Summary
Här beskriver vi två analyser som har inrättats för att studera åldersberoende neurodegeneration av dopaminerga (DA) neuroner i
Abstract
Drosophila melanogaster är en värdefull modell organism för att studera åldrande och sjukliga degenerativa processer i nervsystemet. Fördelarna med fluga som ett experimentellt system inkluderar dess genetiska spårbarhet, kort livslängd och möjligheten att observera och kvantitativt analysera komplexa beteenden. Uttrycket av sjukdom-länkade gener i specifika neuronala populationer av Drosophila hjärnan, kan användas för att modellera mänskliga neurodegenerativa sjukdomar som Parkinsons och Alzheimers 5.
Dopaminerga (DA) nervceller är bland de mest sårbara neuronala populationer i den åldrande människans hjärna. Vid Parkinsons sjukdom (PD), den vanligaste neurodegenerativa rörelsestörningar, leder den accelererade förlusten av DA neuron till en progressiv och irreversibel nedgång i rörelseapparaten funktion. Förutom ålder och exponering för miljögifter, är förlust av DA neuron förvärras av specifika mutationer i den kodandeeller promotorn regioner i de olika gener. Identifieringen av sådana PD-associerade alleler ger den experimentella grunden för användningen av Drosophila som en modell för att studera neurodegeneration i DA nervceller in vivo. Till exempel uttrycket av PD-länkade humant α-synuklein gen i Drosophila DA nervceller rekapitulerar vissa funktioner i den mänskliga sjukdomen, t.ex. progressiv förlust av DA neuron och minskande motorisk funktion 2. Följaktligen har denna modell använts framgångsrikt för att identifiera potentiella terapeutiska mål i PD 8.
Här beskriver vi två analyser som ofta har använts för att studera åldersberoende neurodegeneration av DA nervceller i Drosophila: a klättring analys baserad på spritta-inducerade negativa geotaxis respons och tyrosinhydroxylas immunfärgning av hela den vuxna hjärnan fästen för att övervaka antalet DA nervceller vid olika åldrar. I båda fallen, in vivo-expression av UAS transgenes bestämt i DA-neuroner kan uppnås genom användning av en tyrosinhydroxylas (TH)-promotor-Gal4 föraruppställning 3, 10.
Introduction
Specificiteten av analyserna beskrivs här förlitar sig på användningen av en Gal4 fluglina som utnyttjar de regulatoriska sekvenserna av tyrosinhydroxylas genen för att uppnå specifika uttryck i dopaminerga neuroner 3. Tyrosin hydroxylas katalyserar det första och hastighetsbegränsande steget i dopaminsyntes. TH immunoreaktivitet i de vuxna överlappar flyga hjärnan med den hos dopamin, vilket gör TH en bra kandidat för att identifiera DA-neuroner in vivo (se till exempel 6). Dessutom är uttrycksmönstret av THGal4 mer specifik än den hos andra Gal4 linjer såsom DdcGal4, som innehåller regulatoriska sekvenser från dopadekarboxylas genen och driver transgent uttryck inte bara i DA-neuroner, men också i serotoninerga neuroner och delmängder av gliaceller 3 .
Feany och Bender (2000) konstaterade först att pan-neuronala uttryck av PD-länkade humant α-synuklein gen accelererar gradvis förlust av startle-inducerad negativ geotaxis beteende i Drosophila. Vi har observerat liknande resultat med användning av DA-neuron specifik THGal4 linje att driva expressionof en α-synuclein-transgenen 10 och används denna funktionella utläsning för att studera den neuroskyddande roll Nrf2 banan i detta Drosophila modell av PD 14. Den specifika analys som beskrivs här är anpassad från 2 och 3.
Den Drosophila hjärnan innehåller mer än 100 DA-neuroner, arrangerade i åtminstone fem olika kluster (PPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3) som kan visualiseras i hela hjärnan monteringar genom konfokal mikroskopi (se till exempel 11 och 7). Det är fortfarande kontroversiellt huruvida antalet DA nervceller i Drosophila hjärnan avtar med åldern 9, 11, men är åldersberoende neurodegeneration observerats i flugor där PD-länkade gener har muterat / overexpresseds att modellera mänskliga sjukdomarFem. Uttrycket av humant α-synuklein i DA nervceller har en sådan effekt och, följaktligen, har använts som en modell för PD. Här beskriver vi en analys för DA nervceller räknas i hela hjärnan monterar använder TH som en cell markör. Denna analys har anpassats från 13 och 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Startle-inducerad Negativ geotaxis Assay
- Välj flugor av önskad genotyp, separera dem med kön, slumpmässigt gruppera dem i kohorter av 20-30 djur och vända dem till nya livsmedel flaskor var 2-3 dagar, testa varje uppsättning av flugor (dvs. åldersmatchade kohorter, en kohort / genotyp) minst en gång i veckan.
- Trettio minuter innan den negativa geotaxis testet, söva flugor med CO 2 och placera dem i pre-märkta tydliga plaströr gjorda med två tomma mat injektionsflaskor (se Material tabell) förenade vid sina öppningar med genomskinlig tejp (kammardimensionerna: 19 cm x 2,85 cm). I våra analyser använder vi oftast 25 flugor / rör.
Anm. Återhämtningen tid från anestesi kan varieras från några minuter till flera timmar (t.ex. O / N) och bör vara optimerade för de testade specifika genotyperna. - Markera olika höjder (från 1 till 20 cm) på en bit läskpapper och tejpa papper på en vertikal surface, vinkelrätt mot bänken.
- Placera rören framför papper: rören bör alla i linje och så nära som möjligt till papperet för att ge exakt höjdmätning.
- Placera den digitala kameran (se "Special Equipment" Table) framför rören, på ett avstånd av 20-30 cm från papperet, på ett stativ (t.ex. en pipett spets låda), välj "filmen" alternativet och börja inspelning, vid denna tid bör du även starta en timer för att hålla reda på tiden mellan konsekutiva försök.
- Låt flugor för att samlas på botten av röret genom att knacka på röret i ett par sekunder (t.ex. 10 sek). Detta steg ska utföras konsekvent (dvs samma längd, samma styrka, samma operatör) under hela experimentet.
- Rekord flugor rörelser med digitalkameran för 10 sek.
- Upprepa steg 1,5-1,7 fjorton gånger på en-minuters intervall.
- Analysera data:
- Räkna antalet flugor som ligger över2 cm märket efter 10 sekunder genom visuell inspektion av de inspelade filmerna.
Obs: I vår analys förhållanden flugorna "negativa geotaxis beteende varade inte längre än den första 10 sekunder efter häpnadsväckande (dvs. flugor börjat flytta efter uppseendeväckande dem i alla riktningar 10 sek). Det minsta avståndet ökade med kontroll flugor (dvs. en vecka gamla flugor som uttrycker THGal4 drivrutinen, se legenden i figur 1) i detta tidsfönster var 2 cm. Därför använde vi 2 cm varumärke som en referens för att analysera de klättring verksamhet flugor i olika åldrar och genotyper 10 sek efter påbörjad beteendet. Dessa parametrar kan kräva anpassning för att redovisa skillnader i beteendet hos de testade flugor (t.ex. på grund av olika genetisk bakgrund eller villkor laboratorium). Notera att i vår analys förhållanden, testade alla genotyper utvecklats sämre eller liknande till flugorna av kontrollen genotyp. - Ta medelvärdet av resultaten från femtonprövningar.
- Express genomsnitt i procent av det totala antalet flugor i röret (=% klättring aktivitet), antalet upprepningar (N) ges av antalet oberoende kohorter testats för varje genotyp
- Bedöm statistisk signifikans mellan olika genotyper över tiden. Detta kan åstadkommas med ett Students t-test (när man jämför två genotyper) eller en 2-vägs ANOVA analys följt av Bonferroni post-hoc test (när du utför multipla jämförelser) använda kommersiella mjukvaror såsom GraphPad (GraphPad Software, Inc.La Jolla, CA, USA).
- Räkna antalet flugor som ligger över2 cm märket efter 10 sekunder genom visuell inspektion av de inspelade filmerna.
Anmärkning
Vi utför alla våra analyser vid samma tidpunkt på dagen, vid RT och under samma ljusförhållanden. Att hålla flugorna i en 12 tim ljus / mörker-cykel miljö är tillrådligt att kontrollera för effekten av dygnsrytmen på flugorna "rörelseapparaten beteende.
2. Tyrosinhydroxylas ImmunfluorescensAnalys av hela hjärnan Mounts
Lösningar och buffertar
Fixative lösning: 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS)
Tvättbuffert: 0,1% Triton X-100 i PBS
Blockerande buffert: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 och 0,5% BSA
Montering media: Mowiol-DABCO (se protokoll som beskrivs i Harlow E, Lane D., Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 10:418 (1988))
Procedur
- Sätt flugor i en dissektion maträtt fylld med 70% EtOH för ca 1 minut för att ta bort nagelbanden vaxet.
- Transfer flyger till en annan dissektion skålen fylld med iskall PBS.
- Dissekera hjärnan:
- Placera flyga med den ventrala sidan uppåt (tillval: Avlägsna vingar och ben).
- Dra bort huvudet från kroppen: använd en uppsättning pincett tillhålla fast vid kroppen och en annan att hålla fast vid nagelbanden under ögat för att förhindra skador på hjärnan
- Ta snabel.
- Håll fast huvudet nagelband på motsatta sidor av slitsen lämnades öppna efter avlägsnande snabel och dra i motsatta riktningar tills hjärnan tas bort från huvudet kapsel.
- Ta bort alla nagelband från hjärnan.
- Ta all den luftfyllda trakeal vävnad; detta kommer att hindra hjärnan från att flyta under följande inkubationssteg.
- Skär några millimeter utanför spetsen på en P-200 pipettspetsen och jämvikta den med en 0,1% Triton X-100/PBS lösning
- Använda den framställda P-200 pipettspetsen, överföra hjärnor att en 0,5 ml Eppendorf-rör fyllt med 0,5 ml 4% PFA / PBS och hålla på is tills dissektion är slutförd.
- Fäst hjärnor vid RT i 20 min: tillämpa en mjuk rotation genom att sätta Eppendorf-rör på ett rack och placera gallret på en nutator.
- Ta bort fixativmed hjälp av en P-1000 micro pipett, tillsätt 0,5 ml 0,1% Triton X-100/PBS, blanda genom inversion och låt inkubera under 1 minut, upprepa detta tvättningssteg gång.
- Avlägsna buffert från den andra tvätten, tillsätt 0,5 ml 0,1% Triton X-100/PBS och låta inkubera vid RT i 20 min, upprepa detta steg två gånger.
- Avlägsna tvättbuffert och låt hjärnorna inkubera i blockerande buffert (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 och 0,5% BSA) under 1 h vid RT.
- Inkubera hjärnor med en 1:100 utspädning av anti-TH-antikropp (se "Tabell över specifika reagens") i blockerande lösningen, i två dagar, vid 4 ° C, under försiktig rotation (se steg 2.6.).
- Upprepa tvättsteg 2,7. och 2.8 ..
- Jämvikta hjärnorna med en 1:200 utspädning av sekundär antibodyin blockerande lösningen, i två dagar, vid 4 ° C under försiktig rotation.
- Upprepa tvättsteg 2,7. och 2.8 ..
- Förbered montering bilderna som visas i figur 2A:
- ETTdd 2 x 25 l droppar av montering media till ett skyddsglas (24 x 60 mm, nr. 1.5).
- Placera två täckglas (storlek 18 x 18 mm, nr. 2) om montering media lämnar en lucka i mitten av bilden och låt torka.
- Avlägsna tvättbuffert, tillsätt 50 | il av montering media och tillåta hjärnorna till jämvikt med det genom att pipettera upp och ned.
- Vid en cut P-200 pipettspetsen (se steg 2.4) överföra hjärnor till bilden i utrymmet mellan de två täckglas och täcka dem med ett täckglas nej. 1,5 (se figur 2A; att orientera hjärnorna på objektglaset se 7).
Obs: proverna är monterade mellan två täckglas för att tillåta visualisering av både den främre och den posteRIOR sidan av hjärnan. - Fylla hela utrymmet mellan täckglas med montering media, pipett från ena hörnet för att avlägsna all luft, låt torka och tätning med nagellack.
- För att bedöma antalet dopaminerga neuroner i en viss klunga förvärva en serie av optiska snitt längs z-axeln med en 1,0 ^ m steg-storlek med användning av ett konfokalt mikroskop (för den anatomiska identifiering av dopaminerga kluster i Drosophila vuxna hjärnan se 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har använt de analyser som beskrivs här för att studera vilken roll stress skyddande Nrf2 väg i en Drosophila modell av PD 14. Denna modell bygger på uttrycket av den humana α-synuklein gen i DA nervceller med hjälp av en TH Gal4 förare 2, 10.
Figur 1 visar ett representativt resultat av en spritta-inducerade negativa geotaxis (klättring) analys i manliga flugor som uttrycker olika transgener under kontroll av TH Gal4 föraren. Alla genotyper testade uppvisar en nedgång i rörelseaktivitet över tiden, men flyger uttrycker PD-kopplad, humant α-synuklein transgen uppvisar en accelererad nedgång i förhållande till ålder-matchade kontroller flugor (TH Gal4 föraren ensam) eller flyger samuttrycker Nrf2 DNA bindningspartner Maf-S. Liknande resultat observerades hos kvinnliga flugor.
Figur 2 illustrerar ett representativt resultat för en TH immunofluorescens-baserad DAneuron räkna. Effekten av olika genetiska bakgrunder på antalet PPL1 nervceller i hjärnor från 4 veckor gamla manliga flugor kvantifieras såsom beskrivs i figuren legend. Lägg märke till den lilla men betydande förlust av PPL1 nervceller i hjärnan från flugor som uttrycker α-synuklein.
Figur 1. Startle-inducerad negativ geotaxis analysformat. Kohorter av åldersmatchade flugor av de angivna genotyper testades med avseende på rörelseaktivitet med en veckas intervall. Climbing aktiviteten beräknades genom att räkna antalet flugor över 2 cm-markeringen 10 sekunder efter att knacka flaskan och uttrycka detta värde i procent av det totala antalet flugor som finns i flaskan. Data visar medelvärden ± standardavvikelse av fem oberoende kohorter med 20-30 flugor. Betydelse bedömdes med en tvåvägs ANOVA med Bonferroni post-hoc test (P <0,05). Skillnadenmellan TH, var α-Synflies och flugor av de andra testade tre genotyper signifikant vid 4 och 5 veckor.
Figur 2. Detektion och räkning av DA-neuroner från TH immunofluorescens. A. Flödesschema som illustrerar protokollet för att förbereda hjärnan diabilder. För en mer detaljerad beskrivning av varje steg se text. B. Representant mikrofoto av ett hela hjärnan mount (höger hemibrain, bakre vy) immunostained för TH. En uppsättning av konfokala Z-serien bilder förvärvades med en Leica SP2 konfokalmikroskop, 40X olja mål (N / A 1,25), ram genomsnitt 2, steg-storlek 1 um, i en 1.024 x 1.024 format och sammanställs som en maximal projektion ( visade). Positionen för PPL1 DA neuron kluster markeras. C. Representative results för DA neuron som räknas som erhållits med hjälp av TH immunfärgning. Antalet neuroner i PPL1 klustret bedömdes genom att inspektera de enskilda bilderna i varje konfokala z-serien. N representerar antalet oberoende prover som analyseras för varje genotyp. Data är medelvärden ± SEM Signifikans bedömdes med Students t-test (* P <0,05). Klicka här för att visa en större bild .
Genotyper: "con", THGal4 / +; THGal4 / +; 'UAS-Syn', THGal4, UAS
-ΑSynuclein / +; THGal4, UAS-αSynuclein / +; 'UAS-Maf-S', THGal4/UASMaf-S; THGal4 / +; 'UAS-α Syn / UAS-Maf-S', THGal4, UAS-αSynuclein / UASMaf-S; THGal4, UAS-αSynuclein / +; 'keap1 EY5', THGal4 / +; THGal4/keap1 EY5; 'UAS-α Syn/keap1 EY5', THGal4, UAS-αSynuclein / +, THGal4, UAS -αSynuclein/keap1 EY5.
[Reproducerad från Barone et al. 2011) i samförstånd med "Open access" politik "sjukdom modeller och mekanismer".]
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De analyser som beskrivs här ger en användbar metod för att studera betydelsen av specifika gener, signalvägar eller små föreningar i underhållet av DA-neuroner i åldrandet samt i olika sjukdomar kopplade genetisk bakgrund (översikt i 5).
Den spritta-inducerade negativa geotaxis beteende Drosophila har i stor utsträckning använts som en funktionell läs-out för funktionaliteten av DA-neuroner i olika genetisk bakgrund, särskilt i närvaro av PD-kopplade mutationer. Vissa skillnader mellan olika studier har observerats (se 12 för en utförligare diskussion). Dessa har tillskrivits åtminstone delvis till olika analysmetoder uppställningar och villkor, inklusive antalet flugor testas i varje rör (enda fluga kontra flugor "kohort), tiden för återhämtning efter CO 2-medierad anestesi och antalet på varandra följande prövningar (se 4 och 11 som exempel på different assay set-ups). Det kan därför vara klokt att kontrollera för sådana parametrar och vid behov optimera dem för analysinstruktioner krav.
Kvantifiering av DA-neuroner från TH immunfärgning / konfokalmikroskopi har använts omväxlande med den metod som bygger på THGal4-driven GFP uttryck och identifiering av DA-neuroner från GFP fluorescens / konfokalmikroskopi. De båda metoderna ger jämförbara resultat i de flesta fall, men i allmänhet, är TH immunfärgning teknik föredras av oss och andra utredare som den är känslig för den funktionella tillståndet av DA neuron. För en mer detaljerad jämförelse se 11 och 10. Denna analys skulle kunna kompletteras genom att mäta nivåerna av dopamin i fluga huvuden homogenat [se 1 som ett exempel].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi förklarar att vi inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Leo Pallanck för klipska bestånd, Christine Sommers för tekniskt bistånd och Gerasimos P. Sykiotis för bra diskussioner. Detta arbete har finansierats av NIH utbildningsstipendium T32CA009363 till MCB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody | Millipore | AB152 | |
| Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-026-152 | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| DABCO | Sigma | D2522 | |
| Equipment | |||
| Polystyrene vials | VWR | 89092-734 | 28.5 x 95 mm |
| Digital camera | Canon | PowerShot A3100IS (model) | 12.1 Megapixels 4X Optical Zoom |
| Glass coverslips no. 1.5 | VWR | 48366 205 48393 252 | Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm |
| Glass coverslips no. 2 | VWR | 48368-040 | Size: 18 x 18 mm |
| Dissection dishes | Electron Microscopy Sciences | 70543-01 | Size: 30 mm O.D. |
| Dumostar No. 5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72705-01 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 (model) | |
| Confocal microscope | Leica | SP2 or SP5 (model) | |
Materials Table. |
|||
References
- Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly,, Botella, J. Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease. Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
- Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase. J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).
- Lundell, M., Hirsh, J. Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS. Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).
- Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
- Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies. Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).
- Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster. Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).
- Trinh, K., Moore, K., et al. Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson's disease. J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).
- White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
- Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease. Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
- Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease. Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).
