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Biology

संयोजक कोर Histones से nucleosomal सारणियों और nucleosome पोजिशनिंग डीएनए की सभा

Published: September 10, 2013 doi: 10.3791/50354
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biochemistry and Molecular Biology, Colorado State University

Summary

एक विधि पुनः संयोजक कोर histones से मॉडल nucleosomal सरणियों के पुनर्गठन और tandemly दोहराया nucleosome स्थिति डीएनए के लिए प्रस्तुत किया है. हम भी विश्लेषणात्मक ultracentrifuge में अवसादन वेग प्रयोगों, और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) पुनर्गठन के बाद nucleosomal सरणी संतृप्ति की हद तक नजर रखने के लिए उपयोग किया जाता है वर्णन कैसे.

Abstract

Repetitively एक डीएनए अणु के साथ स्थान दिया गया है कि कोर histone octamers nucleosomal सरणियों कहा जाता है. Nucleosomal सरणियों दो तरीकों में से एक में प्राप्त कर रहे हैं: में विवो स्रोतों से शुद्धि, या पुनः संयोजक कोर histones से इन विट्रो में पुनर्गठन और tandemly दोहराया nucleosome स्थिति डीएनए. बाद विधि एक अधिक compositionally वर्दी के विधानसभा और ठीक से तैनात nucleosomal सरणी के लिए अनुमति का लाभ दिया है. वे केन्द्रापसारक बल के तहत समाधान के माध्यम से विस्थापित दर जिस पर विश्लेषण करके बड़े अणुओं के आकार के आकार के बारे में विश्लेषणात्मक ultracentrifuge उपज जानकारी में अवसादन वेग प्रयोगों. इस तकनीक, परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी के साथ, डीएनए टेम्पलेट्स के बहुमत के पुनर्गठन के बाद nucleosomes साथ संतृप्त कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने, गुणवत्ता नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ हम लंबाई की मिलीग्राम मात्रा में पुनर्गठित करने के लिए आवश्यक है और compositionally डी प्रोटोकॉल का वर्णनchromatin संरचना और समारोह के जैव रासायनिक और biophysical अध्ययन के लिए उपयुक्त efined nucleosomal सरणियों.

Introduction

यूकेरियोटिक जीनोम के रूप में नग्न डीएनए मौजूद नहीं है, बल्कि ठोस और बाध्य प्रोटीन द्वारा आयोजित कर रहे हैं. डीएनए और प्रोटीन की इन परिसरों chromatin के रूप में जाना जाता है. chromatin की बुनियादी दोहराई इकाई nucleosome है. एक nucleosome histone octamer और के बारे में 1.6 गुना 1 octamer histone चारों ओर लिपटा डीएनए के 146 आधार जोड़े के होते हैं. histone octamer दो प्रतियां कोर histones H2A, H2B, H3, और H4 में से प्रत्येक से बना है. Repetitively एक डीएनए अणु के साथ स्थान दिया गया है कि कोर histone octamers nucleosomal सरणियों कहा जाता है. nucleosomal सरणियों की विस्तारित संरचना संरचना "एक तार पर मोती" 10 एनएम फाइबर या के रूप में जाना जाता है और कम नमक स्थितियां 2 के तहत इन विट्रो में उपस्थित किया गया है. 10 एनएम फाइबर इंट्रा सरणी संघनन और / या अंतर - सरणी oligomerization 2 के माध्यम से उच्च आदेश संरचनाओं में संघनित करने में सक्षम है. ये उच्च आदेश संरचनाओं, लवण की उपस्थिति में प्रेरित किया जा सकता हैया nucleosomal सरणी 3,4 करने chromatin वास्तु प्रोटीन की बाइंडिंग के माध्यम से प्रभावित किया जा सकता है. Chromatin संघनन के स्तर inversely विवो 5,6 में प्रतिलेखन की दर के साथ सहसंबद्ध होते हैं. हाल के शोध से इस तरह के भेदभाव, कैंसर के विकास, और दूसरों 7,8 प्रक्रियाओं के रूप में जीनोम की संरचनात्मक संगठन के महत्व पर प्रकाश डाला गया. chromatin संरचना और समारोह का अध्ययन करने के nucleosomal सरणियों का उपयोग व्यापक हो गया है. यहाँ हम पुनः संयोजक कोर histones और nucleosome स्थिति डीएनए से nucleosomal सरणियों की विधानसभा के लिए एक विधि का वर्णन.

Nucleosome स्थिति दृश्यों के मिलकर दोहराता साथ पुनः संयोजक डीएनए का प्रयोग नियमित रूप से स्थान nucleosomes होते हैं कि सरणियों के पुनर्गठन के लिए अनुमति देता है. अधिक लोकप्रिय पोजीशनिंग दृश्यों के दो 5S rRNA जीन अनुक्रम और "601" अनुक्रम 9,10 हैं. 601 अनुक्रम SELEX प्रयोगों और mor से निकाला गया थाई दृढ़ता से 5 एस अनुक्रम 11 से nucleosomes पदों. नतीजतन, 601 सरणियों की लिंकर डीएनए लंबाई अधिक सजातीय है. Tandemly दोहराया nucleosome स्थिति डीएनए जेल निस्पंदन 4,12 द्वारा प्राप्त की है. संयोजक histones ई. से शुद्ध कर रहे हैं denaturing स्थितियों 13 के तहत कोलाई. पुनः संयोजक histones के उपयोग के एक ध्यान से nucleosomal सरणियों की histone रचना नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है. उदाहरण के लिए, कोर 15,16 जंगली प्रकार कोर histones के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है विशिष्ट परिवर्तन 14 या बाद translational संशोधनों असर histones.

अवसादन वेग प्रयोगों में एक आवेदन केन्द्रापसारक बल 17 के तहत समाधान में अणुओं की अवसादन की दर पर नजर रखने के. यह एक नमूना में बड़े अणुओं के आकार के आकार के बारे में जानकारी देता है. अवसादन वेग प्रयोगों इस प्रकार chromatin फाइबर में समाधान राज्य में परिवर्तन के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त उपकरण हैंchromatin संक्षेपण 18 के कारण संरचना. महत्वपूर्ण बात है, यह nucleosomal सरणी पुनर्गठन में एक गुणवत्ता नियंत्रण कदम के रूप में अवसादन वेग प्रयोग का उपयोग करने के लिए पहली आवश्यक है. डीएनए और nucleosomes उचित दाढ़ अनुपात में संयुक्त नहीं कर रहे हैं, सरणियों के तहत या अधिक संतृप्त कोर histones के साथ हो सकता है. इस प्रकार, अवसादन वेग प्रयोगों से प्राप्त जानकारी के डीएनए ठीक से nucleosomes के साथ संतृप्त है कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह एक पहले से uncharacterized डीएनए टेम्पलेट के साथ काम कर रहा है, खासकर अगर nucleosomes के साथ डीएनए की संतृप्ति अनुमान लगाने के लिए वैकल्पिक तरीकों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसलिए, हम भी परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) का उपयोग nucleosomal सरणियों के विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन. AFM अनुमति देता है एक शक्तिशाली तकनीक है ऐसे संतृप्ति का स्तर, histone वेरिएंट की उपस्थिति का प्रभाव या 2 MgCl 19,20 के प्रभाव के रूप में मानकों की एक संख्या के प्रभाव के दृश्य. AFM भी appli किया गया हैएड समय चूक इमेजिंग 21 का उपयोग nucleosome गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए. इन विट्रो वे AFM इमेजिंग 22 के लिए सही आकार रेंज में हैं क्योंकि nucleosomal 12 पूर्व सरणियों AFM पढ़ाई के लिए विशेष रूप से उत्तरदायी हैं इकट्ठे हुए. वर्तमान अध्ययन में हम एक गुणवत्ता नियंत्रण के साथ ही ("देखना ही विश्वास करना है") नीलामी से डेटा की पुष्टि करने का एक साधन के रूप में nucleosomal सरणियों के AFM का इस्तेमाल किया है. साधारण दृश्य के अलावा, AFM एक अतिरिक्त मीट्रिक के रूप में नमूनों की ऊंचाई प्रोफाइल के माप की अनुमति देता है.

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Protocol

1. Octamers में संयोजक कोर histones की सभा

दलील: nucleosomal सरणी पुनर्गठन में पहला कदम lyophilized पुनः संयोजक कोर histones से देशी कोर histone octamers को तैयार है. Histone प्रोटीन बराबर दाढ़ मात्रा में संयुक्त और बफर refolding में एक अप्राकृतिकरण बफर के बाहर नमूने dialyzing द्वारा histone octamers में इकट्ठा कर रहे हैं.

  1. शुद्ध और 13 के रूप में वर्णित (H2A, H2B, H3, H4) पुनः संयोजक कोर histones lyophilize.
  2. खुलासा बफर (6 एम guanidinium एचसीएल, 20 मिमी Tris पीएच 7.5, 5 मिमी डीटीटी) के 3 मिलीलीटर में प्रत्येक lyophilized कोर histone के लगभग 5 मिलीग्राम भंग. प्रत्येक विभाज्य कम से कम एक घंटे के लिए भंग करने की अनुमति. कोई प्रोटीन कंटेनर की तरफ रहता है यह सुनिश्चित.
  3. एक संदर्भ के रूप में खुलासा बफर का उपयोग कर 276 एनएम पर प्रत्येक histone की absorbance के उपाय.
  4. उनके विलुप्त होने गुणांक का उपयोग कर प्रत्येक histone के molarity गणना करें (देखें तालिका 1 Xenopus histone विलुप्त होने गुणांक के लिए). प्रोटीन का बहुमत भंग कर रहा है अगर lyophilized सूखी वजन, और अनुमान के histone के absorbance निर्धारित एकाग्रता तुलना कर लें.
  5. इस सब histones के लिए moles की सीमित संख्या के रूप में होगा, आप के fewest moles है जो histone निर्धारित करते हैं.
  6. बराबर दाढ़ मात्रा में histones का मिश्रण है और 1 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए बफर खुलासा साथ पतला.
  7. 6-8 केडीए MWCO डायलिसिस टयूबिंग में नमूना रखें. ट्यूबिंग सील और ठंड refolding बफर के 2 एल में जगह (2 एम NaCl, 10 मिमी Tris पीएच 7.5, 1 मिमी EDTA, 5 मिमी β-mercaptoethanol).
  8. सरगर्मी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए नमूना dialyze. सुनिश्चित करें डायलिसिस ट्यूबिंग स्वतंत्र रूप से और तेजी से घुमा सकते हैं, या किसी और histones वेग सकता है.
  9. दो बार 18 घंटा अवधि (किया जब तक यानी हर 6 घंटे के बारे में refolding बफर बदल) में डायलिसिस बफर बदलें. वेग का गठन किया है, भले ही अलग नहींउपज कम हो जाएगा, हालांकि नमूना, कुछ octamer बरामद किया जा सकता है.

नोट: अगले दिन के लिए स्तंभ संतुलन तैयार करने के लिए कदम 2.1-2.2 देखें.

2. आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा Histone octamers का शोधन

दलील: खंड 1 के साथ समापन के बाद, नमूने histone octamers के साथ ही इस तरह के समुच्चय, H3/H4 tetramers, और H2A/H2B dimers रूप में अन्य histone परिसरों में शामिल होंगे. Histone octamers दूर आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) का उपयोग कर इन अन्य परिसरों से शुद्ध हो जाएगा.

  1. एक HiLoad एक FPLC व्यवस्था करने के लिए 16/60 Superdex200 16/60 (S200) स्तंभ से कनेक्ट करें. हवाई बुलबुले प्रणाली में प्रवेश नहीं करते, यह सुनिश्चित.
  2. 0.2 माइक्रोन फ़िल्टर्ड पानी के साथ S200 स्तंभ साफ करें. 0.3 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर का प्रयोग करें और 0.5 MPa की एक पीठ दबाव सीमा निर्धारित करें. यदि आपके पास पर्याप्त पानी है सुनिश्चित करें और स्तंभ रातोंरात साफ करने के लिए अनुमति देते हैं.
  3. एफ के S200 स्तंभ और नमूना पाश संतुलित करनापीएलसी बफर refolding का उपयोग कर. 0.2 माइक्रोन फ़िल्टर्ड refolding बफर के 1 एल का प्रयोग करें. / मिनट 1 मिलीलीटर की दर और के बारे में 2 घंटे के लिए 0.5 MPa की एक अधिकतम दबाव में स्तंभ के माध्यम से बफर refolding प्रवाह.
  4. बफर refolding के 1 मिलीलीटर के साथ एक Vivaspin केन्द्रापसारक concentrator (50 केडीए MWCO) संतुलित करना. डायलिसिस टयूबिंग से नमूना निकालें और किसी भी अवक्षेप को दूर करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना अपकेंद्रित्र. Concentrator में नमूना सतह पर तैरनेवाला पिपेट. लगभग 500 μl की एक मात्रा के लिए नमूना ध्यान लगाओ.
  5. एक नए कंटेनर को केंद्रित octamer नमूना निकालें और 1 मिलीलीटर बफर refolding साथ concentrator कुल्ला. 500 μl के लिए कुल्ला नीचे ध्यान लगाओ, और octamer नमूना जोड़ें. इस concentrator में शेष किसी भी octamer निस्तारण करने में मदद करता है.
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 rpm पर 5 मिनट के लिए एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में नमूना स्पिन सतह पर तैरनेवाला लीजिए और एक नया ट्यूब को हस्तांतरण. इस FPL पर नमूना लोड करने से पहले किसी भी वेग को दूर करने में मदद करता हैसी.
  7. S200 स्तंभ पर नमूना लोड. एक भी शुद्धि में 1.5 मिलीलीटर कुल मात्रा या 15 मिलीग्राम octamer की एक अधिकतम भार.
  8. ताजा बना refolding बफर का उपयोग नमूना Elute. 1 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर और 0.5 MPa की एक पीठ दबाव सीमा का उपयोग करें. बफर refolding दो स्तंभ मात्रा में (400 मिलीलीटर) का उपयोग करें और 2 मिलीलीटर भिन्न इकट्ठा. क्षालन दौरान 280 एनएम पर absorbance मॉनिटर. विभिन्न प्रजातियों के आकार को कम करने के क्रम में elute जाएगा. Histone समुच्चय आमतौर पर लगभग 84 मिलीलीटर (चित्रा 1) में लगभग 45 मिलीलीटर, octamer के बारे में 65 मिलीलीटर, और डिमर elute.
  9. एक 18-20% एसडीएस पृष्ठ पर नमूने चलाकर ब्याज की चोटियों से क्षालन भिन्न विश्लेषण. शुद्ध octamers युक्त अंशों चार कोर histone प्रोटीन के बराबर दाढ़ मात्रा में (चित्रा 1) होना चाहिए.
  10. शुद्ध किया octamers होते हैं कि भिन्न पूल, और एक Vivaspin केन्द्रापसारक फिल्टर के साथ 15 मिलीग्राम / एमएल ≤ के लिए ध्यान देना. पतला छोड़ दिया, octamers अलग हो सकता है मैंNto H2A/H2B dimers और H3/H4 tetramers.
  11. 280 एनएम पर absorbance को मापने के द्वारा octamer एकाग्रता का निर्धारण और तालिका 1 से विलुप्त होने गुणांक का उपयोग कर की गणना.
  12. Histone octamers 4 डिग्री सेल्सियस पर refolding बफर में अल्पावधि रखा जा सकता है लंबे समय तक भंडारित किया जा रहा है, octamers -20 डिग्री सेल्सियस पर और एक 50% ग्लिसरॉल समाधान में अधिक स्थिर हो जाएगा. ग्लिसरॉल में संग्रहीत octamers absorbance के माप से पहले ताजा refolding बफर में dialyzed और nucleosomal सरणी reconstitutions में उपयोग किया जाना चाहिए.

3. डीएनए से nucleosomal सारणियों और शुद्ध octamers के पुनर्गठन

दलील: nucleosomal सरणियों के पुनर्गठन histone octamers और टेम्पलेट डीएनए विशिष्ट दाढ़ अनुपात में जोड़ दिया जाना आवश्यक है. 2 एम NaCl में डीएनए और histone octamers के मिश्रण ईओण ताकत को कम करने की बफ़र्स में dialyzed कदम हैं. कम नमक के लिए एक क्रमिक बदलाव उचित nucleosome गठन सुनिश्चित करता है. N प्राप्तटेम्पलेट डीएनए के histone octamer संतृप्ति के वांछित स्तर से ucleosomal सरणियों एक बड़े पैमाने पर प्रारंभिक पुनर्गठन द्वारा पीछा छोटे पैमाने पर परीक्षण reconstitutions की आवश्यकता है. छोटे पैमाने reconstitutions द्वारा परिभाषित उपयुक्त परिस्थितियों प्रारंभिक पुनर्गठन मार्गदर्शन करने के लिए उपयोग किया जाता है.

  1. 4,12 के रूप में वर्णित tandemly दोहराया nucleosome स्थिति डीएनए शुद्ध. संक्षेप में, एक Qiagen GigaPrep किट या एक समान उत्पाद का उपयोग प्लास्मिड डीएनए को अलग. सेट अप एक प्रतिबंध एंजाइम टेम्पलेट डीएनए जारी है और छोटे आकार (≤ 700bp) को प्लास्मिड डीएनए को पचाने के क्रम में पचाने. टेम्पलेट डीएनए तो दूर आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) का उपयोग करते हुए छोटे प्लास्मिड डीएनए अवशेष से शुद्ध किया जा सकता है. एक गुरुत्व Sephacryl एस -1000 मोती के साथ पैक के बारे में 115 सेमी की ऊंचाई के साथ, स्तंभ खिलाया 601 207bp एक्स 12mer डीएनए की शुद्धि के लिए पर्याप्त है.

नोट: प्लास्मिड डीएनए की कमी हुई कीमत पर शुद्धि लेकिन वृद्धि EFF के लिएort, एक ई. से प्लास्मिड डीएनए को अलग करने के क्रम में फिनोल / क्लोरोफॉर्म डीएनए शुद्धि के साथ क्षारीय सेल का उपयोग कर सकते हैं कोली 23,24. प्लाज्मिड डीएनए से टेम्पलेट डीएनए को अलग करने के लिए रणनीति टेम्पलेट डीएनए आकार में परिवर्तन के साथ भिन्न हो सकते हैं. सेकंड के लिए यह प्रतिबंध एंजाइम टेम्पलेट और प्लास्मिड डीएनए के बीच आकार में अंतर अधिकतम हो पाता है जो एक फैशन में पचाने में स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है.

  1. दाढ़ अनुपात (नि.) reconstitutions के लिए उपयोग करने के लिए जो निर्धारित करते हैं. आर डीएनए दोहराने के मोल को octamer के moles के अनुपात के बराबर है. आशय संतृप्त nucleosomal सरणियों प्राप्त करने के लिए है, तो प्रारंभिक छोटे पैमाने पर परीक्षण के लिए, 0.9, 1, और 1.1 के आर मूल्यों उपयुक्त हैं.
  2. परीक्षण किया जा करने के लिए प्रत्येक दाढ़ अनुपात के लिए लगभग 18 ग्राम डीएनए के लिए जोड़ने के लिए octamer की राशि की गणना के द्वारा छोटे पैमाने के नमूने तैयार. डीएनए और histone octamers मिलाएं. नमूने में NaCl के अंतिम एकाग्रता 2 एम ≥, और डी के अंतिम एकाग्रता किया जाना चाहिएएनए के आसपास 0.3 माइक्रोग्राम / μl होना चाहिए. अंतिम नमूना बफर की स्थिति भी 10 मिमी Tris पीएच 7.8, और 1 मिमी EDTA शामिल होना चाहिए.
  3. नमूने अब डायलिसिस के लिए तैयार हैं. 12k-14k MWCO डायलिसिस टयूबिंग में नमूने लेता है. इस प्रकार के रूप ईओण ताकत को कम करने के बफर के 2L के खिलाफ नमूने Dialyze.

10 मिमी Tris पीएच 7.8, 1 मिमी EDTA: सभी बफ़र्स में अवयव. बफर 1 5-6 घंटे के लिए (1 एम NaCl, 1 मिमी डीटीटी जोड़). बफर रातोंरात 2 (0.75 एम NaCl, 1 मिमी डीटीटी जोड़). 3 बफर 5-6 घंटे के लिए (2.5 मिमी NaCl, 1 मिमी डीटीटी जोड़). बफर 4 रातोंरात (2.5 मिमी NaCl, 0.1 मिमी PMSF जोड़).

  1. डायलिसिस टयूबिंग से नमूने निकालें और वर्गों 4-6 के लिए आगे बढ़ें. छोटे पैमाने पर नमूने वांछित परिणाम है, बड़े पैमाने पर वर्गों 3-6 में चरणों को दोहराएँ.

नोट: संसाधनों के संरक्षण के लिए, छोटे पैमाने के नमूने नीचे की ओर स्क्रीनिंग assays के लिए पर्याप्त करने के लिए आवश्यक न्यूनतम मात्रा होनी चाहिए. ई आदेश मेंnough 0.3 मिलीग्राम / एमएल डीएनए पर यहाँ सूचीबद्ध अवसादन वेग और AFM प्रयोगों, 50 μl नमूने के लिए नमूना उपयुक्त हैं. बड़े पैमाने के आकार, प्रारंभिक नमूने उनका इरादा उपयोग पर निर्भर हैं. एक बड़े पैमाने पर नमूना छोटे पैमाने नमूने के रूप में एक ही तरीके से तैयार किया जाना चाहिए.

4. पुनर्गठन nucleosomal सारणियों की अवसादन वेग विश्लेषण

दलील: समाधान में अणुओं के आकार के आकार पर बैकमैन XL-ए / मैं विश्लेषणात्मक ultracentrifuge उपज जानकारी में अवसादन वेग प्रयोगों. कम नमक शर्तों के तहत किया अवसादन वेग प्रयोगों का पुनर्गठन सरणियों nucleosomes साथ संतृप्त कर रहे हैं जो करने के लिए सीमा निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है.

  1. दस बफर (10 मिमी Tris पीएच 7.8, 1 मिमी EDTA, 2.5 मिमी NaCl) का उपयोग कर 260 एनएम पर 0.5 चारों ओर एक absorbance के लिए नमूना पतला. एक तरफ नमूना और जनमत संग्रह के साथ, एक दो क्षेत्र centerpiece के साथ एक सेल में नमूना के 400 μl लोडअन्य 25 सीई (दस बफर). (यानी 420 μl संदर्भ समाधान जोड़ने) नमूना meniscus से अधिक संदर्भ meniscus रखें.
  2. रोटर में कोशिकाओं लोड, और ठीक से कोशिकाओं और रोटर 25 के तल पर हैश निशान का उपयोग कोशिकाओं संरेखित. धीरे संपीड़ित हवा का उपयोग कोशिकाओं की लेंस धूल.
  3. , XL-A/XL-I अपकेंद्रित्र चालू करें रोटर डालें, और देते हैं और पुस्तिका में वर्णित के रूप में प्रकाशिकी सुरक्षित. नई: Proteome लैब सॉफ्टवेयर का चयन करें और फ़ाइल को खोलें.
  4. 3,000 rpm और 25 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर एक भी स्कैन चलाने सेट करें विकल्प के तहत, का चयन अंतिम स्कैन के बाद बंद, और रन रेडियल अंशांकन (रोटर नीलामी में इस्तेमाल पिछले रोटर था अगर रेडियल अंशांकन आवश्यक नहीं है).
  5. प्रत्येक कक्ष के लिए, नमूने नाम एक तरंग दैर्ध्य (260 एनएम) का चयन करें, absorbance का चयन करें, और आपके कंप्यूटर पर एक फ़ाइल को बचाने के स्थान का चयन करें. एक स्कैन चलाने शुरू करो.
  6. उचित आरए निर्धारित करने के लिए एक स्कैन का उपयोगस्कैन की लम्बाई (2A चित्रा) डायल. स्कैन किया जाएगा कि सेल की लंबाई घटाना चलाते समय कम हो जाती है. हालांकि, नमूना meniscus में शामिल हैं और बहुत के करीब है, या सेल के तल पर अंत का विस्तार करने के लिए सुनिश्चित करें.

नोट: एकल स्कैन माप क्षेत्र सिर्फ नमूना meniscus (2A चित्रा) से पहले शुरू करने के माप से छोटा किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं. नीलामी चलाने के दौरान उत्पन्न स्कैन के अधिकांश meniscus के साथ ही स्थिर पठारों (चित्रा 2B) पिछले सीमा भिन्न होना चाहिए. नीलामी कोशिकाओं पर गंदे लेंस बड़े कीलें स्कैन उत्पन्न कर सकते हैं, इन आंकड़ों का विश्लेषण प्रभावित कर सकता है. UltraScan सॉफ्टवेयर विश्लेषणात्मक ultracentrifugation डेटा 26 के विश्लेषण के बारे में जानकारी के लिए एक महान स्रोत है जो एक पुस्तिका भी शामिल है.

  1. XL-A/XL-I नियंत्रण कक्ष का उपयोग, एक 0 की गति और शुरू प्रेस दर्ज करें. यह एक निर्वात और सभी खींचने के लिए अपकेंद्रित्र कक्ष शीघ्र होगाओउ चैम्बर के तापमान को संतुलित करने के लिए. एक रन के शुरू होने से पहले तापमान संतुलन के लिए अनुमति देने के लिए 1 घंटे तक प्रतीक्षा करें.
  2. वांछित गति और स्कैन की संख्या के लिए रन स्थापित करने के लिए सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें. उच्च गति संकल्प को बढ़ाने, लेकिन नमूना सेल की तह तक sedimented से पहले कम से कम 20 स्कैन (अधिमानतः अधिक) एकत्र करना चाहिए. इसे चलाने की प्रगति की निगरानी और इस तरह लीक कोशिकाओं के रूप में संभावित समस्याओं के लिए जाँच करने के क्रम में (विकल्प मेनू में निपुण) पिछले कई स्कैन उपरिशायी करने के लिए सुविधाजनक है. उचित संचालन को सुनिश्चित करने के लिए स्कैन की पहली जोड़ी मॉनिटर.

5. अवसादन वेग डेटा संपादन और विश्लेषण

दलील: कच्चे अवसादन वेग डेटा एक प्रसार को सही अवसादन गुणांक वितरण पैदावार कि एक कार्यक्रम से विश्लेषण किया जाना चाहिए. बदले में यह जानकारी किसी दिए गए संतृप्ति स्तर होता है कि एक पुनर्गठन नमूना के अंश इंगित करता है, जैसे

  1. डेटा 26 संपादित करने के लिए इस तरह के UltraScan रूप नीलामी डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें. स्कैन डेटा का संपादन प्रत्येक कक्ष के लिए किया जाता है और बाद के विश्लेषण के लिए डेटा सेट बनाता किया जाना चाहिए. स्कैन की उचित संपादन, नमूना meniscus परिभाषित हित के एक क्षेत्र के लिए डेटा को कम करने, और आधार रेखा के रूप में अच्छी तरह से पठारी क्षेत्रों (चित्रा 2) को परिभाषित करना शामिल है. अवांछित स्कैन भी इस बिंदु पर सेट डेटा से हटाया जा सकता है. यह विश्लेषण के दौरान अवांछित स्कैन निकालना संभव है लेकिन, जब से यह सब स्कैन इस बिंदु पर रखा जा सिफारिश की है.
  2. हम दृढ़ता से बढ़ाकर वैन Holde-Weischet विधि डेटा 27 का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सलाह देते हैं. इस विश्लेषण विधि रन के पाठ्यक्रम पर प्रसार के प्रभाव के लिए सही और अवसादन गुणांक का अभिन्न वितरण पैदावार. विशेष रूप सेबढ़ाया वैन Holde-Weischet विधि (UltraScan में कार्यान्वित के रूप में) स्थिर पठारों की कमी है, जो या विश्लेषण 28 में meniscus साफ नहीं है जो सीमा भिन्न होते हैं जो स्कैन के शामिल किए जाने के लिए अनुमति देगा.
  3. इकट्ठे सरणियों के लिए अवसादन गुणांक का वितरण निर्धारित. 601-12 (207bp, 12 पूर्व) nucleosomal सरणियों के लिए प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3 में दिखाया गया.
  4. छोटे पैमाने के नमूनों में से एक अवसादन गुणांक के वांछित रेंज के साथ सरणियों होता है, तो धारा 3 की शुरुआत के साथ एक बढ़ा पैमाने पर प्रक्रिया को दोहराने. छोटे पैमाने पर नमूनों में से कोई भी अवसादन गुणांक का समुचित वितरण किया गया है तो धारा 3 में शुरू होने वाला नया आर श्रृंखला के साथ छोटे पैमाने पर परीक्षण दोहराएँ.

6. परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग nucleosomal सारणियों Visualizing (AFM)

दलील: AFM अनुमति देता है nucleosoma की संतृप्ति के स्तर के दृश्यएल सरणियों. इस तकनीक को एक गुणवत्ता नियंत्रण परख के रूप में नीलामी और प्रतिबंध एंजाइम पाचन द्वारा अवसादन वेग पूरक.

  1. ऊपर वर्णित विधियों का प्रयोग, एक अच्छी तरह से संतृप्त nucleosome सरणी (चित्रा 5A) प्राप्त करते हैं.
  2. तैयार करें APTES रखकर अभ्रक स्लाइड इलाज ~ 30 μl 30 मिनट के लिए 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर्ड nanopure पानी में वाणिज्यिक (सिग्मा Aldrich (3 aminopropyl) triethoxysilane A3648-100ml) के 1:1,000 कमजोर पड़ने.
  3. 30 मिनट बाद पानी फ़िल्टर साथ APTES बंद कुल्ला और धीरे से एक नाइट्रोजन प्रवाह में उन्हें सूखी.
  4. स्लाइड पर उचित रूप से पतला nucleosome सरणी नमूना (~ 1.5 एनजी / μl) प्लेस, और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कवर सेते हैं.
  5. फ़िल्टर नमूना बफर के साथ बंद नमूने के रूप में पहले सूखे, और AFM (इस मामले में एक शरण रिसर्च MFP-3D परमाणु सेना माइक्रोस्कोप) के मंच पर जगह स्लाइड कुल्ला.
  6. 512 लाइनों स्कैन के साथ 2 एक्स 2 माइक्रोन स्कैन इमेजिंग द्वारा शुरू करो. SA के स्तर का पता लगाने के लिए nucleosomes की संख्या की गणनाturation (चित्रा 5 ब).
  7. आदर्श रूप में आप चाहिए अच्छी तरह से अलग nucleosome सरणियों साथ स्लाइड पर छवि क्षेत्रों.
  8. उच्च संकल्प छवियों के लिए, एक 500 x 500 एनएम स्कैन (चित्रा 5C) प्राप्त किया जा सकता है.
  9. छवियाँ चपटा और शरण द्वारा प्रदान MFP-3D सॉफ्टवेयर का उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है.
  10. प्रत्येक छवि चार quadrants में विभाजित है और nucleosomes (चित्रा 5C, सही पैनल से ऊंचाई का पता लगाने के लिए प्राप्त कर रहे हैं सरणियों और ऊंचाई प्रोफाइल के माध्यम से खींचा जा सकता है अच्छी तरह से अलग सरणियों और कई मुफ्त हाथ लाइनों की एक स्पष्ट विचार प्राप्त करने के लिए डिजिटल रूप में तेजी से बढ़ी जा सकता है और 5D).
  11. कई ऐसी छवियों nucleosomes के कई सैकड़ों को शामिल सरणी के प्रत्येक प्रकार के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए. लंबाई प्रोफाइल, दर्ज वर्गीकृत और एमएस एक्सेल में प्लॉट किए जाते हैं.

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Representative Results

प्रोटोकॉल को वर्णन करने के लिए हम 12 संगठनों ने मिलकर की 601 स्थिति अनुक्रम (601 207 x 12) की 207 बीपी दोहराता मिलकर पुनः संयोजक Xenopus कोर histones और डीएनए से nucleosomal सरणियों का पुनर्गठन. हम पहले lyophilized कोर histones से देशी octamers इकट्ठा किया और फिर एक S200 स्तंभ (चित्रा 1 ए) का उपयोग FPLC द्वारा octamers शुद्ध किया. परिसरों बड़ा S200 स्तंभ से पहले elute. Histones आम तौर पर इस क्रम में elute: गैर विशिष्ट histone समुच्चय, histone octamer, H3/H4 टेट्रामर और H2A/H2B डिमर (चित्रा 1 ए). S200 स्तंभ से चोटियों एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया गया. शुद्ध किया octamer अंशों की जैल चार histone प्रोटीन (चित्रा 1 बी) के equimolar मात्रा का संकेत चाहिए. Xenopus H2A और H2B के बारे में केवल 200 दा से अलग है और इसलिए वे एसडीएस जैल पर एक बैंड के रूप में दिखाई देते हैं कि आणविक भार है कि ध्यान दें. H3/H4 tetramers और H2A/H2B dimers देखें बाद elute, लेकिन जाएगाhistone octamer पीक करने के लिए Y करीब. जो रखने के लिए भिन्न चयन करते समय यह वर्णलेख में octamer चोटी के अंत की ओर दिखने भिन्न त्यागने के लिए समझदारी है. इन अंशों गैर octameric histone परिसरों की वृद्धि हुई राशि हो सकती है. इस मामले में 64-67 nucleosomal सरणी पुनर्गठन (चित्रा 1) के लिए जमा और बच गए अंशों.

UltraScan भीतर बढ़ाया वैन Holde-Weischet विश्लेषण से प्राप्त किया जाता है कि अवसादन गुणांक के प्रसार को सही वितरण को देखने के दो अलग अलग तरीके हैं. लाल रेखा अवसादन गुणांक का अभिन्न वितरण का प्रतिनिधित्व करता है. ग्राफ पर किसी भी बिंदु के लिए, Y-अक्ष के बराबर या एक्स अक्ष पर संकेत दिया मूल्य से कम एक अवसादन गुणांक है कि नमूने के अंश को इंगित करता है. एक विषम नमूना सकारात्मक ढलान के साथ एक वक्र होगा, जबकि इस प्रकार, एक खड़ी रेखा, एक समरूप नमूना का संकेत है. हरे रंग की लाइन डे हैअभिन्न वितरण की rivative. एक चोटी के तहत क्षेत्र है कि अवसादन गुणांक है कि नमूने के अंश के लिए आनुपातिक है. पूरी तरह से संतृप्त 601 207 x 12 nucleosomal सरणियों 29s 29 के एक अवसादन गुणांक है. 3 चित्र में दिखाया नमूने के लिए, डेटा सरणियों का लगभग 70% संतृप्त और 30% संतृप्त कर रहे हैं कि संकेत मिलता है.

परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी विट्रो में chromatin संगठन का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय पूरक दृष्टिकोण को एक उभरती हुई तकनीक से चला गया है. यहाँ हम पुनर्गठन के बाद टेम्पलेट संतृप्ति की हद तक स्थापित करने के लिए विश्लेषणात्मक ultracentrifugation के साथ AFM का इस्तेमाल किया है. चित्रा 6 में इमेजिंग के लिए इस्तेमाल ~ 27s सरणियों (चित्रा -4 ए) के बहुमत AFM और नीलामी के परिणाम के बीच उत्कृष्ट समझौते का प्रदर्शन, 10-11 nucleosomes (चित्रा 4 बी) निहित. यहां प्राप्त AFM परिणाम इस प्रकार यह मान्यदृष्टिकोण और यह nucleosomal सरणियों निस्र्पक के लिए एक विश्वसनीय तकनीक बनाते हैं.

Histone प्रोटीन Σ276 सामने आया, प्रोटीन सेमी -1 एम -1 आण्विक वजन दा
H2A 4350 13,960
H2B 7,250 13,774
H3 4640 15,273
H4 5,800 11,236
Octamer 44,080 108,486

तालिका 1. विलुप्त होने गुणांक और Xenopus laevis कोर histones और renatured histone octamer की आणविक भार.

चित्रा 1
चित्रा 1. धारा 2 में वर्णित के रूप S200 स्तंभ से ए क्षालन प्रोफ़ाइल. के बारे में 44 मिलीलीटर में छोटे शिखर बड़े histone समुच्चय की वजह से है. 67 मिलीलीटर में प्रमुख शिखर histone octamers है. 76-90 मिलीलीटर से व्यापक कंधे H3/H4 tetramers और H2A/H2B dimers S200 स्तंभ से चयनित अंशों की. बी 20% एसडीएस लेख हैं. वे गैर octameric histone परिसरों से दूषित होने की संभावना कम से कम कर रहे हैं के रूप में octamer शिखर से जल्दी भिन्न एकत्र किया जाना चाहिए. इस मामले में 64-67 जमा और nucleosomal सरणी पुनर्गठन के लिए बच गए अंशों. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. ला के साथ 3,000 rpm पर एकत्र एक भी स्कैन की ए ProteomeLab सॉफ्टवेयर स्क्रीन पर कब्जा (bels) जोड़ा गया. नमूना यह कम गति पर तलछट नहीं करता है ध्यान दें. एकल स्कैन नीलामी सेल स्कैन के लिए माप की सीमा (कदम 4.6) UltraScan कार्यक्रम (गयी लेबल के साथ) 26 का उपयोग कर प्राप्त अवसादन वेग स्कैन की एक श्रृंखला की. बी स्क्रीन पर कब्जा स्थापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. स्कैन की इस श्रृंखला के विश्लेषण के लिए डेटा सेट (5.1 कदम देखें) उत्पन्न करने के लिए संपादित किया जाता है.

चित्रा 3
चित्रा 3. UltraScanII से एक स्क्रीन पर कब्जा. लाल और हरे रंग की लाइनों UltraScan में अवसादन गुणांक के वितरण को देखने के लिए दो अलग अलग तरीके हैं. हरी व्युत्पन्न है, जबकि लाल रेखा, अवसादन गुणांक का अभिन्न वितरण है. व्याख्या पर अतिरिक्त जानकारी परिणामों अनुभाग में पाया जा सकता है.


चित्रा 4. AFM. औसत अवसादन गुणांक का संकेत माउस octamer साथ इकट्ठे 601 207 x 12 सरणियों के लिए ए अवसादन वेग प्रोफाइल 27s है. बी ए में यही सरणियों AFM द्वारा imaged थे और कई छवियों में गिना nucleosomes की संख्या एमएस एक्सेल में प्लॉट किए जाते थे. साजिश सरणियों के बहुमत. सी. ए 500 x 500 लिंकर डीएनए के साथ 601 207 x 12 nucleosome सरणियों की एनएम स्कैन स्पष्ट रूप से दिखाई नीलामी डेटा corroborating 10-11 nucleosomes था कि संकेत दिया. शीर्ष सही पैनल आयाम का पता लगाने और मध्यम सही पैनल सी में दिखाया गया सरणी के लिए चरण ट्रेस है. नीचे सही पैनल बाईं तरफ लेकिन nucleosome की ऊंचाई प्रोफ़ाइल निर्धारित करने के लिए nucleosomes के माध्यम से तैयार एक मुक्त हाथ रेखा के साथ दिखाया गया है कि एक ही ऊंचाई का पता लगाने हैएस. ऊपर छवि में nucleosomes के डी. लम्बाई प्रोफाइल के पहले 40 रिपोर्ट में सभी nucleosomes 1.5-2.5 एनएम ऊंचाई भीतर है कि सीमा प्रदर्शित करता है.

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Discussion

मॉडल nucleosomal सरणियों chromatin संरचना और समारोह की इन विट्रो अध्ययन के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण हैं. उदाहरण के लिए, वे व्यापक रूप से हल 30-34 में chromatin फाइबर संघनन की व्यवस्था का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और यह संभव है एक tetranucleosome 35 के एक एक्स - रे संरचना प्राप्त करने के लिए बनाया गया है. अभी हाल ही में वे विशिष्ट कोर histone वेरिएंट, म्यूटेंट और posttranslational संशोधनों 14-16,36 की संरचनात्मक प्रभाव का गूढ़ रहस्य में उपयोगी साबित हुए हैं. यहाँ हम nucleosome स्थिति डीएनए और पुनः संयोजक कोर histones से मॉडल nucleosomal सरणियों की विधानसभा के लिए एक सामान्य विधि का वर्णन.

शुद्ध किया octamers और 601 207 x 12 डीएनए से nucleosomal सरणियों के पुनर्गठन क्रमिक रूप से 2 एम 2.5 मिमी से NaCl एकाग्रता कम है कि कई डायलिसिस कदम शामिल सीधा है. प्रोटोकॉल का सबसे कठिन हिस्सा वांछित मंदिर पैदावार कि एक आर मान का उपयोग करने के लिए हैथाली संतृप्ति स्तर. उचित आर मूल्य पहले एक छोटे पैमाने पर अनुभव से निर्धारित है और फिर प्रयोगों के लिए इस्तेमाल nucleosomal सरणियों उत्पन्न करने के लिए एक बड़े पैमाने पर दोहराया है. हमारे मामले में, हम ज्यादातर डीएनए प्रति 12 nucleosomes साथ संतृप्त 601 207 x 12 डीएनए टेम्पलेट्स प्राप्त करने के लिए प्रयास कर रहे थे. एक पूरी तरह से संतृप्त 601 207 x 12 nucleosomal सरणी के अवसादन गुणांक 29 S है ~ 27s 29 में डीएनए तलछट प्रति केवल 11 nucleosomes साथ ही डीएनए टेम्पलेट है. इस प्रकार, विश्लेषणात्मक ultracentrifuge में अवसादन वेग पुनर्गठन के बाद nucleosome संतृप्ति स्तर को निर्धारित करने के लिए एक बहुत ही संवेदनशील तरीका प्रदान करता है. हम एक प्रसार को सही अवसादन गुणांक वितरण जो पैदावार बढ़ाकर वैन Holde-Weischet विधि का उपयोग कर, हमारे डेटा का विश्लेषण किया. यह सजातीय या विषम नमूना पुनर्गठन के बाद है कि कैसे एक कहता है, क्योंकि यह जानकारी आवश्यक है. दूसरे शब्दों में, एक 601 207 x 12 डीएनए टेम्पलेट के लिए, यहचित्रा 3, बढ़ाया वैन 1.1 के एक अनुसंधान में पुनर्गठित 601 207 x 12 nucleosomal सरणियों की Holde-Weischet विश्लेषण के परिणामों से पता चलता है डीएनए प्रति 12 nucleosomes, डीएनए प्रति 11 nucleosomes, आदि है कि नमूने के अंश इंगित करता है जिसमें मोटे तौर पर सरणियों की 30% संतृप्त खत्म हो गई हैं. नमूने की उपयोगिता आम तौर पर संतृप्त सरणियों का प्रतिशत से बंधा है, लेकिन कुछ अनुप्रयोगों के बहुत समरूप और / या संतृप्त सरणियों की आवश्यकता हो सकती अंदर सरणियों का उपयोग किया जाएगा प्रयोगों पर निर्भर है. तरीकों का एक नंबर nucleosomal सरणियों की एकरूपता और संतृप्ति में सुधार लाने के लिए मौजूद हैं.

इस मामले में oversaturated सरणियों 2 MgCl 37 के अलावा पर ​​चयनात्मक तेज़ी से हटाया जा सकता है. अधिक समरूप सरणियों भी sucrose ढाल centrifugation, प्रारंभिक जेल वैद्युतकणसंचलन, और आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी 10,13 का उपयोग नमूना सफ़ाई के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. एक संशोधित परमाणुcleosomal सरणी पुनर्गठन विधि नमक डायलिसिस 38,39 के माध्यम से पुनर्गठन से पहले नमूने के लिए कम प्रतियोगी डीएनए जोड़ने के लिए कहता है. यह एक से अधिक डीएनए टेम्पलेट saturating बिना histone octamer की एक अतिरिक्त के साथ nucleosomal सरणियों इकट्ठा करने के लिए अनुमति देता है. Nucleosomal सरणियों संभावना प्रतियोगी डीएनए और अतिरिक्त histones को हटाने के लिए एक शुद्धि कदम की आवश्यकता होगी प्रतियोगी डीएनए का उपयोग कर पुनर्गठन किया.

यहां तक ​​कि छोटे पैमाने पर पायलट सरणी विधानसभाओं के बाद, यह एक बड़े पैमाने पर पुनर्गठन nucleosomal सरणियों ठीक से संतृप्त नहीं किया जाएगा कि संभव है. नमूने में टेम्पलेट डीएनए और histone octamer बर्बाद कर से बचने के क्रम में, यह अधिक या संतृप्त सरणियों के तहत तय करने के लिए संभव है. सरणियों संतृप्त खत्म हो गई हैं, तो अतिरिक्त डीएनए नमूने के लिए जोड़ा जा सकता है. सरणियों संतृप्त के तहत कर रहे हैं, तो अतिरिक्त octamer यह सही करने के लिए जोड़ा जा सकता है. हालांकि, पहले से ही कम नमक में dialyzed सरणियों को octamer जोड़ने हदबंदी octamer परिणाम कर सकते हैं. अतिरिक्त ओ जोड़ने हैंctamer या डीएनए, सरणियों थोक नमूना करने के लिए अतिरिक्त octamer या डीएनए जोड़ने से पहले वापस 2 एम NaCl में सरणियों dialyze लिए. 3.4 कदम के रूप में प्रति कम नमक को उच्च से तय नमूने लिए कदम डायलिसिस दोहराएँ. सरणियों को सही करने के क्रम में जोड़ने के लिए octamer की राशि संतृप्त सरणियों 29 के तहत के लिए अवसादन गुणांक से अनुमान लगाया जा सकता है. Nucleosomal सरणियों का नमूना समायोजन करने के बाद, संतृप्ति स्तर की माप एक बार फिर से बनाया जाना चाहिए.

AFM nucleosomal सरणियों निस्र्पक के लिए एक शक्तिशाली तरीका है, यह जटिल और एक श्रम गहन प्रक्रिया है. यह यह छोटे पैमाने reconstitutions स्क्रीनिंग के लिए एक गरीब तकनीक है, लेकिन बड़े पैमाने पर नमूने के लक्षण वर्णन के लिए और chromatin संगठन के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट तकनीक बनाता है. पहले हम "अति संवेदनशील" भी कम 2 MgCl सांद्रता था कि एक macroH2A विलोपन का निर्माण द्वारा उत्पन्न "मैक्रो" कण कल्पना करने के लिए AFM का इस्तेमाल किया है. Likewiएसई, Montel एट अल. (2009) H2A बीबीडी संस्करण nucleosome सरणियों जंगली प्रकार सरणियों की तुलना में अधिक "खुला" होने का कारण बनता है कि पता चला है. इसलिए, AFM एक विश्वसनीय गुणवत्ता नियंत्रण के लिए तकनीक, साथ ही सामान्य में chromatin फाइबर संरचना के अध्ययन के लिए है.

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Disclosures

लेखक ब्याज की कोई संघर्ष है.

Acknowledgments

इस काम एनआईएच अनुदान GM45916 और GM66834 JCH करने और इस काम ए.के. को अंतर्राष्ट्रीय Rett सिंड्रोम फाउंडेशन से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था भी एनआईएच GM088409 और हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट के.एल. योगदान करने के लिए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich A3648-100ML
6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing Fisher 21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 Column GE 17-1069-01
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator Sartorius VS2031
12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing Fisher 08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine GE 17-0476-01
XL-A/I Analytical Ultracentrifuge Beckman-Coulter

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