Versammlung der nukleosomalen Arrays von rekombinantem Core-Histone und DNA Nucleosome Positioning

Zusammenfassung

Es wird ein Verfahren für die Wiederherstellung von Modell nukleosomalen Arrays aus rekombinanten Histone und hintereinander wiederholt Nukleosomen-Positionierung DNA vorgestellt. Wir beschreiben auch, wie Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente in der analytischen Ultrazentrifuge, und Rasterkraftmikroskopie (AFM) werden verwendet, um das Ausmaß der nukleosomalen Array Sättigung nach Rekonstitution zu überwachen.

Zusammenfassung

Kern Histon Octamere, die wiederholt entlang eines DNA-Moleküls angeordnet sind nukleosomalen Arrays bezeichnet. Nukleosomalen Arrays werden in einem von zwei Wegen erreicht: Reinigung von in vivo-Quellen oder in vitro Rekonstitution von rekombinantem Core-Histone und tandemartig wiederholten DNA Nukleosom Positionierung. Das letztere Verfahren hat den Vorteil, dass für die Montage von einer in der Zusammensetzung einheitlich und genau positioniert nukleosomalen Array. Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente in der analytischen Ultrazentrifuge Ausbeute Informationen über die Größe und Form von Makromolekülen durch die Analyse der Geschwindigkeit, mit der sie durch Lösung unter Zentrifugalkraft migrieren. Diese Technik, die zusammen mit der Rasterkraftmikroskopie kann zur Qualitätskontrolle verwendet werden, so dass der Großteil der DNA-Templates werden mit Nukleosomen nach Rekonstitution gesättigt. Hier beschreiben wir die erforderlichen Milligramm-Mengen der Länge und der Zusammensetzung zu rekonstituieren d Protokolleefined nukleosomalen Arrays für biochemische und biophysikalische Untersuchungen der Chromatin-Struktur und Funktion.

Einleitung

Eukaryotischen Genomen existieren nicht als nackte DNA, sondern verdichtet und durch gebundene Proteine ​​organisiert. Diese Komplexe von DNA und Protein Chromatin. Die Grundstruktureinheit des Chromatins ist das Nukleosom. Ein Nukleosom umfasst Histonoktamer und 146 Basenpaare der DNA um die Histon-Oktamer gewickelt etwa 1,6 mal ^1. Die Histonoktamer wird von jedem der Core-Histone H2A, H2B, H3, H4 und zwei Kopien zusammen. Kern Histon Octamere, die wiederholt entlang eines DNA-Moleküls angeordnet sind nukleosomalen Arrays bezeichnet. Die erweiterte Struktur nukleosomalen Arrays hat als die 10 nm-Faser oder den "Perlen auf einer Schnur"-Struktur bezeichnet....

Protokoll

1. Montage von rekombinantem Core-Histone in Octamere

Begründung: Der erste Schritt in nukleosomalen Array Rekonstitution ist es, nativen Kern Histon Octamere aus lyophilisierten rekombinanten Histone vorzubereiten. Histon-Proteine ​​werden in äquimolaren Mengen kombiniert und durch Dialyse der Proben aus einem denaturierenden Puffer in Rückfaltungspuffer in Histon Octamere montiert.

1. Entschlacken und lyophilisiert rekombinanten Histone (H2A, H2B, H3, H4) wie beschrieben ^13.
2. Auflösen etwa 5 mg jeder lyophilisierten Kern Histon in 3 ml Entfaltungspuffer (6 M Guanidinium-HCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM DTT). Es j....

Ergebnisse

Um das Protokoll zu veranschaulichen wir rekonstituiert nukleosomalen Arrays aus rekombinanten Xenopus Histone und DNA, die aus 12 207 bp Tandem-Wiederholungen der Folge 601 Positionierung (601 ²⁰⁷ x 12). Wir haben zuerst zusammengebaut nativen Octamere aus lyophilisierten Histone und reinigte die Octamere durch FPLC mit einem S200-Säule (Abbildung 1A) dann. Größere Komplexe eluieren früher aus der Säule S200. Histone eluieren in der Regel in dieser Reihenfolge: nicht-spezifische His.......

Diskussion

Modell nukleosomalen Arrays sind ein sehr nützliches Werkzeug für die in vitro Untersuchung von Chromatin-Struktur und Funktion. Beispielsweise haben sie häufig verwendet, um den Mechanismus der Chromatinfaser Kondensation in Lösung ^30-34 untersuchen, und machte es möglich, eine Röntgenstruktur eines tetranucleosome ³⁵ erhalten. Vor kurzem haben sie nützlich bei der Entschlüsselung die strukturellen Auswirkungen der spezifischen Kern Histon-Varianten, Mutanten und posttranslationale Modifi.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
(3-Aminopropyl)triethoxysilan	Sigma-Aldrich	A3648-100ML
6-8 kDa MWCO Dialyseschlauch	Fisher	21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 Säule	GE	17-1069-01
Vivaspin 50 kDa MWCO Zentrifugalkonzentrator	Sartorius	VS2031
12-14 kDa MWCO Dialyseschlauch	Fisher	08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 Superfein	GE	17-0476-01
XL-A/I Analytische Ultrazentrifuge	Beckman-Coulter