Montering av nucleosomal arrayer från rekombinanta Kärn Histoner och nukleosom Positionering DNA

Summary

En metod presenteras för beredning av modell nukleosomala arrayer från rekombinanta kärnhistonerna och tandem upprepade nukleosomen positionering DNA. Vi beskriver också hur sedimenteringshastighet experiment i analytisk ultracentrifug och atomkraftsmikroskop (AFM) används för att övervaka omfattningen av nucleosomal array mättnad efter beredning.

Abstract

Kärn histon oktamerer som upprepade gånger är placerade längs en DNA-molekyl som kallas nukleosomala matriser. Nucleosomal matriser erhålles på ett av två sätt: rening från in vivo-källor, eller rekonstitution in vitro från rekombinanta kärnhistonerna och i tandem upprepade nukleosomen positionering DNA. Den sistnämnda metoden har fördelen att möjliggöra montering av en mer sammansättningsmässigt likformig och exakt positionerad nucleosomal array. Sedimentation velocity experiment i analytisk ultracentrifug utbyte information om storleken och formen av makromolekyler genom att analysera den takt med vilken de migrerar genom lösningen under centrifugalkraft. Denna teknik, tillsammans med atomkraftsmikroskopi, kan användas för kvalitetskontroll, vilket garanterar att de flesta DNA-mallar är mättade med nukleosomer efter beredning. Här beskriver vi de protokoll som är nödvändiga för att rekonstituera milligramkvantiteter längd och sammansättnings defined nukleosomala matriser lämpliga för biokemiska och biofysikaliska studier av kromatin struktur och funktion.

Introduction

Eukaryota genom existerar inte som naket DNA, utan snarare kompakteras och organiseras av bundna proteiner. Dessa komplex av DNA och protein är kända som kromatin. Den grundläggande repeterande enhet av kromatin är nukleosomen. En nukleosomen består av histon oktamer och 146 baspar av DNA lindas kring histon oktamer ca 1,6 gånger ^1. Den histon oktamer består av två exemplar vardera av kärn histoner H2A, H2B, H3 och H4. Kärn histon oktamerer som upprepade gånger är placerade längs en DNA-molekyl som kallas nukleosomala matriser. Den utökade struktur nukleosomala matriser har kallat 10 nm fiber eller "pärlor på ett snöre" struktur och finns in vitro under låga saltförhållanden ^2. Den 10 nm fiber kan kondensera till högre ordningens strukturer genom intra-array packning och / eller inter array oligomerisering ^2. Dessa högre ordningens strukturer kan induceras i närvaro av salter,eller kan påverkas genom bindning av kromatin arkitektoniska proteiner till nucleosomal array ^3,4. Nivåer av kromatin kompakte är omvänt korrelerad med graden av transkription in vivo ^5,6. Ny forskning belyser vikten av organisationsstruktur genomen i processer såsom differentiering, cancerutveckling, och övriga ^7,8. Användningen av nukleosomala matriser för att studera kromatin struktur och funktion har blivit utbredd. Här beskriver vi en metod för montering av nukleosomala matriser från rekombinanta kärnhistonerna och nukleosomen positionering DNA.

Användning av rekombinant DNA med tandemupprepningar av nukleosomen positioneringssekvenser möjliggör beredning av matriser som innehåller regelbundet åtskilda nucleosomes. Två av de mer populära positioneringssekvenser är 5S rRNA-gensekvens och "601"-sekvens ^9,10. Den 601-sekvensen härleddes från SELEX experiment och more starkt positionerar nucleosomes än 5S sekvensen ^11. Följaktligen är den linker-DNA längd av 601 arrayer mer homogen. Tandem upprepade nukleosomen positionering DNA erhålls genom gelfiltrering ^4,12. Rekombinanta histoner renas från E. coli under denaturerande betingelser ^13. Användningen av rekombinanta histoner tillåter en att noggrant styra histon sammansättning nukleosomala matriser. Till exempel, histoner kärna bär specifika mutationer ¹⁴ eller posttranslationella modifieringar ^15,16 kan ersätta vildtyp kärnhistonerna.

Sedimente hastighet experiment övervaka graden av sedimentering av makromolekyler i lösning under en tillämpad centrifugalkraft ^17. Detta ger information om storleken och formen av makromolekyler i ett prov. Sedimente hastighet experiment är därför ett lämpligt verktyg för att studera lösning tillstånd ändras i kromatin fiberstruktur på grund av kromatinkondensation ^18. Viktigt är det först nödvändigt att använda sedimentehastighetsexperiment som en kvalitetskontroll steg i nucleosomal array beredning. Om DNA och nucleosomes inte kombineras på rätt molförhållandet kan arrayer vara under-eller övermättad med kärn histoner. Således är den information de fått från sedimenteringshastighet experiment används för att säkerställa att DNA är ordentligt mättad med nukleosomer. Det är viktigt att använda alternativa metoder för att uppskatta mättnad av DNA med nukleosomer, speciellt om du arbetar med en tidigare uncharacterized DNA-mall. Därför beskriver vi också en metod för analys av nukleosomala arrayer med hjälp av atomkraftsmikroskopi (AFM). AFM är en kraftfull teknik som tillåter visualisering av effekterna av ett antal parametrar, såsom graden av mättnad, effekten av närvaron av histon varianter eller effekterna av MgCl ₂ ^19,20. AFM har också varit tillämped för att studera nukleosomen dynamik med intervall avbildning ^21. In vitro monterade nukleosomala 12-mer-arrayer är särskilt mottagliga för AFM studier därför att de hör hemma i rätt storleksordning för AFM avbildning ^22. I den aktuella studien har vi använt AFM av nukleosomala matriser som en kvalitetskontroll och som ett sätt att bekräfta data från AUC ("se är att tro"). Förutom enkel visualisering, gör AFM mätning av höjdprofiler av prov som ett extra mått.

Protocol

1. Montering av rekombinanta kärnhistonerna till oktamerer

Bakgrund: Det första steget i nukleosomal array rekonstituering är att framställa nativa kärn histon oktamerer från lyofiliserade rekombinanta kärnhistonerna. Histonproteiner kombineras i lika stora molära mängder och monteras i histon oktamerer genom dialys proverna av ett denatureringsbuffert i återveckningsbuffert.

1. Rena och lyofilisera rekombinanta kärnhistonerna (H2A, H2B, H3, H4) som beskrivs ^13.
2. Lös upp cirka 5 mg av varje lyofiliserad kärna histon i 3 ml av uppveckling buffert (6 M guanidin-HCl, 20 mM Tris, pH 7,5, 5 mM DTT). Låt varje portion för att lösa upp i minst en timme. Se till att inget protein förblir på sidorna av behållaren.
3. Mät absorbansen hos varje histon vid 276 nm med användning av uppveckling buffert som referens.
4. Beräkna molariteten av varje histon använder sina extinktionskoefficienter (Se Tabell 1 Xenopus histone extinktionskoefficienterna). Jämför absorbansen bestämdes koncentrationen av histon till den lyofiliserade torrvikten, och uppskattning om majoriteten av proteinet är upplöst.
5. Bestäm vilken histone du har minst antal mol, eftersom detta kommer att vara den begränsande antalet mol för alla histoner.
6. Kombinera histonerna i lika stora molära mängder och späd med uppveckling buffert till en slutlig koncentration av 1 mg / ml.
7. Placera provet i 6-8 kDa MWCO dialysslangen. Försegla röret och placera i två liter kall återvikning buffert (2 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 5 mM β-merkaptoetanol).
8. Dialysera provet under 18 timmar vid 4 ° C med omrörning. Se till dialysslangen kan rotera fritt och kraftfullt, annars histonerna kan utfällas.
9. Ändra dialysbufferten två gånger under 18 timmar perioden (dvs. ändra återvikningsbufferten ungefär var 6 tim tills gjort). Även om fällning bildas inte kastaprovet kan vissa oktamer återvinnas trots att avkastningen kommer att minska.

OBS: Se steg 2.1-2.2 för att förbereda kolumn jämvikt för nästa dag.

2. Rening av Histon oktamerer genom storleksuteslutningskromatografi

Bakgrund: Efter att sluta med avsnitt 1, kommer proven att innehålla histon oktamerer samt andra histonkomplex såsom kross, H3/H4 tetramers och H2A/H2B dimerer. Histon oktamerer kommer att renas bort från dessa andra komplex med användning av storlekssorterande kromatografi (SEC).

1. Anslut en HiLoad 16/60 Superdex200 16/60 kolonn (S200) till ett FPLC-system. Se till att luftbubblor inte kommer in i systemet.
2. Rengör S200-kolonn med 0,2 | am filtrerat vatten. Använd en flödeshastighet av 0,3 ml / minut och ställa in en mottrycksgräns 0,5 MPa. Se till att du har tillräckligt med vatten och låt den kolumnen att rengöra över natten.
3. Jämvikta S200-kolonn och prov slinga av FPLC med hjälp av återveckningsbuffert. Använd 1 L av 0,2 pm filtrerad återvikningsbufferten. Flödesåterveckningsbuffert genom kolonnen med en hastighet av 1 ml / min och ett maximalt tryck av 0,5 MPa under ca 2 timmar.
4. Jämvikta en Vivaspin centrifugalkoncentrator (50 kDa MWCO) med 1 ml återveckningsbuffert. Avlägsna prov från dialysslangen och centrifugera provet vid 4 ° C för att avlägsna eventuella fällningar. Pipetprovvätskan i anrikningsverket. Koncentrera provet till en volym av ca 500 | il.
5. Ta det koncentrerade oktameren provet till en ny behållare och skölj koncentratorn med 1 ml återveckningsbuffert. Koncentrera skölj ner till 500 l, och lägg till den oktamer provet. Detta bidrar till att rädda någon oktamer kvar i anrikningsverket.
6. Centrifugera provet i ett 1,5 ml mikrofugrör under 5 min vid 10000 rpm vid 4 ° C. Samla upp supernatanten och överföra till ett nytt rör. Detta bidrar till att ta bort eventuell fällning innan du lägger provet på FPLC.
7. Ladda provet på S200 kolonnen. Fyll på högst 1,5 ml total volym eller 15 mg oktamer i en enda rening.
8. Eluera provet med nybakade återvikningsbufferten. Använd en flödeshastighet av 1 ml / min och en mottrycksgräns 0,5 MPa. Använd två kolonnvolymer (400 ml) återveckningsbuffert och samla upp 2 ml fraktioner. Övervaka absorbansen vid 280 nm under eluering. De olika arter kommer att eluera i minskande storlek. Histon aggregat brukar eluera vid ca 45 ml, oktameren på ca 65 ml, och dimer vid cirka 84 ml (Figur 1).
9. Analysera elueringsfraktionerna från toppar av intresse genom att köra prover på en 18-20% SDS-PAGE. Fraktioner innehållande renade oktamerer bör ha lika molära mängder av de fyra kärn histonproteiner (Figur 1).
10. Slå samman fraktionerna som innehåller renade oktamerer och koncentrera till ≤ 15 mg / ml med en Vivaspin centrifugal filter. Om den lämnas utspädda, kan oktamerer ta avstånd into H2A/H2B dimerer och H3/H4 tetramerer.
11. Bestäm oktamer koncentration genom mätning av absorbansen vid 280 nm och beräkna med hjälp av extinktionskoefficienten av tabell 1.
12. Histon oktamerer kan hållas kort sikt återveck buffert vid 4 ° C. Om lagras lång sikt kommer de oktamerer vara mer stabil vid -20 ° C och i en 50%-ig glycerollösning. Oktamerer lagrats i glycerol bör dialyseras till frisk återvikningsbufferten före absorbansmätningar och användning i nukleosomala array reconstitutions.

3. Beredning av nucleosomal matriser från DNA och renade oktamerer

Motivering: Beredning av nukleosomala matriser kräver att histon oktamerer och mall-DNA kombineras vid specifika molära förhållanden. Blandningar av DNA och histon oktamerer i 2 M NaCl är steg dialyseras in i buffertar av minskande jonstyrka. En gradvis förändring till lägre salt garanterar korrekt nukleosomen bildning. Erhållande nucleosomal arrayer med den önskade nivån av histon oktamer mättnad av mall-DNA kräver småskaliga provnings reconstitutions följt av en storskalig preparativ rekonstitution. De lämpliga villkor som de småskaliga reconstitutions används för att styra den förberedande beredning.

1. Rena tandem upprepade nukleosomen positionering DNA som beskrivs ^4,12. Kortfattat, isolera plasmid-DNA med användning av ett Qiagen GigaPrep kit eller en liknande produkt. Ställ upp ett restriktionsenzym smälta för att frigöra mallen DNA och smälta plasmid-DNA i mindre bitar (≤ 700 bp). Den mall-DNA kan sedan renas bort från de små plasmid-DNA-rester med användning av storlekssorterande kromatografi (SEC). En gravitation matad kolumn, med en höjd av ca 115 cm packad med Sephacryl S-1000 pärlorna är tillräcklig för rening av 601 ^207bp x 12mer DNA.

Obs: För plasmid-DNA-rening till minskad kostnad men ökade effort, kan en använd alkalisk lys med fenol / kloroform, DNA-rening för att isolera plasmid-DNA från E. coli ^23,24. Strategier för att separera templat-DNA från plasmid-DNA kan variera med förändringar i DNA-templat storlek. För SEC är det viktigt att inrätta restriktionsenzym smälta på ett sätt som maximerar skillnaden i storlek mellan mallen och plasmid-DNA.

2. Fastställ vilka molförhållanden (R) som ska användas för reconstitutions. R är lika med förhållandet av mol av oktamer till moler DNA repeat. För första småskaliga försök, r värden på 0,9, 1 och 1,1 är lämpliga, om avsikten är att erhålla mättade nukleosomala matriser.
3. Förbered småskaliga prover genom beräkning av mängden oktamer att lägga till ungefär 18 ng DNA för varje molförhållande som skall testas. Blanda DNA och histon oktamerer. Den slutliga koncentrationen av NaCl i provet ska vara ≥ 2 M, och den slutliga koncentrationen av DNA bör vara cirka 0,3 mikrogram / l. De slutliga provbuffertbetingelser bör också innehålla 10 mM Tris, pH 7,8, och 1 mM EDTA.
4. Proverna är nu klara för dialys. Ladda proverna i 12k-14k MWCO dialysslangen. Dialysera proverna mot 2L buffert av minskande jonstyrka enligt följande.

Komponenter i alla buffertar: 10 mM Tris pH 7,8, 1 mM EDTA. Buffert 1 (lägg 1 M NaCl, 1 mM DTT) under 5-6 timmar. Buffert 2 (lägg till 0,75 M NaCl, 1 mM DTT) över natten. Buffert 3 (lägg till 2,5 mM NaCl, 1 mM DTT) under 5-6 timmar. Buffert 4 (lägg till 2,5 mM NaCl, 0,1 mM PMSF) över natten.

5. Ta bort proverna från dialysslangen och gå vidare till avsnitt 4-6. Om de småskaliga prov ger önskat resultat, upprepa stegen i avsnitten 3-6 i stor skala.

OBS: För att spara resurser, bör småskaliga prov har den minimivolym som krävs för att räcka för nedströms screeninganalyser. För att ha enough prov för sedimentering hastighet och AFM experiment som listas här, 50 ^ prover vid 0,3 mg / ml DNA är lämpliga. Storleken på stor skala, förberedande prov är beroende av den avsedda användningen. En storskalig prov ska framställas på samma sätt som de småskaliga prov.

4. Sedimente Velocity Analys rekonstituerad nucleosomal matriser

Bakgrund: Sedimente hastighet experiment i Beckman Xl-A / I analytisk ultracentrifug avkastnings information om storleken och formen på molekyler i lösning på. Sedimentehastighetsförsök utförda under låga saltförhållanden används för att bestämma i vilken utsträckning de ombildade arrayer är mättade med nukleosomer.

1. Späd ut provet till en absorbans ca 0,5 vid 260 nm med användning av TEN-buffert (10 mM Tris pH 7,8, 1 mM EDTA, 2,5 mM NaCl). Fyll på 400 ul av provet i en cell med en två sektor mittpunkten, med provet på en sida och den Reference (TEN-buffert) på den andra ^25. Förvara referens menisken högre än prov menisken (dvs. lägga 420 l referenslösning).
2. Fyll på celler i rotorn, och rikta in de celler på rätt sätt med hash märken på botten av cellerna och rotorn ^25. Damm försiktigt linserna i cellerna med hjälp av tryckluft.
3. Slå på XL-A/XL-I centrifug, sätt i rotorn, och fästa och säkra optiken som beskrivs i manualen. Öppna Proteome Lab programvara och välj filen: nytt.
4. Inrätta en scan körning vid 3000 varv per minut och en temperatur av 25 ° C. Enligt alternativ väljer stopp efter senaste genomsökningen, och kör radial kalibrering (radial kalibrering behövs inte om rotorn var den sista rotorn används av AUC).
5. För varje cell, namnge proverna väljer en våglängd (260 nm), väljer absorbans, och välj en spara fil plats på din dator. Börja enda skanning loppet.
6. Använd den enda skanning för att bestämma lämplig raringa scan längd (Figur 2A). Minskning av längden på den cell som ska skannas minskar tidskörning. Men se till att inkludera prov menisken och förlänga slutet mycket nära eller på botten av cellen.

Obs: Enstaka avsökningar tillåta mätstället förkortas genom utgångs mätningar just innan provet menisken (Figur 2A). De flesta av de avsökningar som genereras under AUC körningen bör ha randfraktioner senaste menisken liksom stabil platåer (Figur 2B). Smutsiga linser på AUC celler kan generera skanningar med stora spikar, kan dessa påverkar analysen av data. Den Ultrascan programvaran innehåller en handbok som är en stor resurs för information om analysen av analytiska ultracentrifuge uppgifter ^26.

7. Använda XL-A/XL-I kontrollpanel, ange en hastighet på 0 och tryck på start. Detta kommer att förmå centrifugkammaren för att dra ett vakuum och allaow temperaturen i kammaren till jämvikt. Vänta 1 timme för att möjliggöra temperatur jämvikt innan en körning.
8. Använd programmet för att ställa in körningen upp till önskad hastighet och antalet skanningar. Högre hastigheter ökar upplösningen, men man bör samla in minst 20 skanningar (helst mer) innan provet har sedimenterat till botten av cellen. Det är bekvämt att lägga över de senaste skannar (genomförda i alternativmenyn) för att övervaka utvecklingen av körningen och kontrollera eventuella problem som läckande celler. Övervaka de första skanningar för att säkerställa korrekt funktion.

5. Redigering och analysera Sedimente Velocity Data

Bakgrund: Råsedimentehastighetsdata ska analyseras av ett program som ger en spridning-korrigerad sedimentationskoefficient fördelning. Denna information i sin tur indikerar den fraktion av ett rekonstituerat prov som innehåller en given mättnadsnivå, t.ex.

1. Använd AUC dataanalys program som Ultrascan för att redigera data ^26. Redigering av skannade data måste göras för varje cell och skapar en datauppsättning för efterföljande analys. Korrekt redigering av skanningar innebär att definiera prov menisk, begränsa antalet uppgifter som ett område av intresse, och att definiera baslinjen samt platåregioner (Figur 2). Oönskade skanningar kan också tas bort ur datamängden på denna punkt. Men eftersom det är möjligt att avlägsna oönskade läsningar under analysen, är det rekommenderat att alla avsökningar hållas vid denna punkt.
2. Vi rekommenderar starkt att den förbättrade van Holde-Weischet metod användas för att analysera data ^27. Denna analysmetod korrigerar för effekterna av diffusion under loppet av körningen och ger den integrerade distributionen av sedimenteringskoefficienterna. I synnerhet, Kommer den förbättrade van Holde-Weischet metoden (som genomförts i Ultrascan) möjliggöra införandet av skanningar som saknar stabila platåer, eller som innehåller gräns fraktioner som inte har rensat menisken i analysen ^28.
3. Bestämma fördelningen av sedimenteringskoefficienterna för de församlade arrayer. Representativa resultat för 601 till 12 (207bp, 12-mer) nukleosomala matriser visas i figur 3.
4. Om en av de småskaliga prov innehåller arrayer med det önskade intervallet av sedimenteringskoefficienterna, sedan upprepa processen vid en ökad skala som börjar med avsnitt 3. Om inget av de småskaliga prov har en lämplig fördelning av sedimenteringskoefficient upprepa de småskaliga tester med en ny r område börjar vid sektion 3.

6. Visualisera nucleosomal arrayer Använda atomkraftsmikroskopi (AFM)

Bakgrund: AFM medger visualisering av mättnadsnivån av nucleosomal arrayer. Denna teknik kompletterar sedimenteringshastighet av AUC och restriktionsenzymdigestion som en kvalitetskontroll analys.

1. Med användning av metoder som beskrivs ovan, får en väl mättad nukleosomen array (Figur 5A).
2. Förbered APTES behandlade glimmerglasen genom att placera ~ 30 | il 1:1000 utspädning av kommersiellt (Sigma-Aldrich (3-aminopropyl) trietoxisilan A3648-100 ml) i 0,22 ^ m filtrerad nanorent vatten under 30 min.
3. Efter 30 min skölj APTES match med filtrerat vatten och försiktigt torka dem i ett kväveflöde.
4. Placera lämpligt utspädd nukleosomen array prov (~ 1,5 ng / l) i bilden, och inkubera täckt i rumstemperatur i 15 minuter.
5. Skölj prov av med filtrerat prov buffert, torka som förut, och plats glida på scenen av AFM (i detta fall en asyl forskning MFP-3D Atomic Force Microscope).
6. Börja med att avbilda 2 x 2 ìm skanningar med 512 linjer. Räkna antalet nukleosomer för att fastställa nivån på SAturation (Figur 5B).
7. Helst bör du bildområden i bilden med väl separerade nukleosomen arrayer.
8. För högre upplösning, kan en 500 x 500 nm scan erhållas (figur 5C).
9. Bilder kan plattas och analyseras med hjälp av MFP-3D-program som tillhandahålls av asyl.
10. Varje bild kan delas in i fyra kvadranter och zoomas in digitalt för att få en tydligare bild av väl separerade arrayer och flera fri hand linjer kan dras genom de arrayer och höjdprofiler erhålls för nukleosomer (figur 5C, högra panelen höjd spår och 5D).
11. Flera sådana bilder bör analyseras för varje typ av samling som omfattar flera hundra nucleosomes. Höjd profiler registreras, kategoriseras och plottas i MS Excel.

Representative Results

För att illustrera det protokoll vi beredda nukleosomala arrayer från rekombinanta Xenopus core histoner och DNA som består av 12 tandem 207 bp upprepningar av 601 positioneringssekvens (601 ²⁰⁷ x 12). Vi monteras först nativa oktamerer från lyofiliserade kärnhistonerna och renades sedan de oktamerer genom FPLC med användning av en S200-kolonn (Figur 1A). Större komplexen eluerar tidigare från S200-kolonn. Histoner elueras allmänt i denna ordning: ospecifika histon aggregat, histon oktamer, H3/H4 tetramer, och H2A/H2B dimer (Figur 1A). Topparna från S200-kolonn analyserades med SDS-PAGE. Gelerna enligt renade oktamer fraktionerna bör innehålla ekvimolära mängder av de fyra histonproteiner (Figur 1B). Observera att Xenopus H2A och H2B har molekylvikter som skiljer sig med endast cirka 200 Da och därmed de uppträder som ett enda band på SDS-geler. H3/H4 tetramers och H2A/H2B dimerer kommer eluera efter, men very nära histonen oktamer topp. När du väljer vilka fraktioner att hålla det är klokt att göra sig av fraktioner som förekommer mot slutet av oktameren toppen i kromatogrammet. Dessa fraktioner kan ha en ökad mängd av icke-octameric histonkomplex. I detta fall Fraktioner 64-67 slogs samman och sparades för nucleosomal array rekonstitution (Figur 1).

Inom Ultrascan finns det två olika sätt att se på spridning korrigerade fördelning av sedimente koefficienter som erhålls från den förbättrade van Holde-Weischet analys. Den röda linjen representerar den integrerade distributionen av sedimenteringskoefficienterna. För varje given punkt i diagrammet, indikerar y-axeln den fraktion av provet som har en sedimentationskoefficient lika med eller mindre än det värde som anges på x-axeln. Således är en vertikal linje är indikativ för ett homogent prov, medan ett heterogent prov kommer att ha en kurva med positiv lutning. Den gröna linjen är dederivaten av den integrala fördelning. Arean under en topp är proportionell mot den del av provet som har det sedimentationskoefficient. Helt mättade 601 ²⁰⁷ x 12 nukleosomala arrayer har en sedimenteringskoefficient 29S ^29. För provet som visas i fig 3, indikerar data att cirka 70% av uppsättningarna är mättade och 30% är övermättad.

Atomkraftsmikroskopi har gått från en ny teknik till en populär kompletterande strategi för att studera kromatin organisation in vitro. Här har vi använt AFM vid sidan av analytisk ultracentrifugering för att fastställa omfattningen av mall mättnad efter beredning. I fig 6 innehöll majoriteten av ~ 27S arrayer (figur 4A), som används för avbildning 10-11 nukleosomer (Figur 4B), vilket visar utmärkt överensstämmelse mellan AFM och AUC-resultaten. AFM-resultat som erhållits här validera alltså dettanärma sig och göra det till en tillförlitlig teknik för att karakterisera nukleosomala arrayer.

Histon Protein	Σ276, Ovikta Proteiner cm -1 M -1	Molekylvikt Da
H2A	4350	13960
H2B	7250	13774
H3	4640	15273
H4	5800	11236
Octamer	44080	108486

Tabell 1. Extinktionskoefficienterna och molekylvikterna för Xenopus laevis kärnhistonerna och renaturerad histon oktameren.

Figur 1. A. Elueringsprofil från S200 kolonn som beskrivs i avsnitt 2. Den lilla toppen vid ca 44 ml beror på stora histon aggregat. Den framträdande topp på 67 ml är histon oktamerer. Den breda skuldran 76-90 ml innehåller H3/H4 tetramers och H2A/H2B dimerer. B. 20% SDS-PAGE av utvalda fraktioner från S200 kolumnen. Tidiga fraktioner från oktameren toppen bör samlas in eftersom de är minst benägna att bli smittade av de icke-octameric histonkomplex. I detta fall fraktionerna 64-67 slogs samman och sparas för nucleosomal array beredning. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. A. ProteomeLab programvara skärmdump för en scan samlats vid 3000 varv per minut (med label till). Observera att provet inte sediment på denna låga varvtal. Den enda skanning används för att ställa de olika mätningar för AUC cell scan (steg 4,6). B. Screen capture av en serie av sedimente hastighet skannar erhålls med Ultrascan-programmet (med etiketter tillsatta) ^26. Denna serie av avsökningar redigeras för att alstra en uppsättning data för analys (se steg 5.1).

Figur 3. En skärmdump från UltraScanII. De röda och gröna linjer är två olika metoder för att visa fördelningen av sedimenteringskoefficienterna i Ultrascan. Den röda linjen är den integrerad distribution av sedimenteringskoefficienterna, medan den gröna är derivatet. Extra information om tolkning finns i resultatdelen.

Figur 4. AFM. A. Sedimentehastighetsprofil för 601 ²⁰⁷ x 12 arrayer monterade med musen oktamer anger genomsnittliga sedimentationskoefficient är 27S. B. Samma arrayer i en avbildades av AFM och antalet nukleosomer inräknade i flera bilder plottades i MS Excel. Tomten visade att en majoritet av matriser hade 10-11 nucleosomes bekräftande AUC-data. C. En 500 x 500 nm genomsökning av 601 ²⁰⁷ x 12 nukleosomen arrayer med länkaren DNA syns tydligt. Den övre högra panelen är amplituden spår och mitt högra panelen är den fas spår för matrisen som visas i C. Den nedre högra panelen är samma höjd spår visas till vänster men med fria händer linje dragen genom nukleosomer för att bestämma höjden profil nukleosomens.. D. Höjd profiler av nukleosomer i ovanstående bild visar att alla nucleosomes varierar inom 1,5-2,5 nm höjd som tidigare rapporterats ^40.

Discussion

Modell nukleosomala arrayer är ett mycket användbart verktyg för att studera kromatin struktur och funktion in vitro. Exempelvis har de använts i stor utsträckning för att studera mekanismen för kromatin fiber kondensation i lösning ^{från 30 till 34,} och gjort det möjligt att erhålla en röntgenbild strukturen hos en tetranucleosome ^35. På senare tid har de visat sig vara användbara för att dechiffrera de strukturella effekterna av specifika kärn histon varianter, mutanter och posttranslationella modifieringar ^14-16,36. Här beskriver vi en generell metod för montering av modellen nukleosomala matriser från nukleosomen positionering DNA och rekombinanta kärnhistonerna.

Den beredning av nukleosomala matriser från renade oktamerer och 601 ²⁰⁷ x 12 DNA är enkel, omfattar flera dialyssteg som sekventiellt sänker NaCl-koncentrationen från 2 miljoner till 2,5 mM. Den svåraste delen av protokollet är att använda ett r-värde som ger den önskade templattmättnadsnivå. Lämplig r-värdet bestäms först empiriskt i liten skala och sedan upprepas i större skala för att generera nukleosomala arrayer används i djurförsök. I vårt fall, vi försöker få 601 ²⁰⁷ x 12 DNA-mallar mestadels mättade med 12 nucleosomes per DNA. Den sedimentationskoefficient av en fullt mättad 601 ²⁰⁷ x 12 nucleosomal array är 29 S, medan samma DNA-mall med endast 11 nucleosomes per DNA sediment vid ~ 27S ^29. Således, sedimentehastighet i analytisk ultracentrifug ger en mycket känslig metod för att bestämma nukleosomen mättnadsnivå efter beredning. Vi analyserade våra data med hjälp av den förbättrade van Holde-Weischet metoden, vilket ger en spridning-korrigerad sedimentationskoefficient fördelning. Denna information är viktig eftersom den berättar en hur homogen eller heterogen provet är efter beredning. Med andra ord, för en 601 ²⁰⁷ x 12 DNA-mallen, detindikerar den del av provet som har 12 nucleosomes per DNA, 11 nukleosomer per DNA etc. Figur 3 visar resultaten av den förbättrade van Holde-Weischet analys av 601 ²⁰⁷ x 12 nukleosomala arrayer rekonstitueras under ett r på 1,1, där ungefär 30% av de matriser är över mättad. Nyttan av provet är vanligtvis kopplad till andelen mättade matriser, men är beroende av experimenten uppsättningarna kommer att användas i. Vissa program kan kräva mycket homogena och / eller mättade matriser. Flera metoder finns för att förbättra homogeniteten och mättnad av nukleosomala matriser.

I detta fall är övermättade matriser skulle kunna avlägsnas genom selektiv utfällning vid tillsats av MgCl ₂ ^37. Mer homogena matriser kan också erhållas genom rening av prov med användning av sackarosgradientcentrifugering, preparativ gelelektroföres, och jonbyteskromatografi ^10,13. En modifierad nucleosomal array beredning metod kräver att lägga kort konkurrent DNA till proverna före beredning genom salt dialys ^38,39. Detta tillåter en att montera nukleosomala arrayer med ett överskott av histon oktamer utan att övermättning av DNA-mallen. Nucleosomal arrayer rekonstitueras med konkurrerande DNA kommer troligen att kräva ett reningssteg för avlägsnande av det konkurrerande DNA och extra histoner.

Även efter småskalig pilot array församlingar, är det möjligt att nukleosomala arrayer ombildade i stor skala inte kommer att vara ordentligt mättat. För att undvika slöseri mallen DNA och histoner oktamer i urvalet, är det möjligt att fastställa över eller under mättade matriser. Om uppsättningarna är över mättad, kan extra DNA sättas till provet. Om arrayer är under mättade, kan extra oktamer tillsättas för att rätta till det. Däremot kan lägga oktamer till arrayer redan dialyse i låg salt resultera oktamer dissociation. Om att lägga till extra octamer eller DNA till matriser, dialyze arrayer tillbaka till 2 M NaCl innan du lägger till extra oktameren eller DNA till samlingsprovet. Upprepa steg dialys för fasta prover från hög till låg salthalt enligt steg 3.4. Mängden oktamer att lägga till för att rätta till de arrayer kan uppskattas från sedimenteringskoefficienterna för under mättade arrayer ^29. Efter justering av urvalet av nukleosomala matriser, ska mätningar av mättnadsnivån göras på nytt.

Medan AFM är en kraftfull metod för att karakterisera nukleosomala matriser, är det komplicerat och en arbetsintensiv process. Detta gör det en dålig teknik för screening av småskaliga reconstitutions, men en utmärkt teknik för karakterisering av storskaliga prover och för studier av kromatin organisation. Tidigare har vi använt AFM för att visualisera "makro" partiklar som genereras av en macroH2A deletionskonstruktionen som var "hyper-känslig" till och med låga MgCl2-koncentrationer. Likewise, Montel et al. (2009) har visat att H2A Bbd varianten orsakar nukleosomen arrayer för att vara mer "öppen" i jämförelse med vildtyp arrayer. Därför är AFM en tillförlitlig teknik för kvalitetskontrollen, såväl som för studien av kromatin fiberstrukturen i allmänhet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	A3648-100ML
6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing	Fisher	21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 Column	GE	17-1069-01
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator	Sartorius	VS2031
12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing	Fisher	08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine	GE	17-0476-01
XL-A/I Analytical Ultracentrifuge	Beckman-Coulter