Summary
Her beskriver vi to analysene som er etablert for å studere aldersavhengig neurodegeneration av dopaminerge (DA) nevroner i
Abstract
Drosophila melanogaster er en verdifull modell organisme for å studere aldring og patologiske degenerative prosesser i nervesystemet. Fordelene med fly som et eksperimentelt system inkluderer dens genetiske tractability, kort levetid og muligheten til å observere og kvantitativt analysere komplekse atferd. Ekspresjon av sykdom-bundne gener i spesifikke nevronale populasjoner av Drosophila hjernen, kan brukes for å modellere humane nevrodegenerative sykdommer som Parkinsons og Alzheimers 5.
Dopaminerge (DA) nevroner er blant de mest sårbare nevronale populasjoner i den aldrende menneskelige hjerne. I Parkinsons sykdom (PD), den vanligste nevrodegenerativ lidelse bevegelse, fører akselerert tap av DA neuroner til en progressiv og irreversibel nedgang i bevegelsesaktiviteten funksjon. I tillegg til alder og eksponering for miljøgifter, er tapet av neuroner DA forverret av spesifikke mutasjoner i den kodendeeller promoter regioner av flere gener. Identifiseringen av slike PD-assosierte alleler gir den eksperimentelt grunnlag for bruk av Drosophila som en modell for å studere neurodegenerering av DA-neuroner in vivo. For eksempel uttrykk for PD-linked menneskelig α-synuclein genet i Drosophila DA nevroner sammenfatter noen av funksjonene i den menneskelige sykdom, f.eks progressive tap av DA nevroner og fallende locomotor to funksjon. Følgelig har denne modellen blitt brukt til å identifisere potensielle terapeutiske mål i PD 8.
Her beskriver vi to analysene som har ofte blitt brukt til å studere aldersavhengig neurodegeneration av DA nevroner i Drosophila: en klatring analysen basert på skremmeeffekt-indusert negativ geotaxis respons og tyrosin hydroksylase farging av hele den voksne hjernen monterer å overvåke antallet DA nevroner på ulike alderstrinn. I begge tilfeller er in vivo-ekspresjon av UAS transgenes spesifikt i DA-nevroner kan oppnås ved hjelp av et tyrosin-hydroksylase (TH) promoter-Gal4 driver linje 3, 10.
Introduction
Spesifisiteten til assayene som beskrives her, er avhengig av bruk av et Gal4 fluesnøre som utnytter de regulatoriske sekvenser av tyrosin-hydroksylase-genet for å oppnå spesifikk ekspresjon i dopaminerge nevroner 3. Tyrosin hydroksylase katalyserer det første og hastighetsbegrensende trinn i dopamin-syntese. TH immunoreaktivitet i voksen hjerne fly overlapper området av dopamin, slik TH en god kandidat for å identifisere DA-neuroner in vivo (se for eksempel 6). Videre er uttrykket mønster av THGal4 mer spesifikk enn for andre Gal4 linjer som DdcGal4, som inneholder regulatoriske sekvenser fra den dopa-dekarboksylase-genet og driver transgen ekspresjon ikke bare i DA-neuroner, men også i serotonerge neuroner og gliaceller delsett av tre .
Feany og Bender (2000) først observert at pan-neuronal uttrykk for PD-linked menneskelig α-synuclein genet akselererer den progressive tap av startle-indusert negativ geotaxis atferd i Drosophila. Vi har observert lignende resultater ved bruk av DA-nervecellen spesifikk THGal4 linje for å drive expressionof en α-synuclein transgene 10 og brukt dette funksjonelle lese-ut for å studere nervecellene rolle Nrf2 veien i denne Drosophila modell av PD 14. Den spesifikke analysen beskrevet her er tilpasset fra 2 og 3.
Drosophila-hjerne inneholder mer enn 100 DA-nevroner, anordnet i minst fem forskjellige klynger (PPL1, PPL2, PAL, spm1 / 2, PPM3) som kan visualiseres i hele hjernen monteringer ved konfokal mikroskopi (se for eksempel 11 og 7). Det er fortsatt kontroversielt hvorvidt eller ikke antallet av DA-nevroner i Drosophila-hjerne avtar med alderen 9, 11, men er aldersavhengig neurodegenerering observert i fluer hvor PD-bundne gener har blitt mutert / overuttrykt å modellere human diseases5. Ekspresjonen av humant α-synuclein in DA neuroner har en slik virkning, og derfor, har blitt benyttet som en modell for Parkinsons sykdom. Her beskriver vi en analyse for DA nevroner telle i hele hjernen mounts hjelp TH som en celle markør. Denne analysen har blitt tilpasset fra 13 og 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Skremmeeffekt-indusert Negative Geotaxis analysen
- Velg fluer ønsket genotype, skille dem etter kjønn, tilfeldig gruppere dem i årskull av 20-30 dyr, og snu dem inn i nye mat ampuller hver 2-3 dager, test hvert sett av fluer (dvs. age-matchet kohorter, en kohort / genotype) minst en gang i uken.
- Tretti minutter før den negative geotaxis test, anesthetize fluene med CO 2 og plassere dem i pre-merket klar plast rør laget med to tomme mat hetteglass (se Materialer Table) sluttet på sine åpninger med klar tape (kammer dimensjoner: 19 cm x 2,85 cm). I våre analyser vanligvis bruker vi 25 fluer / tube.
Notat. Gjenopprettingstiden fra anestesi kan varieres fra noen minutter til flere timer (f.eks O / N) og skal være optimalisert for de spesifikke genotyper testet. - Marker forskjellige høyder (1-20 cm) på et stykke trekkpapir og tape papiret på en vertikal surface, vinkelrett på benken.
- Plasser rørene i front av papir: rørene bør være justert og alle så nær som mulig til papiret for å tillate nøyaktig måling høyde.
- Plasser det digitale kameraet (se "Special Equipment" Table) foran rørene, i en avstand på 20-30 cm fra papir, på et stativ (f.eks en pipette tips boks), velg "film" og starte opptak, på denne tiden bør du også starte en timer for å holde styr på tiden mellom etterfølgende forsøk.
- Tillat fluene til å samle seg på bunnen av røret ved å trykke røret i noen få sekunder (f.eks 10 sek). Dette trinnet bør utføres gjennomgående (dvs. samme lengde, samme styrke, samme operatør) gjennom hele eksperimentet.
- Record fluer bevegelser med digitalkameraet for 10 sek.
- Gjenta trinn 01.05 til 01.07 fjorten ganger på ett-minutts intervaller.
- Analysere data:
- Tell antall fluer som er over2 cm mark etter 10 sek ved visuell inspeksjon av innspilte filmer.
Merk: I våre analysebetingelser fluene 'negative geotaxis oppførsel gjorde ikke vare utover den første 10 sek etter oppsiktsvekkende (dvs. fluer begynte å bevege seg i alle retninger 10 sek etter oppsiktsvekkende dem). Minste avstand økte med kontroll fluer (dvs. en uke gamle fluer som uttrykker THGal4 driver, se legenden i figur 1) i dette tidsvinduet var 2 cm. Dermed har vi brukt 2 cm mark som en referanse for å analysere klatring aktiviteter av fluer i ulike aldre og genotyper av 10 sek etter oppstart av atferden. Disse parametrene kan kreve justering å ta hensyn til forskjeller i atferd av fluene testet (som for eksempel skyldes ulike genetiske bakgrunn eller laboratorium). Legg merke til at i våre analysebetingelser, alle genotyper testet utført verre eller lignende til de fluer kontroll genotype. - Ta gjennomsnittet av resultatene fra de femtenprøvelser.
- Express gjennomsnitt som en prosentandel av det totale antall fluer i røret (=% aktivitet klatring), idet antallet repetisjoner (n) er gitt ved antall uavhengige cohorts testet for hver genotype
- Vurdere statistisk signifikans mellom ulike genotyper over tid. Dette kan gjøres med en Student t-test (når man sammenligner to genotypene) eller en to-veis ANOVA etterfulgt av Bonferroni post-hoc test (når du utfører flere sammenligninger) ved hjelp av kommersielle programvare som GraphPad (GraphPad Software, Inc.La Jolla, CA, USA).
- Tell antall fluer som er over2 cm mark etter 10 sek ved visuell inspeksjon av innspilte filmer.
Note
Vi utføre alle analyser på samme tid av dagen, ved RT og under samme lysforhold. Holde fluene i en 12 timers lys / mørke syklus miljøet er tilrådelig å kontrollere for effekten av døgnrytme på fluene 'bevegelsesapparatet atferd.
2. Tyrosin hydroksylase ImmunfluorescensAnalysen av hele hjernen Mounts
Løsninger og buffere
Fikseringsoppløsning: 4% paraformaldehyde (PFA) i fosfatbufret saltvann (PBS)
Vaske-buffer: 0,1% Triton X-100 i PBS
Blokkering buffer: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 og 0,5% BSA
Montering media: Mowiol-Dabco (se protokoll beskrevet i Harlow E, Lane D., Antistoffer-A laboratorium manuell, Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 10:418 (1988))
Prosedyre
- Sett fluer i en disseksjon tallerken fylt med 70% EtOH i ca 1 min for å fjerne skjellaget voks.
- Transfer flyr til en annen disseksjon tallerken fylt med iskald PBS.
- Dissekere hjernen:
- Plasser fly med den ventrale siden opp (valgfritt: Ta vinger og ben).
- Trekk hodet vekk fra kroppen: Bruk ett sett tang tilholde på kroppen og en annen for å holde på skjellaget under øyet å forhindre skade på hjernen
- Fjern snabel.
- Hold på hodet hårstråene på motsatte sider av slissen forblir åpen etter fjerning av proboscis og trekk i motsatte retninger til hjernen fjernes fra hodet kapsel.
- Fjern alle hårstråene fra hjernen.
- Fjern alle de luftfylte tracheal vev, og dette vil forhindre hjernen fra flytende under de etterfølgende trinnene inkubering.
- Skjær noen millimeter utenfor spissen av en P-200 pipettespissen og ekvilibrere det med en 0,1% Triton X-100/PBS løsningen
- Ved hjelp av den fremstilte P-200 pipettespissen, overføre hjernene til et 0,5 ml Eppendorf-rør fylt med 0,5 ml 4% PFA / PBS og holde på is inntil de er fullstendig disseksjon.
- Fikse hjernen ved RT i 20 min: påfør en svak rotasjon ved å sette Eppendorf-rør på et stativ og plassere rack på en nutator.
- Fjern bindemiddelved hjelp av en P-1000 micro pipette, tilsett 0,5 ml 0,1% Triton X-100/PBS, bland ved å snu opp og la inkuberes i 1 min, gjenta dette vasketrinnet gang.
- Fjern buffer fra den andre vask, tilsett 0,5 ml 0,1% Triton X-100/PBS og la Inkuber ved RT i 20 min; gjenta dette trinnet to ganger.
- Fjern vaskebuffer og la hjernene inkuberes i blokkeringsbuffer (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 og 0,5% BSA) i 1 t ved RT.
- Inkuber hjernen med en 1:100 fortynning av anti-TH antistoff (se "Oversikt over spesifikke reagenser") i blokkering løsning, i to dager, på 4 ° C, med milde rotasjon (se trinn 2.6.).
- Gjenta vaske trinn 2.7. og 2.8 ..
- Likevekt hjernen med en 1:200 fortynning av sekundær antibodyin blokkering løsning, i to dager, ved 4 ° C, med milde rotasjon.
- Gjenta vaske trinn 2.7. og 2.8 ..
- Forbered montering lysbilder som illustrert i figur 2A:
- Endd 2 x 25 mL dråper montering medier til et cover glass (24 x 60 mm, nei. 1.5).
- Plasser to dekkglass (størrelse 18 x 18 mm, nei. 2) på montering medier forlater et gap i midten av lysbildet og la tørke.
- Fjern vaske buffer, tilsett 50 mL av montering media og la hjernen å stabilisere seg med det ved pipettering opp og ned.
- Ved hjelp av et kutt P-200 Pipettespissen (se trinn 2.4) overføre hjernen til raset i rommet mellom de to Dekkglass og dekk dem med et dekkglass no. 1.5 (se figur 2A; å orientere hjernen på lysbildet se 7).
Merk: prøvene er montert mellom to dekkglass for å tillate visualisering av både den fremre og den Postedige side av hjernen. - Fylle hele rommet mellom dekkglass med montering media; pipette fra ett hjørne for å fjerne all luften, la tørke og forsegle med neglelakk.
- For å vurdere antall dopaminerge nevroner i en spesifikk klynge erverve en serie av optiske seksjoner langs z-aksen med en 1,0 mikrometer trinn-størrelse ved hjelp av en konfokalmikroskop (for den anatomiske identifisering av dopaminerge klynger i Drosophila voksen hjerne se 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har brukt de analysene som er beskrevet her for å studere rollen av stress beskyttende Nrf2 veien i en Drosophila modell av PD 14. Denne modellen bygger på uttrykk for den menneskelige α-synuclein genet i DA nevroner ved hjelp av en TH Gal4 driver 2, 10.
Figur 1 viser et representativt resultat av en skremmeeffekt-indusert negative geotaxis (klatring) analysen i mannlige fluer uttrykker ulike transgener under kontroll av TH Gal4 driver. Alle de genotypene testet viser en nedgang i bevegelsesapparatet aktivitet over tid, men flyr uttrykker PD-forbundet, menneskelig α-synuclein transgene viser en akselererende nedgang i forhold til alder-matchet kontroll fluer (TH Gal4 driver alene) eller flyr co-uttrykker Nrf2 DNA bindende partner Maf-S. Lignende resultater ble observert hos kvinnelige fluer.
Figur 2 viser et representativt resultat for en TH immunfluorescens-basert DAnervecellen telle. Effekten av forskjellige genetiske bakgrunner på antallet PPL1 nevroner i hjerner fra 4 uker gamle fluer kvantifiseres som beskrevet i figuren legende. Legg merke til de små, men betydelige tap av PPL1 nevroner i hjernen mot fluer uttrykker α-synuclein.
Figur 1. Skremmeeffekt-indusert negativ geotaxis analysen. Årskull av aldersgruppe fluer av de angitte genotypene ble testet for bevegelsesaktiviteten på ett ukers mellomrom. Klatring aktivitet ble beregnet ved å telle antall fluer over 2 cm-merket 10 sekunder etter å ha valgt ampullen og uttrykke denne verdi som en prosentandel av det totale antall fluer som finnes i ampullen. Data viser gjennomsnitt ± sem av fem uavhengige kohorter av 20-30 fluer. Betydning ble vurdert med en to-veis ANOVA med Bonferroni post-hoc test (P <0,05). Forskjellenmellom TH, var α-Synflies og fluer i de andre tre genotyper testet signifikant på fire og fem uker.
Figur 2. Påvisning og telling av DA nevroner av TH immunfluorescens. A. Flow diagram som illustrerer protokollen for å forberede hjernen lysbilder. For en mer detaljert beskrivelse av hvert trinn se tekst. B. Representant micrograph av en hel hjerne mount (høyre hemibrain, posterior view) immunostained for TH. Et sett med confocal z-serien bildene ble kjøpt med en Leica SP2 confocal mikroskop, 40X olje objektiv (N / A 1,25), frame gjennomsnitt 2, step-størrelse 1 mikrometer, i en 1024 x 1024-formatet og samlet som en maksimal projeksjon ( vist). Posisjonen til PPL1 DA nervecellen klyngen er uthevet. C. Representant results for DA nervecellen teller innhentet ved hjelp av TH farging. Antallet nevroner i PPL1 klyngen ble vurdert ved å undersøke individuelle bilder av hver konfokal z-serien. N representerer antall uavhengige prøver analysert for hver genotype. Data er midler ± sem Betydning ble vurdert med en Student t-test (* P <0,05). Klikk her for å se større figur .
Genotyper: 'con', THGal4 / +, THGal4 / +; 'UAS-Syn', THGal4, UAS
-ΑSynuclein / +; THGal4, UAS-αSynuclein / +; 'UAS-Maf-S', THGal4/UASMaf-S; THGal4 / +; 'UAS-α Syn / UAS-Maf-S', THGal4, UAS-αSynuclein / UASMaf-S; THGal4, UAS-αSynuclein / +; 'keap1 EY5', THGal4 / +; THGal4/keap1 EY5; 'UAS-α Syn/keap1 EY5', THGal4, UAS-αSynuclein / +, THGal4, UAS -αSynuclein/keap1 EY5.
[Gjengitt fra Barone et al. 2011) i samråd med "Open access" politikk "sykdom modeller og mekanismer".]
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analysene er beskrevet her gi en nyttig tilnærming for å studere rollen til spesifikke gener, signalveier eller små forbindelser i vedlikehold av DA nevroner i aldring samt i ulike sykdomsfremkallende knyttet genetiske bakgrunn (anmeldt i 5).
Skremmeeffekt-indusert negativ geotaxis atferd Drosophila har vært mye brukt som en funksjonell lese-out for funksjonaliteten DA nevroner i ulike genetiske bakgrunn, særlig i nærvær av PD-linked mutasjoner. Noen avvik mellom ulike studier har blitt observert (se 12 for en nærmere omtale). Disse har blitt tilskrevet det minste delvis til forskjellige assay-midler og tilstander, inkludert antall fluer som ble testet i hvert rør (flue versus fluer 'kohort), tidspunktet for utvinning etter at CO 2-mediert anestesi og antallet fortløpende forsøk (se 4 og 11 som eksempler på different analysen set-ups). Det kan derfor være aktuelt å kontrollere for slike parametere og om nødvendig optimalisere dem for bestemte analyseverdier krav.
Kvantifisering av DA nevroner ved TH farging / konfokalmikroskopi har blitt brukt om hverandre med metoden basert på THGal4-drevet GFP uttrykk og identifisering av DA nevroner av GFP fluorescens / konfokalmikroskopi. De to metodene gir sammenlignbare resultater i de fleste tilfelle, men generelt blir TH farging teknikk foretrukket av oss og andre forskere som det er følsomt for den funksjonelle tilstand av DA nevroner. For en mer detaljert sammenligning se 11 og 10 år. Denne analysen kan suppleres ved å måle dopamin nivåer i fly hoder homogenates [se en som et eksempel].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi erklærer at vi har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Leo Pallanck for fly aksjer, Christine Sommers for teknisk assistanse og Gerasimos P. Sykiotis for nyttige diskusjoner. Dette arbeidet ble finansiert av NIH trening stipend T32CA009363 til MCB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody | Millipore | AB152 | |
| Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-026-152 | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| DABCO | Sigma | D2522 | |
| Equipment | |||
| Polystyrene vials | VWR | 89092-734 | 28.5 x 95 mm |
| Digital camera | Canon | PowerShot A3100IS (model) | 12.1 Megapixels 4X Optical Zoom |
| Glass coverslips no. 1.5 | VWR | 48366 205 48393 252 | Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm |
| Glass coverslips no. 2 | VWR | 48368-040 | Size: 18 x 18 mm |
| Dissection dishes | Electron Microscopy Sciences | 70543-01 | Size: 30 mm O.D. |
| Dumostar No. 5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72705-01 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 (model) | |
| Confocal microscope | Leica | SP2 or SP5 (model) | |
Materials Table. |
|||
References
- Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly,, Botella, J. Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease. Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
- Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase. J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).
- Lundell, M., Hirsh, J. Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS. Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).
- Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
- Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies. Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).
- Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster. Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).
- Trinh, K., Moore, K., et al. Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson's disease. J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).
- White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
- Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease. Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
- Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease. Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).
