Summary
A continuación se describen dos ensayos que se han establecido para estudiar la neurodegeneración dependiente de la edad de las neuronas dopaminérgicas (DA) en
Abstract
Drosophila melanogaster es una valiosa organismo modelo para estudiar el envejecimiento y los procesos patológicos degenerativos en el sistema nervioso. Las ventajas de la marcha como un sistema experimental incluyen su maleabilidad genética, vida corta y la posibilidad de observar y analizar cuantitativamente comportamientos complejos. La expresión de los genes vinculados a la enfermedad en poblaciones neuronales específicas del cerebro de Drosophila, se puede utilizar para modelar enfermedades neurodegenerativas humanas como el Parkinson y el Alzheimer 5.
Las neuronas dopaminérgicas (DA) se encuentran entre las poblaciones neuronales más vulnerables en el envejecimiento del cerebro humano. En la enfermedad de Parkinson (PD), el trastorno del movimiento más común neurodegenerativa, la pérdida acelerada de neuronas DA conduce a una disminución progresiva e irreversible de la función locomotora. Además de la edad y la exposición a las toxinas ambientales, la pérdida de las neuronas DA se ve agravada por las mutaciones específicas en la codificacióno regiones promotoras de varios genes. La identificación de tales alelos asociada a la EP proporciona la base experimental para el uso de Drosophila como modelo para estudiar la neurodegeneración de las neuronas DA in vivo. Por ejemplo, la expresión del gen humano α-sinucleína PD-vinculados en Drosophila neuronas DA recapitula algunas características de la enfermedad humana, por ejemplo la pérdida progresiva de las neuronas dopaminérgicas y la disminución de la función locomotora 2. En consecuencia, este modelo ha sido utilizado con éxito para identificar posibles dianas terapéuticas en la EP 8.
A continuación se describen dos ensayos que habitualmente se han utilizado para estudiar la neurodegeneración dependiente de la edad de las neuronas DA en Drosophila: un ensayo de escalada en base a la respuesta de sobresalto inducida geotaxis inmunotinción negativa y la tirosina hidroxilasa de todo el cerebro adulto monta para controlar el número de neuronas DA en las diferentes edades. En ambos casos, la expresión in vivo de t UASransgenes específicamente en las neuronas DA se puede lograr mediante el uso de una tirosina hidroxilasa (TH) de la línea controlador promotor Gal4-3, 10.
Introduction
La especificidad de los ensayos descritos aquí se basa en el uso de una línea de la mosca Gal4 que explota las secuencias reguladoras del gen de la tirosina hidroxilasa para lograr la expresión específica en las neuronas dopaminérgicas 3. La tirosina hidroxilasa cataliza la primera y la tasa de limitación de paso en la síntesis de dopamina. TH inmunoreactividad en los adultos se superpone cerebro de la mosca con la de la dopamina, lo que hace TH un buen candidato para identificar las neuronas DA in vivo (véase, por ejemplo 6). Por otra parte, el patrón de expresión de THGal4 es más específico que el de otras líneas de Gal4 como DdcGal4, que contiene secuencias reguladoras del gen de la dopa decarboxilasa y conduce la expresión transgénica no sólo en las neuronas DA, sino también en las neuronas serotoninérgicas y subconjuntos de células gliales 3 .
Feany y Bender (2000) observaron por primera vez que la expresión de pan-neuronal del gen de la α-sinucleína humana DP-ligado acelera la pérdida progresiva de la estacióncomportamiento rtle inducida geotaxis negativa en Drosophila. Hemos observado resultados similares usando la línea específica de neuronas DA THGal4 para conducir la expresiónde la α-sinucleína transgén 10 y utilizado esta funcionalidad de lectura para estudiar el papel neuroprotector de la vía Nrf2 en este Drosophila modelo de la EP 14. El ensayo específico que se describe aquí es una adaptación de 2 y 3.
El cerebro de Drosophila contiene más de 100 neuronas DA, dispuestos en al menos 5 grupos diferentes (pPL1, pPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3) que se pueden visualizar en montajes de todo el cerebro por microscopía confocal (véase, por ejemplo 11 y 7). Es todavía es controvertido si o no el número de neuronas DA en el cerebro disminuye Drosophila con 9 años de edad, 11, sin embargo, la neurodegeneración dependiente de la edad se observó en las moscas que se han mutado genes PD-enlazadas / sobreexpresa para modelar enfermedades humanas5. La expresión de humano α-sinucleína en las neuronas DA tiene tal efecto y, por lo tanto, se ha utilizado como un modelo para la EP. A continuación se describe un ensayo para las neuronas DA cuentan en todo el cerebro se monta utilizando TH como marcador celular. Este ensayo ha sido adaptado de 13 y 10.
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Protocol
1. Sobresalto inducida Ensayo geotaxis Negativo
- Seleccione moscas del genotipo deseado, separarlos por sexo, grupo al azar en las cohortes de 20 a 30 animales y voltear en nuevos frascos de alimentos cada 2-3 días, las pruebas de cada conjunto de moscas (es decir, las cohortes de edades similares, una cohorte / genotipo) al menos una vez a la semana.
- Treinta minutos antes de la prueba geotaxis negativa, anestesiar a las moscas con CO 2 y colocarlos en pre-etiquetados tubos de plástico transparentes hechos con dos frascos vacíos de alimentos (véase la Tabla de Materiales) unidas por sus aberturas con cinta adhesiva transparente (dimensiones de la cámara de 19 cm x 2,85 cm). En nuestras pruebas usamos normalmente 25 moscas / tubo.
Nota. El tiempo de recuperación de la anestesia puede variar desde unos pocos minutos a varias horas (por ejemplo, S / N) y debe ser optimizado para los genotipos específicos ensayados. - Marque diferentes alturas (de 1 a 20 cm) en una hoja de papel secante y cinta el papel sobre una superfi verticalese, perpendicular a la banca.
- Colocar los tubos en primera plana del periódico: los tubos deben estar alineados y tan cerca como sea posible del papel para permitir la medición de altura exacta.
- Coloque la cámara digital (ver la tabla "Equipo Especial") delante de los tubos, a una distancia de 20-30 cm del papel, en un soporte (por ejemplo, una caja de puntas de pipeta), seleccione la opción "película" y empezar a grabación, en este momento también se debe iniciar un temporizador para realizar un seguimiento del tiempo entre ensayos consecutivos.
- Permitir que las moscas para recoger en la parte inferior del tubo golpeando ligeramente el tubo de pocos segundos (por ejemplo, 10 segundos). Este paso se debe realizar constantemente (es decir, misma duración, la misma fuerza, el mismo operador) durante todo el experimento.
- Movimientos Registro moscas con la cámara digital de 10 seg.
- Repita los pasos 1.5 a 1.7 catorce veces a intervalos de un minuto.
- Analizar los datos:
- Cuente el número de moscas que están por encima de la2 marca cm después de 10 segundos por inspección visual de las películas grabadas.
Nota: En las condiciones de ensayo geotaxis comportamiento negativo de las moscas no duró más allá de los primeros 10 segundos después de la sorprendente (por ejemplo, las moscas empezaron a moverse en todas las direcciones 10 segundos después de asustarlos). La distancia mínima subió por las moscas de control (es decir, 1 semana de antigüedad moscas que expresan el conductor THGal4, véase la leyenda de la figura 1) en esta ventana de tiempo fue de 2 cm. Por lo tanto, se utilizó la marca de 2 cm como referencia para el análisis de las actividades de escalada de moscas de diferentes edades y genotipos 10 segundos después de iniciar el comportamiento. Estos parámetros pueden requerir el ajuste para tener en cuenta las diferencias en el comportamiento de las moscas a prueba (por ejemplo, debido a los diferentes antecedentes genéticos o las condiciones de laboratorio). Observe que en nuestras condiciones de ensayo, todos los genotipos probados realiza peor o similar a las moscas del genotipo control. - Tomar la media de los resultados de los quinceensayos.
- Promedio Express como un porcentaje del número total de moscas en el tubo (= actividad de escalada%); el número de repeticiones (N) viene dado por el número de cohortes independientes ensayadas para cada genotipo
- Evaluar la significación estadística entre los diferentes genotipos en el tiempo. Esto se puede lograr con la prueba de la t de Student (cuando se comparan dos genotipos) o un análisis de 2 vías ANOVA seguido de la prueba de Bonferroni post hoc (cuando se realizan comparaciones múltiples) utilizando softwares comerciales tales como GraphPad (GraphPad Software, Inc.La Jolla, CA, EE.UU.).
- Cuente el número de moscas que están por encima de la2 marca cm después de 10 segundos por inspección visual de las películas grabadas.
Nota
Llevamos a cabo todos nuestros ensayos al mismo tiempo del día, a TA y bajo las mismas condiciones de luz. Mantener las moscas en un entorno de ciclo de 12 horas de luz / oscuridad es aconsejable controlar el efecto de los ritmos circadianos en el comportamiento locomotor de las moscas.
2. Inmunofluorescencia tirosina hidroxilasaEnsayo de Montes Whole Brain
Soluciones y tampones
Solución de fijación: 4% de paraformaldehído (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS)
Tampón de lavado: 0,1% de Triton X-100 en PBS
El tampón de bloqueo: 0,1 M de Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M de NaCl, 0,1% de Triton X-100 y 0,5% de BSA
Medios de montaje: Mowiol-DABCO (ver protocolo descrito en Harlow E, Lane D., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratorios Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE.UU., 10:418 (1988))
Procedimiento
- Ponga moscas en una placa de disección lleno de 70% de EtOH durante aproximadamente 1 min para eliminar la cera de la cutícula.
- Transferencia vuela a otro plato de disección llena de helado de PBS.
- Disección del cerebro:
- Coloque la marcha con el costado ventral (opcional: las alas y las piernas quitar).
- Tire de la cabeza del cuerpo: utilice un conjunto de pinzas paraaferrarse al cuerpo y otro para aferrarse a la cutícula bajo la mirada para no dañar el cerebro
- Retire la probóscide.
- Espera a la cabeza de la cutícula en lados opuestos de la ranura izquierda abierta después de la eliminación de la trompa y tirar en direcciones opuestas hasta que el cerebro se elimina de la cápsula de la cabeza.
- Retirar toda la cutícula del cerebro.
- Quite todo el tejido traqueal lleno de aire, lo que evitará que el cerebro flotando en las siguientes etapas de incubación.
- Cortar unos milímetros de la punta de la punta de la pipeta P-200 y se equilibra con una solución al 0,1% de Triton X-100/PBS
- Uso del preparado punta P-200 pipeta, transferir los cerebros a un tubo Eppendorf de 0,5 ml lleno con 0,5 ml de PFA al 4% / PBS y mantener en hielo hasta la disección es completa.
- Fijar el cerebro a temperatura ambiente durante 20 min: aplicar una rotación suave, poniendo los tubos Eppendorf en un rack y colocar el bastidor en una nutator.
- Quite el fijadorel uso de un P-1000 micro pipeta, añadir 0,5 ml de 0,1% Triton X-100/PBS, mezclar por inversión y dejar incubar durante 1 min; repetir este paso de lavado una vez.
- Retire el buffer del segundo lavado, añadir 0,5 ml de 0,1% Triton X-100/PBS y dejar incubar a temperatura ambiente durante 20 min, repita este paso dos veces.
- Retirar el tampón de lavado y dejar que los cerebros se incuban en tampón de bloqueo (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M de NaCl, 0,1% de Triton X-100 y 0,5% de BSA) durante 1 hora a TA.
- Incubar el cerebro con una dilución 1:100 de anticuerpo anti-TH (vea la "Tabla de reactivos específicos") en solución de bloqueo, durante dos días, a 4 ° C, con una rotación suave (vea el paso 2.6.).
- Repita los pasos de lavado 2.7. y 2,8 ..
- Equilibrar los cerebros con una dilución 1:200 de solución de bloqueo antibodyin secundaria, durante dos días, a 4 ° C, con rotación suave.
- Repita los pasos de lavado 2.7. y 2,8 ..
- Preparar los portaobjetos de montaje como se ilustra en la Figura 2A:
- Ladd 2 X 25 l gotas de medio de montaje a una cubierta de vidrio (24 x 60 mm,. no 1.5).
- Coloque dos cubiertas de vidrio (tamaño 18 x 18 mm,. N º 2) en el soporte de montaje, dejando un hueco en el centro de la diapositiva y dejar secar.
- Eliminar el tampón de lavado, se añaden 50 l de medio de montaje y permitir que los cerebros se equilibren con él la pipeta hacia arriba y hacia abajo.
- El uso de un corte P-200 punta de pipeta (véase el paso 2.4) transferir los cerebros a la diapositiva en el espacio entre los dos cubreobjetos y cubrir con un cubreobjetos no. 1.5 (véase la figura 2, para orientar a los cerebros de la diapositiva ver 7).
Nota: las muestras se montan entre dos cubiertas de vidrio para permitir la visualización tanto de la anterior y el posterior lado del cerebro. - Llenar todo el espacio entre los cubreobjetos con medio de montaje; pipeta de una esquina a eliminar todo el aire, dejar secar y sellar con esmalte de uñas.
- Para evaluar el número de neuronas dopaminérgicas en un grupo específico adquirir una serie de secciones ópticas a lo largo del eje z con un paso de tamaño 1,0 micras usando un microscopio confocal (para la identificación anatómica de las agrupaciones dopaminérgicas en el cerebro adulto de Drosophila ver 7).
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Representative Results
Hemos utilizado los ensayos descritos aquí para estudiar el papel de la vía Nrf2 protectora estrés en un modelo de Drosophila de la EP 14. Este modelo se basa en la expresión del gen de la α-sinucleína humana en las neuronas DA utilizando un TH Gal4 conductor 2, 10.
La Figura 1 muestra un resultado representativo de un geotaxis negativos inducidos por sobresalto (escalada) de ensayo en las moscas macho que expresan diferentes transgenes bajo el control de la Gal4 conductor TH. Todos los genotipos probados muestran una disminución de la actividad locomotora en el tiempo, sin embargo, vuela expresar el PD-ligado, humana α-sinucleína transgén presenta una disminución acelerada en relación con el control de moscas de edad comparable (TH Gal4 conductor solo) o vuela co-expresión de la Nrf2 ADN de unión Maf-S. Se observaron resultados similares en las moscas hembras.
La Figura 2 ilustra un resultado representativo para un TH DA inmunofluorescencia basadocontar neurona. El efecto de diferentes orígenes genéticos sobre el número de pPL1 las neuronas en los cerebros de 4 semanas de edad moscas macho se cuantifica como se describe en la leyenda de la figura. Note la pequeña pero significativa pérdida de pPL1 neuronas en los cerebros de las moscas que expresan α-sinucleína.
Figura 1. Moscas ensayo geotaxis negativo sobresalto inducida. Cohortes de emparejados por edad de los genotipos indicados se ensayaron para determinar la actividad locomotora a intervalos de una semana. Escalada actividad se calculó contando el número de moscas 2 cm por encima de la marca de 10 segundos después de pulsar el vial y expresando este valor como un porcentaje del número total de moscas contenidos en el vial. Los datos muestran las medias ± SEM de cinco cohortes independientes de 20 a 30 moscas. La significación se evaluó con un análisis de varianza de dos vías con Bonferroni post hoc de prueba (P <0.05). La diferenciaentre TH, α-Synflies y moscas de los otros tres genotipos ensayados fue significativa a las 4 y 5 semanas.
Figura 2. A. Diagrama de flujo de detección y el recuento de las neuronas DA por TH inmunofluorescencia. Ilustra el protocolo para la preparación de diapositivas cerebrales. Para una descripción más detallada de cada paso vea el texto. B. Representante micrografía de un montaje de todo el cerebro (hemibrain derecha, vista posterior) immunostained para TH. Un conjunto de imágenes de la serie Z confocal fue adquirido con una Leica SP2 microscopio confocal, aceite objetivo 40X (N / A 1,25), marco de media 2, paso 1 micra de tamaño, en un formato de 1024 x 1024 y compilado como una proyección máxima ( se muestra). Se destaca la posición del grupo de neuronas DA pPL1. C. Representante results de neuronas DA recuentos obtenidos mediante inmunotinción TH. El número de neuronas en el grupo de pPL1 se evaluó mediante la inspección de las imágenes individuales de cada confocal z-serie. N representa el número de muestras independientes analizadas para cada genotipo. Los datos son medias ± SEM significación se evaluó con la prueba t de Student (* p <0,05). Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Los genotipos: 'CON', THGal4 / +; THGal4 / +; 'UAS-Syn', THGal4, UAS
-ΑSynuclein / +; THGal4, UAS-αSynuclein / +; 'UAS-Maf-S', THGal4/UASMaf-S; THGal4 / +; 'UAS-α Syn / UAS-Maf-S', THGal4, UAS-αSynuclein / UASMaf-S; THGal4, UAS-αSynuclein / +; 'Keap1 EY5', THGal4 / +; THGal4/keap1 EY5; 'UAS-α Syn/keap1 EY5', THGal4, UAS-αSynuclein / +, THGal4, UAS -αSynuclein/keap1 EY5.
[Tomado de Barone et al. 2011) de acuerdo con el "acceso abierto" política de "modelos de enfermedad y los mecanismos".]
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Discussion
Los ensayos descritos aquí proporcionar un enfoque útil para estudiar la función de genes específicos, las vías de señalización o compuestos pequeños en el mantenimiento de las neuronas DA en el envejecimiento, así como en diferentes bases genéticas de enfermedades vinculadas (revisado en 5).
El comportamiento negativo de sobresalto geotaxis inducida de Drosophila se ha usado ampliamente como un funcional de lectura para la funcionalidad de las neuronas DA en diferentes fondos genéticos, particularmente en la presencia de mutaciones PD-enlazadas. Se han observado algunas discrepancias entre los diferentes estudios (ver 12 para una discusión más detallada). Estos han sido atribuido en parte a ensayo diferentes configuraciones y condiciones, incluyendo el número de moscas a prueba en cada tubo (una sola mosca frente cohorte de moscas), el tiempo de recuperación después de la anestesia CO 2 mediada y el número de consecutivo ensayos (ver 4 y 11 como ejemplos de diensayo ferente set-ups). Por lo tanto, podría ser aconsejable para controlar esos parámetros y, si es necesario optimizarlos para los requisitos específicos del ensayo.
La cuantificación de las neuronas DA por TH inmunotinción / microscopía confocal se ha usado de manera intercambiable con el método basado en la expresión de GFP THGal4 impulsada y la identificación de las neuronas DA por la fluorescencia de GFP / microscopía confocal. Los dos métodos dan resultados comparables en la mayoría de los casos, sin embargo, en general, la técnica de inmunotinción TH es preferido por nosotros y otros investigadores ya que es sensible al estado funcional de las neuronas DA. Para una comparación más detallada véase 11 y 10. Este ensayo puede complementarse mediante la medición de los niveles de dopamina en mosca cabezas homogeneizados [véase 1 como ejemplo].
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Disclosures
Declaramos que no tenemos intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Damos las gracias a Leo Pallanck para las poblaciones de moscas, Christine Sommers de asistencia técnica y Gerasimos P. Sykiotis útil para los debates. Este trabajo fue financiado por el NIH subvención T32CA009363 formación de MCB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody | Millipore | AB152 | |
| Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-026-152 | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| DABCO | Sigma | D2522 | |
| Equipment | |||
| Polystyrene vials | VWR | 89092-734 | 28.5 x 95 mm |
| Digital camera | Canon | PowerShot A3100IS (model) | 12.1 Megapixels 4X Optical Zoom |
| Glass coverslips no. 1.5 | VWR | 48366 205 48393 252 | Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm |
| Glass coverslips no. 2 | VWR | 48368-040 | Size: 18 x 18 mm |
| Dissection dishes | Electron Microscopy Sciences | 70543-01 | Size: 30 mm O.D. |
| Dumostar No. 5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72705-01 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 (model) | |
| Confocal microscope | Leica | SP2 or SP5 (model) | |
Materials Table. |
|||
References
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