基因的调节序列，并驱动转基因的表达不仅在DA能神经元更具体的表达模式THGal4，而且在5 -羟色胺能神经元和神经胶质细胞3的子集。
Feany和德尔（2000）首次观察到泛神经元的PD联的人α-突触核蛋白基因的表达逐渐丧失站加速的诱导rtle的负趋地在果蝇的行为， 我们已经观察到了类似的结果，使用的DA神经元特异性THGal4线驱动expressionof的α-突触核蛋白基因10，使用这个功能读出Nrf2与途径研究的神经保护作用，在此果蝇的PD模型14。使用此处所描述的具体的测定适于从2和3。
果蝇的大脑包含超过100个DA能神经元，安排至少 在5个不同的集群（PPL1 PPL2，PAL，/ 2 PPM1，PPM3）全脑坐骑可以可视化激光共聚焦显微镜（例如11和7）。然而，不论是否在果蝇脑年龄下降，9号，11多巴胺神经元的数目;年龄依赖性的神经退行性疾病中观察到的苍蝇PD-连锁基因已突变/过度人类疾病模型，目前仍有争议5。 DA能神经元中的表达人类α-共核蛋白就有这样的效果，因此，已被用来作为帕金森病的模型。在这里，我们描述了一个检测DA能神经元计数安装使用全脑TH细胞标记。此法是改编自13和10。
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Protocol
1。惊吓引起的负趋地性含量
- 选择所需的基因型的苍蝇，他们按性别分开，随机分组同伙20-30动物和它们翻转到新的食品瓶，每2-3天;测试每一组的苍蝇（ 即年龄相匹配的队列，队列/基因型）至少每星期一次。
- 负趋地性测试前30分钟，麻醉苍蝇与CO 2，并将其放置在预先标记的透明塑料管有两个空的食品瓶（见材料表 ）加入在他们的开口处用透明胶带（室尺寸：19厘米×2.85厘米）。在我们的分析中，我们通常使用25苍蝇/管。
注意：从麻醉中恢复的时间可从几分钟到几个小时的变化（ 例如，O / N），应优化测试的特定基因型。 - 马克不同的高度（从1到20厘米），在一个垂直的表面活性一片吸墨纸和磁带的文件E，垂直于板凳上。
- 在前面的纸张，将反应管：管应该是所有对齐，并尽可能接近纸张，以便精确的高度测量。
- 管前，将数码相机（见“特种设备”表）的距离为20-30厘米，从纸张上的立场（ 如枪头盒），选择“电影”选项，并开始记录，在这个时候，你也应该启动一个定时器，以保持轨道之间的时间间隔连续试验。
- 让苍蝇为几秒钟（ 例如 10秒）通过敲击管收集在试管底部的。这一步应该一致（ 即相同的时间，相同的强度，同一个运营商）进行整个实验。
- 记录果蝇的运动，持续10秒的数码相机。
- 重复步骤1.5-1.7 14倍，在一分钟的间隔。
- 分析数据：
- 数一数，上面的苍蝇2厘米10秒大关之后，通过视觉检查的记录电影。
注：在我们的实验条件下，果蝇的负趋地行为没有最后超越了前10秒后，令人吃惊的（ 即苍蝇开始在各个方向移动，10秒后他们惊人的）。控制苍蝇（ 即 1周龄的苍蝇表达THGal4的驱动，看到传说中的图1），在这个时间窗口攀升的最小距离为2厘米。因此，我们使用了2厘米，分析登山活动的苍蝇不同年龄，不同基因型10秒后启动的行为作为参考。这些参数可能需要调整到帐户为行为试验苍蝇的差异（例如，由于不同的遗传背景或实验室条件下）。请注意，在我们的实验条件下，所有的基因型测试表现较差或类似的控制基因型的苍蝇。 - 取平均的结果，从15个试验。
- 测试每种基因型的独立队列的数量快速平均值作为在管内蝇的总数（=爬％活性）的百分比，重复的次数（N）由下式给出
- 评估不同基因型之间的统计学意义随着时间的推移。这可以通过与学生的t检验（当比较两个基因型）或2路单因素方差分析，随后由邦费罗尼事后测试（当进行多重比较）使用商业软件，如GraphPad（GraphPad软件，Inc.La拉霍亚， CA，USA）。
- 数一数，上面的苍蝇2厘米10秒大关之后，通过视觉检查的记录电影。
注意
进行检测，在同一时间的一天，在室温下，在相同的光照条件下。苍蝇在一个12小时的光/暗周期环境保持最好控制昼夜节律对果蝇的自发行为的效果。
2。酪氨酸羟化酶免疫全脑底座的含量
解决方案和缓冲区
固定液：4％多聚甲醛（PFA）在磷酸盐缓冲盐水（PBS）
洗涤缓冲液：0.1％的Triton X-100的PBS中
阻断缓冲液：0.1 M，pH为7.5的Tris-HCl，0.15M的NaCl，0.1％的Triton X-100和0.5％牛血清白蛋白
安装媒体的Mowiol DABCO（见在哈洛E，D.巷抗体实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY，USA，10:418（1988协议））
程序
- 约1分钟，除去角质层蜡填充用70％乙醇在解剖盘认苍蝇。
- 转让过得充满了冰冷的PBS到另一个解剖盘。
- 解剖大脑：
- 将飞腹侧（可选：删除的翅膀和腿）。
- 拉人头离身：使用一个设置钳持有的身体和另一个到角质层下的眼睛，以防止损坏大脑
- 删除长鼻。
- 保持处于打开状态后，取出长鼻的狭缝的相对侧上的头的角质层，并在相反的方向拉，直到大脑中删除从头部日本。
- 从大脑中删除所有的角质层。
- 卸下所有充气的气管组织，这将阻止大脑漂浮在以下孵化步骤。
- 关的P-200的移液管尖的前端切几毫米，用0.1％的Triton X-100/PBS溶液和平衡
- 使用制备的P-200移液管尖，脑转移到0.5ml的Eppendorf管中填充用0.5ml的4％PFA / PBS中，并保持在冰上，直到完成剥离。
- 修复的大脑在室温下20分钟：把Eppendorf管机架和机架放置一个nutator申请一个温柔的旋转。
- 删除固定液使用P-1000微量移液器，加0.5毫升0.1％的Triton X-100/PBS的，颠倒混匀，我们一起孵育1分钟;重复这种洗涤步骤一次。
- 删除缓冲区第二次洗涤，加0.5毫升0.1％的Triton X-100/PBS的，让在室温下孵育20分钟，重复此步骤两次。
- 卸下清洗缓冲液，并让大脑在封闭缓冲液孵育1小时，在RT（0.1中号的Tris-HCl，pH值7.5，0.15M的NaCl，0.1％的Triton X-100和0.5％BSA）。
- 孵育的大脑与封闭液1:100稀释的抗TH抗体（见“表特定的试剂”），两天，在4°C，轻轻旋转（见第2.6步）。
- 重复洗涤步骤2.7。和2.8 ..
- 两天的大脑平衡与二次antibodyin封闭液1:200稀释，在4°C，轻轻旋转。
- 重复洗涤步骤2.7。和2.8 ..
- 如图2A所示，准备安装滑轨：
- 一西元2×25微升滴安装媒体的盖玻璃（24×60毫米，1.5）。
- 将两个玻璃盖片（尺寸为18×18毫米，第2期）上的安装媒体留在中间的间隙的滑动，让干。
- 取出洗涤液，加入50微升的安装介质，并让大脑平衡上下吹打。
- 使用切P-200移液管尖（见步骤2.4），脑转移两个盖玻片之间的空间中滑动并与盖玻片覆盖。 1.5（ 见图2A;定位在幻灯片上看到的大脑7）。
注：样品被安装在两个盖玻片之间，以允许可视化的前，再行rior一侧大脑。 - 从一个角落里，除去所有的空气填充整个空间安装媒体之间的封面眼镜吸管，让干燥和密封用指甲油。
- 为了评估特定集群中的多巴胺能神经元的数目，获得了一系列用1.0μm的步长用激光共聚焦显微镜（解剖识别在果蝇成人脑的多巴胺能集群的7）沿z轴的光学部分。
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Representative Results
我们这里描述的实验研究的应力的作用，保护Nrf2的途径在果蝇模型的PD 14。此模型依赖于使用一个TH Gal4的驱动器2，10中的多巴胺神经元的人类α-共核蛋白基因的表达。
图1示出了代表性的结果惊吓引起的负趋地性（攀登）检测对TH Gal4的驱动程序的控制下，表达不同的外源基因在雄蝇。测试所有的基因型表现出运动活性下降，随着时间的推移，但是，苍蝇表达PD-相连，人α-突触核蛋白转基因呈现加速下滑相对年龄匹配的控制苍蝇（TH Gal4的单独驱动）或飞共同表达Nrf2的DNA绑定合作伙伴MAF-S。雌蝇中观察到了类似的结果。
图2示出了代表性的结果为TH的基于免疫的DA神经元计数。不同的遗传背景的PPL1从4周龄雄性苍蝇大脑中神经元的数量上的影响进行量化，为图中的图例说明。注意从苍蝇的PPL1大脑中的神经元表达α-突触核蛋白小，但意义重大损失。
图1。惊吓引起的负趋地性试验。同伙与年龄匹配的苍蝇所指示的基因型进行了测试自发活动，在为期一周的时间间隔。登山活动进行了计算和计数的苍蝇数量超过2厘米的标记10秒后攻小瓶，装在小瓶内的苍蝇总数的百分比，并表示这个值。数据显示指±SEM五个独立的同伙20-30苍蝇。用双因素方差分析邦弗朗尼事后检验（P <0.05），评估意义。所不同的之间TH，α-Synflies和苍蝇的其他三种基因型测试是显着的，在第4周和第5周。
图2。 DA能神经元TH免疫荧光检测和计数。A.流程图说明大脑准备幻灯片的协议。如需更详细的描述每个步骤，请参阅文本。B.代表整个大脑安装的显微照片（右hemibrain，后视图）TH免疫染色。一组共聚焦Z系列图像被收购徕卡SP2共聚焦显微镜，40X客观油（N / A 1.25），平均2帧，步长1微米，在1024×1024格式，并编译成一个最大投影（示出）。该位置被高亮显示。的PPL1 DA神经元集群C.代表RESU的它的DA神经元计数使用TH免疫。神经元在PPL1集群的数量进行了评估，通过检查每个聚焦Z系列，N代表的个别影像独立样本的数量分析各基因型。数据是指±SEM意义进行了评估与学生的t检验（P <0.05）。 点击这里查看大图 。
基因型：'体质'，THGal4 / + THGal4 / +'UAS-SYN，THGal4，UAS
-αSynuclein/ +; THGal4，UAS-αSynuclein的/ +'UAS-MAF-S'，THGal4/UASMaf-S; THGal4 / +的UAS-αSYN / UAS-MAF-S'，THGal4 UAS-αSynuclein/ -S UASMaf; THGal4，UAS-αSynuclein的/ +'KEAP1 EY5，THGal4 / +; THGal4/keap1 EY5; UAS-αSyn/keap1 EY5'，THGal4，UAS-αSynuclein的/ +，THGal4，无人机-αSynuclein/keap1EY5。
[转载巴罗等人，2011）在“开放访问”策略“疾病模型和机制”的协议。]
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Discussion
这里描述的检测提供了一个有用的方法来研究特定基因的作用，信号转导通路或小分子化合物在维护DA能神经元的老化，以及在不同的疾病与遗传背景（5审阅）。
惊跳果蝇行为引起的负趋地性，已被广泛用于作为PD-连锁突变的存在下，特别是在不同的遗传背景中的多巴胺神经元的功能的官能读出。在不同的研究中已观察到一些差异（见12，用于更详细的讨论）。这些都被归咎于至少部分不同的分析集和条件，包括测试每管数量的苍蝇（单与果蝇的队列飞），CO 2介导麻醉后恢复的时间和数量连续试验（见4和11作为例子二都不尽相同检测设置）。因此，它可能是可取的控制等的参数，如果有必要优化其特定的检测要求。
DA能神经元TH免疫染色/激光共聚焦显微镜的量化已经使用交替使用的方法基于的驱动THGal4 GFP表达和DA能神经元GFP荧光/共聚焦显微镜鉴定。这两种方法给出比较的结果在大多数情况下，然而，在一般情况下，优选由我们和其他研究者对TH免疫染色技术，因为它是敏感的多巴胺神经元的功能状态。如需更详细的比较，见11和10。此法可辅以测量飞头匀浆中的多巴胺水平[见1为例。
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Disclosures
我们声明，我们没有竞争经济利益。
Acknowledgments
飞股票我们利奥Pallanck感谢，恭索莫斯技术援助和P. Sykiotis耶拉西莫斯有益的讨论。这项工作是由美国国立卫生研究院资助的培训补助T32CA009363 MCB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody | Millipore | AB152 | |
| Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-026-152 | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| DABCO | Sigma | D2522 | |
| Equipment | |||
| Polystyrene vials | VWR | 89092-734 | 28.5 x 95 mm |
| Digital camera | Canon | PowerShot A3100IS (model) | 12.1 Megapixels 4X Optical Zoom |
| Glass coverslips no. 1.5 | VWR | 48366 205 48393 252 | Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm |
| Glass coverslips no. 2 | VWR | 48368-040 | Size: 18 x 18 mm |
| Dissection dishes | Electron Microscopy Sciences | 70543-01 | Size: 30 mm O.D. |
| Dumostar No. 5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72705-01 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 (model) | |
| Confocal microscope | Leica | SP2 or SP5 (model) | |
Materials Table. |
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References
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