Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Assemblage van Nucleosomale Arrays van Recombinant kernhistonen en Nucleosome Positioning DNA

Published: September 10, 2013 doi: 10.3791/50354
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biochemistry and Molecular Biology, Colorado State University

Summary

Een methode wordt gepresenteerd voor de reconstructie van model nucleosomale arrays van recombinante kernhistonen en tandem herhaalde nucleosoom positionering DNA. We beschrijven ook hoe sedimentatiesnelheid experimenten analytische ultracentrifuge en atomic force microscopie (AFM) worden gebruikt voor het monitoren van de mate van nucleosomale matrix verzadiging na reconstitutie.

Abstract

Kern histon octameren die herhaaldelijk zijn verdeeld langs een DNA-molecuul worden genoemd nucleosomale arrays. Nucleosomale arrays worden verkregen op twee manieren: zuivering uit in vivo bronnen of reconstitutie in vitro van recombinante kernhistonen en tandem herhaalde positionering nucleosoom DNA. Deze methode heeft het voordeel dat voor de montage van een qua samenstelling uniform en nauwkeurig gepositioneerd nucleosomale array. Sedimentatiesnelheid experimenten in de analytische ultracentrifuge opbrengst informaties grootte en vorm van macromoleculen door analyse van de snelheid waarmee ze migreren door oplossing onder centrifugale kracht. Deze techniek, samen met atomic force microscopie kan worden gebruikt voor kwaliteitscontrole, zodat de meerderheid van DNA-matrijzen verzadigd met nucleosomen na reconstitutie. Hier beschrijven we de protocollen noodzakelijk milligram hoeveelheden lengte reconstitueren en compositioneel defined nucleosomale arrays geschikt voor biochemische en biofysische studies van chromatine structuur en functie.

Introduction

Eukaryote genomen niet bestaan ​​als naakt DNA, maar eerder worden samengeperst en georganiseerd door gebonden eiwitten. Deze complexen van DNA en eiwitten bekend als chromatine. De basis repeterende eenheid van chromatine is de nucleosoom. Een nucleosoom bestaat uit histon octameer en 146 basenparen van het DNA rond de histon octameer ongeveer 1,6 keer 1. De histon octameer bestaat uit twee exemplaren elke kern histonen H2A, H2B, H3 en H4. Kern histon octameren die herhaaldelijk zijn verdeeld langs een DNA-molecuul worden genoemd nucleosomale arrays. De uitgebreide structuur van nucleosomale arrays is aangeduid als 10 nm vezel of "kralen aan een snoer" structuur aanwezig in vitro onder lage zoutconcentraties 2. De 10 nm vezel is in staat om condensatie in hogere orde structuren door intra-reeks verdichting en / of inter-array-oligomerizatie 2. Deze hogere orde structuren kunnen worden geïnduceerd in aanwezigheid van zouten,of kan worden beïnvloed door de binding van chromatine architectonische eiwitten aan de nucleosomale matrix 3,4. Niveaus van chromatine verdichting worden omgekeerd gecorreleerd met de snelheid van transcriptie in vivo 5,6. Recent onderzoek wijst op het belang van de structurele organisatie van genomen in processen zoals differentiatie, de ontwikkeling van kanker, en anderen 7,8. Het gebruik van nucleosomale arrays chromatinestructuur en functie te bestuderen is wijdverspreid. Hier beschrijven we een werkwijze voor de assemblage van nucleosomale arrays van recombinante kernhistonen en nucleosoom positionering DNA.

Met behulp van recombinant DNA met tandem herhalingen van nucleosoom positionering sequenties maakt de reconstitutie van arrays die regelmatige afstand nucleosomen bevatten. Twee van de meer populaire positionering sequenties 5S rRNA gensequentie en de "601"-sequentie 9,10. De 601 serie werd afgeleid van SELEX experimenten en more sterker positioneert nucleosomen dan de 5S-sequentie 11. Bijgevolg linker DNA lengte van de arrays 601 is homogener. Tandem herhaalde DNA nucleosoom positionering wordt verkregen door gelfiltratie 4,12. Recombinant histonen gezuiverd uit E. coli onder denaturerende omstandigheden 13. Het gebruik van recombinante histonen kan men de histon samenstelling van de nucleosomale arrays zorgvuldig controleren. Bijvoorbeeld, kernhistonen dragende specifieke mutaties 14 of post-translationele modificaties 15,16 kan worden vervangen voor wild type kernhistonen.

Sedimentatiesnelheid experimenten toezien op de snelheid van sedimentatie van macromoleculen in oplossing onder een toegepaste middelpuntvliedende kracht 17. Deze geeft informatie over de grootte en de vorm van macromoleculen in een monster. Sedimentatiesnelheid experimenten zijn dus een geschikt instrument voor het bestuderen oplossing staat veranderingen in chromatine vezelstructuur als gevolg van chromatinecondensatie 18. Belangrijker is, is het eerst nodig om sedimentatiesnelheid experimenten gebruiken als een kwaliteitscontrole stap in nucleosomale reeks reconstitutie. Als DNA en nucleosomen niet worden gecombineerd bij de juiste molaire verhouding, kan de arrays onder-of oververzadigd met kernhistonen. Aldus wordt de informatie uit sedimentatiesnelheid experimenten om te verzekeren dat de juiste DNA verzadigd met nucleosomen. Het is belangrijk om alternatieve methoden voor het schatten van de verzadiging van DNA met nucleosomen, vooral als die met een eerder niet gekenmerkte DNA template. Daarom hebben we ook een werkwijze beschreven voor het analyseren van nucleosomale arrays met behulp van atomic force microscopie (AFM). AFM is een techniek die het mogelijk maakt visualisatie van de effecten van een aantal parameters, zoals de mate van verzadiging, effect van de aanwezigheid van histon varianten of de effecten van MgCl2 19,20. AFM heeft ook toepassing geweested aan nucleosomen bestuderen met behulp van time lapse imaging 21. In vitro gemonteerd nucleosomale 12-meer arrays zijn bijzonder vatbaar voor AFM onderzoeken omdat zij behoren in de juiste maat bereik voor AFM beeldvorming 22. In de huidige studie hebben we gebruik gemaakt van de AFM nucleosomale arrays als kwaliteitscontrole, evenals een middel van het bevestigen van de gegevens van AUC ("zien is geloven"). Naast eenvoudige visualisatie, AFM kan gemeten hoogteprofielen monsters als extra metrisch.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Assemblage van Recombinant kernhistonen in octameren

Achtergrond: De eerste stap in nucleosomale scala reconstitutie is om inheemse kern histon octameren uit gevriesdroogde recombinant kernhistonen bereiden. Histon-eiwitten worden gecombineerd in gelijke molaire hoeveelheden en in histon octameren samengesteld door dialyseren de monsters uit een denaturerende buffer in hervouwingsbuffer.

  1. Zuiver en lyofiliseren recombinant kernhistonen (H2A, H2B, H3, H4) beschreven 13.
  2. Los ongeveer 5 mg elk gelyofiliseerd kern histon in 3 ml ontvouwen buffer (6 M guanidinium HCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM DTT). Laat elk aliquot te ontbinden gedurende ten minste een uur. Zorg dat er geen eiwit blijft aan de zijkanten van de houder.
  3. Meet de absorptie van elk histon bij 276 nm ontvouwen buffer als referentie.
  4. Bereken de molariteit van elk histon met behulp van hun extinctiecoëfficiënten (zie tabel 1 Xenopus histon extinctiecoëfficiënten). Vergelijk de absorptie bepaald concentratie van histon het gevriesdroogde drooggewicht en schatten als de meerderheid van het eiwit opgelost.
  5. Bepaal welke histon je de minste mol, omdat dit het beperken van het aantal mol voor alle histonen zal zijn.
  6. Combineer de histonen in gelijke molaire hoeveelheden en verdun met ontvouwen buffer tot een eindconcentratie van 1 mg / ml.
  7. Plaats het monster in 6-8 kDa MWCO dialysebuis. Sluit de buis en plaats in 2 L koude hervouwingsbuffer (2 M NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 5 mM β-mercapto-ethanol).
  8. Dialyseer het monster gedurende 18 uur bij 4 ° C onder roeren. Zorg ervoor dat de dialysebuis vrij en krachtig draaien, of anders de histonen kan neerslaan.
  9. Veranderen twee keer in de 18 uur periode (dwz verander de hervouwingsbuffer ongeveer elke 6 uur gaar worden) de dialysebuffer. Zelfs als neerslag wordt gevormd niet weggooienhet monster, kunnen sommige octameer worden teruggewonnen, hoewel de opbrengst wordt verlaagd.

Opmerking: Zie stap 2,1-2,2 om kolomequilibratiebuffer bereiden op de volgende dag.

2. Zuivering van Histone octameren by Size Exclusion Chromatography

Achtergrond: Na het sluiten van punt 1, zal monsters histon octameren evenals andere histon complexen zoals aggregaten, H3/H4 tetramers en H2A/H2B dimeren bevatten. Histon octameren weg zal uit deze andere complexen met grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) gezuiverd.

  1. Sluit een HiLoad 16/60 Superdex200 16/60 (S200) kolom om een ​​FPLC systeem. Zorg ervoor dat geen luchtbellen in het systeem.
  2. Maak de kolom S200 met 0,2 um gefilterd water. Gebruik een stroomsnelheid van 0,3 ml / min en stel een tegendruk grens van 0,5 MPa. Zorg ervoor dat je genoeg water en laat de kolom om 's nachts te reinigen.
  3. Equilibreer de S200 kolom en sample loop van de FPLC-hervouwingsbuffer. Gebruik 1 L van 0,2 urn gefiltreerd hervouwingsbuffer. Flow hervouwingsbuffer door de kolom met een snelheid van 1 ml / min en een maximale druk van 0,5 MPa gedurende ongeveer 2 uur.
  4. Equilibreer een Vivaspin centrifugale concentrator (50 kDa MWCO) met 1 ml hervouwingsbuffer. Verwijder het monster uit dialysebuizen en centrifugeer het monster bij 4 ° C om eventuele precipitaten te verwijderen. Pipetteer het monster supernatans in de concentrator. Concentreer het monster tot een volume van ongeveer 500 ul.
  5. Verwijder de geconcentreerde octameer monster naar een nieuwe container en spoel de concentrator met 1 ml hervouwingsbuffer. Concentreer de spoeling omlaag naar 500 pi, en voeg deze toe aan de octameer monster. Dit helpt om eventuele octameer nog in de concentrator redden.
  6. Spin het monster in een 1,5 ml microcentrifuge buis gedurende 5 min bij 10.000 rpm bij 4 ° C. Gebruik de bovenstaande vloeistof en over te dragen aan een nieuwe buis. Dit helpt om eventueel aanwezig neerslag te verwijderen voordat u het monster op de FPLC.
  7. Plaats het monster in de kolom S200. Plaats maximaal 1,5 ml totaal volume of 15 mg octameer in een zuivering.
  8. Elueer het monster met behulp van vers gemaakte hervouwingsbuffer. Gebruik een stroomsnelheid van 1 ml / min en een tegendruk grens van 0,5 MPa. Gebruik twee kolomvolumes (400 ml) hervouwingsbuffer en laat 2 ml fracties. Controleer de absorptie bij 280 nm tijdens elutie. De verschillende soorten zullen elueren in volgorde van afnemende grootte. Histon aggregaten meestal elueren bij ongeveer 45 ml, octameer ongeveer 65 ml en dimeer bij ongeveer 84 ml (figuur 1).
  9. Analyseer de elutiefracties van belangrijke pieken door het uitvoeren van steekproeven op een 18-20% SDS-PAGE. Fracties die gezuiverde octameren moeten gelijke molaire hoeveelheden van de vier kern histon-eiwitten (Figuur 1).
  10. Zwembad de fracties die gezuiverd octameren bevatten, en concentreer tot ≤ 15 mg / ml met een Vivaspin centrifugaal filter. Als links verdund, kan octameren distantiëren into H2A/H2B dimeren en H3/H4 tetramers.
  11. Bepaal de octameer concentratie door meting van de absorptie bij 280 nm en berekenen met de extinctiecoëfficiënt van tabel 1.
  12. Histon octameren kunnen op korte termijn worden bewaard in hervouwingsbuffer bij 4 ° C. Indien opgeslagen termijn zal de octameren stabieler zijn bij -20 ° C en 50% glycerol oplossing. Octameren opgeslagen in glycerol moet worden gedialyseerd in verse hervouwingsbuffer voordat extinctiemetingen en gebruik in nucleosomale reeks reconstructies.

3. Reconstitutie van Nucleosomale arrays van DNA en gezuiverd octameren

Rationale: Reconstructie van nucleosomale arrays vereist dat histon octameren en template-DNA worden gecombineerd op specifieke molaire verhoudingen. Mengsels van DNA en histon octameren in 2 M NaCl worden stap gedialyseerd in buffer afnemende ionsterkte. Een geleidelijke overgang naar lagere zout zorgt voor een goede vorming van nucleosomen. Het verkrijgen van nucleosomal arrays met het gewenste niveau van histon octameer verzadiging van het template-DNA vereist kleinschalige proef reconstructies, gevolgd door een grootschalige preparatieve reconstitutie. De door de kleine omvang reconstructies geschikte omstandigheden worden gebruikt om preparatieve reconstitutie leiden.

  1. Zuiver tandem herhaalde positionering nucleosoom DNA als beschreven 4,12. Kort isoleren het plasmide DNA met behulp van een Qiagen GigaPrep kit of een soortgelijk product. Set-up van een restrictie-enzym digest om de matrijs-DNA los en verteren het plasmide-DNA in kleinere (≤ 700 bp). Het matrijs-DNA kan vervolgens uit de kleine plasmide-DNA resten middels grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) gezuiverd. Een zwaartekracht gevoed kolom met een hoogte van ongeveer 115 cm gepakt met Sephacryl S-1000 kralen is voldoende voor zuivering van 601 x 12meer 207bp DNA.

Opmerkingen: Voor plasmide-DNA-zuivering tegen verminderde kosten, maar verhoogde effort, kan alkalische lysis gebruiken met fenol / chloroform DNA-zuivering om plasmide-DNA te isoleren uit E. coli 23,24. Strategieën voor het scheiden template DNA uit plasmide DNA kan variëren met wijzigingen in de matrijs-DNA formaat. Voor SEC is het belangrijk om de restrictie-enzym digest op een wijze waarbij het verschil in grootte tussen de matrijs en plasmide-DNA maximaliseert.

  1. Bepaal welke molaire verhoudingen (r) te gebruiken voor opnieuw samenstellen. R is gelijk aan de verhouding mol octameer mollen DNA herhalen. Voor initiële kleinschalige studies r waarden van 0.9, 1, 1.1 en zijn geschikt als de bedoeling is om verzadigde nucleosomale arrays verkrijgen.
  2. Bereid de kleinschalige monsters door berekening van octameer ongeveer 18 ug DNA, voor elke molverhouding te testen. Meng de DNA en histon octameren. De uiteindelijke concentratie van NaCl in het monster dient ≥ 2 M, en de eindconcentratie van DNA moeten circa 0,3 ug / ul zijn. De uiteindelijke steekproef buffer voorwaarden moet ook 10 mM Tris pH 7,8, en 1 mM EDTA.
  3. De monsters zijn nu klaar voor dialyse. Plaats de monsters in 12k-14k MWCO dialysebuis. Dialyseer de monsters tegen 2L buffer afnemende ionsterkte als volgt.

Onderdelen in alle buffers: 10 mM Tris pH 7,8, 1 mM EDTA. Buffer 1 (voeg 1 M NaCl, 1 mM DTT) gedurende 5-6 uur. Buffer 2 (voeg 0,75 M NaCl, 1 mM DTT) 's nachts. Buffer 3 (voeg 2,5 mM NaCl, 1 mM DTT) voor 5-6 uur. Buffer 4 (voeg 2,5 mM NaCl, 0,1 mM PMSF) 's nachts.

  1. Verwijder de monsters uit de dialysebuis en ga verder met secties 4-6. Als de kleine monsters leveren van de gewenste resultaten, herhaalt u de stappen in de secties 3-6 op de grote schaal.

Opmerking: Om hulpbronnen te behouden, moeten kleinschalige monsters de minimale omvang die nodig is om voldoende voor downstream screeningstesten hebben. Om e hebbennough monster voor de sedimentatie snelheid en AFM experimenten hier vermelde 50 pl monsters 0,3 mg / ml DNA geschikt. De omvang van grootschalige preparatieve monsters afhankelijk van hun beoogde gebruik. Een grootschalig monster moet worden bereid op dezelfde wijze als de kleinschalige monsters.

4. Sedimentatiesnelheid Analyse van gereconstitueerde Nucleosomale Arrays

Rationale: sedimentatiesnelheid experimenten de Beckman Xl-A / I analytische ultracentrifuge rendement informatie over de grootte en vorm van moleculen in oplossing. Sedimentatiesnelheid experimenten uitgevoerd onder zoutarm voorwaarden wordt gebruikt om te bepalen in hoeverre de gereconstitueerde arrays zijn verzadigd met nucleosomen.

  1. Verdun het monster met een absorptie ongeveer 0,5 bij 260 nm met TEN buffer (10 mM Tris pH 7,8, 1 mM EDTA, 2,5 mM NaCl). Plaats 400 pl monster in een cel met een twee sector middenstuk, met het monster enerzijds en de refece (TEN buffer) anderzijds 25. Houd de verwijzing meniscus hoger dan het monster meniscus (dwz voeg 420 ul referentie-oplossing).
  2. Plaats de cellen in de rotor, en lijn de cellen met behulp van de streepjes op de bodem van de cellen en rotor 25. Voorzichtig stof de lenzen van de cellen met behulp van perslucht.
  3. Zet de XL-A/XL-I centrifuge, plaatst u de rotor, en bevestig en zet de optiek zoals beschreven in de handleiding. Open de software Proteome Lab en selecteer een bestand: nieuwe.
  4. Het opzetten van een enkele scan draaien op 3000 rpm en een temperatuur van 25 ° C. Onder opties, selecteren stoppen na de laatste scan, en run radiale kalibratie (radiale kalibratie is niet nodig als de rotor was de laatste rotor gebruikt in de AUC).
  5. Voor elke cel, de naam van de monsters, selecteer een golflengte (260 nm), selecteert absorptie, en kies een bestand op te slaan locatie op uw computer. Begin de scan run.
  6. Gebruik de scan om de juiste ra bepalendial scanlengte (Figuur 2A). Het verminderen van de lengte van de cel die wordt gescand vermindert de looptijd. Echter, moet het monster meniscus zijn en zich uiteindelijk zeer dichtbij of op de bodem van de cel.

Opmerking: Single scans zodat het meetgebied door te beginnen metingen worden ingekort net voordat het monster meniscus (Figuur 2A). Het merendeel van de gegenereerde tijdens de AUC run scans moeten grens fracties langs de meniscus als stabiele plateaus (Figuur 2B). Vuile lenzen op de AUC cellen scans met grote pieken genereren, kunnen deze analyse van de gegevens beïnvloeden. De UltraScan software bevat een handleiding, die is een geweldige bron voor informatie met betrekking tot de analyse van de analytische ultracentrifuge data 26.

  1. Met behulp van de XL-A/XL-I bedieningspaneel, voer een snelheid van 0 en druk op start. Dit zal de centrifugeketel gevraagd een vacuüm en alle trekow de temperatuur van de kamer van het evenwicht. Wacht 1 uur om te zorgen voor temperatuurequilibratie voor het begin van een run.
  2. Gebruik de software om de aanloop voor de gewenste snelheid en het aantal scans in te stellen. Hogere snelheden resolutie vergroot, maar moet men tenminste 20 scans (bij voorkeur meer) verzamelen voordat het monster bezonken op de bodem van de cel. Het is handig om de laatste paar scans (bereikt in het optiemenu) overlay om de voortgang van de vlucht en controleren op mogelijke problemen, zoals lekkende cellen. Monitor de eerste paar scans om een ​​goede werking te garanderen.

5. Het bewerken en analyseren van sedimentatiesnelheid gegevens

Rationale: Ruwe sedimentatiesnelheid gegevens moeten worden geanalyseerd door een programma dat een diffusie-gecorrigeerde sedimentatiecoëfficiënt distributie oplevert. Deze informatie op zijn beurt geeft de fractie van een gereconstitueerde monster dat een bepaalde verzadiging niveau bevat, bijv.

  1. Gebruik AUC analyse software zoals UltraScan de data 26 te bewerken. Bewerken van scangegevens moet worden gedaan voor elke cel en creëert een dataset voor verdere analyse. Juiste bewerken scans omvat definiëren het monster meniscus, waardoor de gegevens aan een gebied van belang, en het definiëren basislijn en plateau's (Figuur 2). Ongewenste scans kunnen ook worden verwijderd uit de op dit moment gegevens. Aangezien het mogelijk is om ongewenste scans tijdens de analyse te verwijderen, wordt aanbevolen dat alle scans op dit punt gehouden.
  2. We raden de verbeterde busje Holde-Weischet methode worden gebruikt om de gegevens te analyseren 27. Deze analyse methode corrigeert voor de effecten van diffusie in de loop van de vlucht en levert de integrale distributie van sedimentatie coëfficiënten. In het bijzonder, De verbeterde van Holde-Weischet methode (zoals geïmplementeerd in UltraScan) zal zorgen voor de opname van scans die stabiele plateaus missen, of die grens fracties die niet de meniscus heeft gewist in de analyse 28 bevatten.
  3. Bepaal de verdeling van sedimentatie coëfficiënten voor de samengestelde arrays. Representatieve resultaten voor 601-12 (207bp, 12-mer) nucleosomale arrays worden getoond in Figuur 3.
  4. Als een van de kleine schaal monsters bevat arrays met het gewenste bereik van sedimentatie coëfficiënten, en herhaal het proces op een verhoogd schaal te beginnen met hoofdstuk 3. Als geen van de kleine schaal monsters heeft een goede verdeling van sedimentatie coëfficiënten herhaal de kleine schaal proeven met een nieuwe r reeks vanaf deel 3.

6. Visualiseren Nucleosomale Arrays behulp Atomic Force Microscopy (AFM)

Rationale: AFM maakt visualisatie van het niveau van verzadiging van nucleosomal arrays. Deze techniek vormt een aanvulling op sedimentatie snelheid door de AUC en met restrictie-enzymen als een kwaliteitscontrole test.

  1. Met werkwijzen die hierboven beschreven, verkrijgen een goed verzadigde nucleosoom array (figuur 5A).
  2. Bereid APTES behandeld mica dia door het plaatsen ~ 30 pi 1:1000 verdunning van commerciële (Sigma-Aldrich (3-aminopropyl) triethoxysilaan A3648-100ML) bij 0,22 micrometer gefiltreerd nanozuiver water gedurende 30 minuten.
  3. Na 30 minuten spoel de APTES af met gefilterd water en voorzichtig droog ze met een stikstofstroom.
  4. Plaats geschikte verdunde nucleosoom matrix monster (~ 1,5 ng / ul) op de dia en incubeer onder bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
  5. Spoel proeven af ​​met gefilterd monster buffer, droog als hierboven, en plaats glijbaan op het podium van de AFM (in dit geval een Asiel Onderzoek MFP-3D Atomic Force Microscope).
  6. Begin met het afbeelden van 2 x 2 micrometer scans met 512 beeldlijnen. Tel het aantal nucleosomen het niveau van sa vergewissenturation (Figuur 5B).
  7. Idealiter moet je delen van de opname op de dia met goed gescheiden nucleosome arrays.
  8. Voor hogere resolutie beelden, kan een 500 x 500 nm scan worden verkregen (figuur 5C).
  9. Afbeeldingen kunnen worden afgevlakt en het gebruik van de MFP-3D-software die door Asylum geanalyseerd.
  10. Elk beeld kan worden onderverdeeld in vier kwadranten en ingezoomd digitaal om een duidelijker beeld van goed gescheiden arrays en meerdere vrije hand lijnen kunnen worden getrokken door de arrays en hoogte profielen worden verkregen voor de nucleosomen (Figuur 5C, rechter paneel hoogte trace verkrijgen en 5D).
  11. Meerdere van dergelijke beelden worden geanalyseerd voor elk type array omvat verscheidene honderden nucleosomen. Hoogte profielen zijn opgenomen, gecategoriseerd en uitgezet in MS Excel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om het protocol te illustreren we gereconstitueerde nucleosomale arrays uit recombinante Xenopus kernhistonen en DNA bestaande uit 12 tandem 207 bp herhalingen van de 601 positionering reeks (601 207 x 12). We hebben eerst geassembleerd inheemse octameren uit gevriesdroogde kernhistonen en vervolgens gezuiverd de octameren door FPLC met een S200-kolom (Figuur 1A). Grotere complexen eerder elueren uit de kolom S200. Histonen algemeen elueren in deze volgorde: niet-specifieke histon aggregaten, histon octameer, H3/H4 tetramer en H2A/H2B dimeer (Figuur 1A). De pieken van de kolom S200 werden geanalyseerd door SDS-PAGE. De gels gezuiverd octameer fracties moeten equimolaire hoeveelheden van de vier histon eiwitten (Figuur 1B) te geven. Merk op dat Xenopus H2A en H2B molecuulgewichten die verschillen slechts 200 Da en derhalve worden ze als een enkele band op SDS gels. H3/H4 tetramers en H2A/H2B dimeren zal na elueren, maar very dicht bij de histon octameer piek. Bij het selecteren van die fracties te houden is het verstandig om breuken te zien zijn in de richting van het einde van de octameer piek in het chromatogram weggooien. Deze fracties kunnen een grotere hoeveelheid niet-octamère histon complexen. In dit geval Fracties 64-67 werden samengevoegd en bewaard voor nucleosomale matrix reconstitutie (figuur 1).

Binnen UltraScan er twee verschillende manieren bekijken van de diffusie gecorrigeerde verdeling van sedimentatie coëfficiënten die wordt verkregen uit de verbeterde Van Holde-Weischet analyse. De rode lijn geeft de integrale distributie van sedimentatie coëfficiënten. Voor elk punt op de grafiek, de y-as geeft de fractie van het monster dat een sedimentatie coëfficiënt gelijk aan of kleiner dan de op de x-as aangegeven waarde. Dus een verticale lijn duidt op een homogeen monster, terwijl een heterogeen monster een curve met positieve helling heeft. De groene lijn is de dederivaat van de integrale distributie. Het gebied onder een piek is evenredig met de fractie van het monster dat sedimentatie coëfficiënt heeft. Volledig verzadigde 601 207 x 12 nucleosomale arrays een sedimentatiecoëfficiënt van 29S 29. Voor de in figuur 3 monster de gegevens aan dat ongeveer 70% van de arrays verzadigd en 30% is dan verzadigd.

Atomic force microscopie is gegaan van een opkomende techniek om een populaire complementaire aanpak van chromatine organisatie te bestuderen in vitro. Hier hebben we AFM gebruikt naast analytische ultracentrifugatie voorzover template verzadiging te bewerkstelligen na reconstitutie. In figuur 6 de meeste ~ 27S arrays (Figuur 4A) voor beeldvorming bevat 10-11 nucleosomen (figuur 4B), het uitstekend tussen de AFM en AUC resultaten. De AFM resultaten hier verkregen dit dus validerenbenaderen en maken het een betrouwbare techniek voor het karakteriseren nucleosomale arrays.

Histoneiwit Σ276, ongevouwen eiwitten cm -1 M -1 Moleculair gewicht Da
H2A 4350 13.960
H2B 7250 13.774
H3 4640 15.273
H4 5800 11.236
Octameer 44.080 108486

Tabel 1. Extinctiecoëfficiënten en moleculaire gewichten van Xenopus laevis kernhistonen en gerenatureerd histon octameer.

Figuur 1
Figuur 1. A. Elutieprofiel uit de kolom S200 zoals beschreven in hoofdstuk 2. De kleine piek bij ongeveer 44 ml is te wijten aan grote histon aggregaten. De prominente piek bij 67 ml is de histon octameren. De brede schouder 76-90 ml bevat H3/H4 tetrameren en H2A/H2B dimeren. B. 20% SDS-PAGE van geselecteerde fracties uit de kolom S200. Vroege fracties uit de octameer piek worden verzameld als ze het minst waarschijnlijk worden besmet door de niet-octamère histon complexen. In dit geval fracties 64-67 werden samengevoegd en opgeslagen voor nucleosomale scala reconstitutie. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2
Figuur 2. A. ProteomeLab software screen capture van een enkele scan verzameld op 3000 rpm (met laBels toegevoegd). Merk op dat de steekproef niet sediment bij deze lage snelheid. De scan wordt gebruikt om het bereik van metingen van de AUC cell scan (stap 4.6). B. Scherm vangst van een reeks sedimentatiesnelheid scans verkregen met de UltraScan programma (met labels toegevoegd) 26 ingesteld. Deze serie scans wordt bewerkt om een ​​dataset voor analyse (zie stap 5.1) genereren.

Figuur 3
Figuur 3. Een schermopname van UltraScanII. De rode en groene lijnen zijn twee verschillende methoden voor het bekijken van de verdeling van de sedimentatie coëfficiënten in UltraScan. De rode lijn is de integrale distributie van sedimentatie coëfficiënten, terwijl het groen is het derivaat. Extra informatie over de interpretatie is te vinden in de sectie resultaten.


Figuur 4. AFM. A. sedimentatiesnelheid profiel voor 601 207 x 12 arrays geassembleerd met muis octameer vermelding van de gemiddelde sedimentatie coëfficiënt 27S. B. Dezelfde arrays in A werden afgebeeld door de AFM en het aantal nucleosomen geteld in verschillende beelden werden in MS Excel uitgezet. De plot aan dat een meerderheid van arrays hadden 10-11 nucleosomen bevestigende de AUC. C. Een 500 x 500 nm toont 601 207 x 12 nucleosoom arrays met de linker DNA zichtbaar. Het bovenste rechter paneel is de amplitude spoor en het rechter paneel midden is de fase trace voor de in C array. De onderste rechter paneel is dezelfde hoogte trace links afgebeeld, maar met een vrije hand lijn getrokken door de nucleosomen op de hoogte profiel van de nucleosomen te bepalens. D. Hoogte profielen van de nucleosomen in de bovenstaande afbeelding te tonen dat alle nucleosomen variëren binnen 1,5-2,5 nm hoogte zoals eerder gemeld 40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Model nucleosomale arrays zijn een zeer nuttig instrument voor de in vitro studie van chromatine structuur en functie. Zo zijn ze veel gebruikt om het mechanisme van chromatine condensatie vezels bestuderen oplossing 30-34, en maakte het mogelijk een röntgenstraal structuur van een tetranucleosome 35 verkrijgen. Meer recent hebben ze nuttig zijn in het ontcijferen van de structurele effecten van specifieke kern histon-varianten, mutanten en posttranslationele modificaties 14-16,36 bewezen. Hier beschrijven we een algemene methode voor de assemblage van model nucleosomale arrays van nucleosoom positionering DNA en recombinante kernhistonen.

De reconstructie van nucleosomale arrays uit gezuiverd octameren en 601 207 x 12 DNA is eenvoudig, waarbij meerdere dialyse stappen die achtereenvolgens lager de NaCl-concentratie van 2 M tot 2,5 mm. Het moeilijkste deel van het protocol is het een r-waarde die de gewenste tem levert gebruikenplaat verzadigingsniveau. De juiste r-waarde wordt eerst empirisch bepaald op kleine schaal en vervolgens herhaald op grotere schaal aan de nucleosomale arrays gebruikt voor experimenten genereren. In ons geval waren we een poging om 601 207 x 12 DNA templates meestal verzadigd met 12 nucleosomen per DNA te verkrijgen. De sedimentatie coëfficiënt van een volledig verzadigde 601 207 x 12 nucleosomale array is 29 S, terwijl dezelfde DNA-template met slechts 11 nucleosomen per DNA sedimenten op ~ 27S 29. Zo sedimentatie snelheid in de analytische ultracentrifuge biedt een zeer gevoelige methode voor het bepalen van de nucleosome verzadiging na bereiding. Analyseerden we onze gegevens met behulp van de verbeterde van Holde-Weischet methode, die een diffusie gecorrigeerde sedimentatiecoëfficiënt distributie oplevert. Deze informatie is essentieel, omdat het vertelt hoe een homogeen of heterogeen het monster is na reconstitutie. Met andere woorden, een 601 x 207 12 DNA-matrijs, hetgeeft de fractie van het monster dat 12 nucleosomen per DNA, 11 nucleosomen per DNA, enz. is Figuur 3 toont de resultaten van de versterkte van Holde-Weischet analyse van 601 x 207 12 nucleosomale arrays opgelost in een r 1,1, waarbij ongeveer 30% van de arrays zijn meer dan verzadigd. Het nut van het monster is meestal verbonden met het percentage verzadigde arrays, maar is afhankelijk van de experimenten de arrays worden gebruikt in sommige toepassingen zeer homogeen en / of verzadigde arrays vereisen. Een aantal werkwijzen bestaan ​​voor het verbeteren van de homogeniteit en verzadiging van nucleosomale arrays.

In dit geval zou de oververzadigde arrays worden verwijderd door selectieve precipitatie na toevoeging van MgCl2 37. Homogener arrays kunnen ook worden verkregen door zuiveren van het monster met sucrose gradiënt centrifugatie, preparatieve gelelektroforese en ionenuitwisselingschromatografie 10,13. Een gemodificeerd nucleosomal scala reconstructie methode vraagt ​​om het toevoegen van korte concurrent DNA om de monsters vóór reconstitutie door zout dialyse 38,39. Dit maakt het mogelijk om nucleosomale arrays monteren met een overmaat van histon octameer zonder over het verzadigen van de DNA-template. Nucleosomale arrays gereconstitueerd met competitief DNA waarschijnlijk een zuiveringsstap voor het verwijderen van de concurrent DNA en extra histonen vereisen.

Zelfs na kleinschalige proef reeks vergaderingen, is het mogelijk dat nucleosomale arrays aangemaakt op grote schaal niet goed verzadigd. Om te voorkomen verspillen template DNA en histon octameer in het monster, is het mogelijk om meer of minder verzadigd arrays lossen. Als de arrays meer dan verzadigd, kan extra DNA worden toegevoegd aan het monster. Als de arrays onder verzadigde kunnen extra octameer worden toegevoegd om dit te corrigeren. Echter, het toevoegen octameer arrays al gedialyseerd in laag zout kan leiden octameer dissociatie. Als het toevoegen van extra octamer of DNA-arrays, dialyseren de arrays terug in 2 M NaCl voor het toevoegen van extra octameer of DNA om het verzamelmonster. Herhaal stap dialyse voor vaste monsters van hoog naar laag zout per stap 3.4. De hoeveelheid octameer te voegen om de arrays correctie kan worden geschat uit sedimentatie coëfficiënten onder verzadigde arrays 29. Nadat de monster nucleosomale arrays moeten metingen van verzadigingsniveau nogmaals gesteld.

Terwijl AFM is een krachtige methode voor het karakteriseren nucleosomale arrays is ingewikkeld en arbeidsintensief. Dit maakt het een slechte techniek voor het screenen van kleinschalige reconstructies, maar een uitstekende techniek voor de karakterisatie van grote monsters en voor de studie van chromatine organisatie. Eerder hebben we AFM gebruikt om "macro" deeltjes gegenereerd door een macroH2A deletieconstruct dat "hyper-responsieve" om zelfs lage concentraties MgCl2 was visualiseren. Likewise, Montel et al.. (2009) hebben aangetoond dat H2A Bbd variant zorgt de nucleosoom arrays meer "open" in vergelijking met wildtype arrays. Daarom AFM is een betrouwbare techniek voor kwaliteitscontrole, evenals voor de studie van chromatine vezelstructuur in het algemeen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​GM45916 en GM66834 om JCH en een beurs van de International Rett Syndroom Stichting AK Dit werk werd ondersteund door NIH verlenen GM088409 en Howard Hughes Medical Institute bijdragen aan KL

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich A3648-100ML
6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing Fisher 21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 Column GE 17-1069-01
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator Sartorius VS2031
12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing Fisher 08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine GE 17-0476-01
XL-A/I Analytical Ultracentrifuge Beckman-Coulter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luger, K., Mader, A., Richmond, R., Crystal Sargent, D. structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 7, (1997).
  2. Hansen, J. C. Conformational dynamics of the chromatin fiber in solution: determinants, mechanisms, and functions. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 361-392 (2002).
  3. McBryant, S., Adams, V., Hansen, J. Chromatin architectural proteins. Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).
  4. Hansen, J. C., Ausio, J., Stanik, V. H., van Holde, K. E. Homogeneous reconstituted oligonucleosomes, evidence for salt-dependent folding in the absence of histone H1. Biochemistry. 28 (23), 9129-9136 (1989).
  5. Szerlong, H. J., Prenni, J. E., Nyborg, J. K., Hansen, J. C. Activator-dependent p300 acetylation of chromatin in vitro: enhancement of transcription by disruption of repressive nucleosome-nucleosome interactions. The Journal of Biological Chemistry. 285 (42), 31954-31964 (2010).
  6. Cirillo, L. A., Lin, F. R., Cuesta, I., Friedman, D., Jarnik, M., Zaret, K. S. Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4. Molecular Cell. 9 (2), 279-289 (2002).
  7. Nguyen, C., Gonzales, F. chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation. Nucleic Acids Research. 29 (22), 4598-4606 (2001).
  8. Cuesta, I., Zaret, K. S., Santisteban, P. The forkhead factor FoxE1 binds to the thyroperoxidase promoter during thyroid cell differentiation and modifies compacted chromatin structure. Molecular and Cellular Biology. 27 (20), 7302-7314 (2007).
  9. Simpson, R. T., Stafford, D. W. Structural features of a phased nucleosome core particle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 80 (1), 51-55 (1983).
  10. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  11. Lowary, P., Widlund, H., Cao, H. Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences. Journal of Molecular Biology. 288, 213-229 (1999).
  12. Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C. The Core Histone N-terminal Tail Domains Function Independently and Additively during Salt-dependent Oligomerization of Nucleosomal Arrays *. The Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 33701-33706 (2005).
  13. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 119 (4), 1-16 (1999).
  14. McBryant, S. J., Klonoski, J., et al. Determinants of histone H4 N-terminal domain function during nucleosomal array oligomerization: roles of amino acid sequence, domain length, and charge density. The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16716-16722 (2009).
  15. Ma Shogren-Knaak,, Fry, C. J., Peterson, C. L. A native peptide ligation strategy for deciphering nucleosomal histone modifications. The Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15744-158 (2003).
  16. Lu, X., Simon, M. The effect of H3K79 dimethylation and H4K20 trimethylation on nucleosome and chromatin structure. Nat Struct Mol Biol. 15 (10), 1122-1124 (2008).
  17. Ausio, J. Analytical Ultracentrifugation for the Analysis of Chromatin Structure. Biophysical Chemistry. 86 (2-3), 141-153 (2000).
  18. Hansen, J., Kreider, J., Demeler, B., Fletcher, T. Analytical ultracentrifugation and agarose gel electrophoresis as tools for studying chromatin folding in solution. Methods. 12 (1), 62-72 (1997).
  19. Montel, F., Menoni, H., et al. The dynamics of individual nucleosomes controls the chromatin condensation pathway: direct atomic force microscopy visualization of variant chromatin. Biophysical Journal. 97 (2), 544-5453 (2009).
  20. Muthurajan, U. M., McBryant, S. J., Lu, X., Hansen, J. C., Luger, K. The linker region of macroH2A promotes self-association of nucleosomal arrays. The Journal of Biological Chemistry. 286 (27), 23852-23864 (2011).
  21. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  22. Lohr, D., Bash, R., Wang, H., Yodh, J., Lindsay, S. Using atomic force microscopy to study chromatin structure and nucleosome remodeling. Methods (San Diego, Calif). 41 (3), 333-341 (2007).
  23. Dyer, P. N., Edayathumangalam, R. S., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
  24. Sambrook, J., Russell, D. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  25. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. J. Vis. Exp. (33), e1530 (2009).
  26. Demeler, B. UltraScan: a comprehensive data analysis software package for analytical ultracentrifugation experiments. Modern Analytical Ultracentrifugation: Techniques. , 210-230 (2005).
  27. Holde, K. V., Weischet, W. Boundary analysis of sedimentation velocity experiments with monodisperse and paucidisperse solutes. Biopolymers. 17 (6), 1387-1403 (1978).
  28. Demeler, B., van Holde, K. E. Sedimentation velocity analysis of highly heterogeneous systems. Analytical Biochemistry. 335, 279-288 (2004).
  29. Hansen, J., Lohr, D. Assembly and structural properties of subsaturated chromatin arrays. Journal of Biological Chemistry. 8, 5840-5848 (1993).
  30. Routh, A., Sandin, S., Rhodes, D. Nucleosome repeat length and linker histone stoichiometry determine chromatin fiber structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 105 (26), 8872-8877 (2008).
  31. Zhou, J., Fan, J. Y., Rangasamy, D., Tremethick, D. J. The nucleosome surface regulates chromatin compaction and couples it with transcriptional repression. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 1070-1076 (2007).
  32. Dorigo, B., Schalch, T., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R., Richmond, T. J. Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber. Science (New York, N.Y.). 306 (5701), 1571-1573 (2004).
  33. Correll, S. J., Schubert, M. H., Grigoryev, S. a Short nucleosome repeats impose rotational modulations on chromatin fibre folding. The EMBO Journal. 31 (10), 2416-2426 (2012).
  34. Mcbryant, S. J., Krause, C., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. The Silent Information Regulator 3 Protein , SIR3p , Binds to Chromatin Fibers and Assembles a Hypercondensed Chromatin Architecture in the Presence of Salt. Molecular and Cellular Biology. 28 (11), 3563-3572 (2008).
  35. Schalch, T., Duda, S., Sargent, D. F., Richmond, T. J. X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre. Nature. 436 (7047), 138-1341 (2005).
  36. Fan, J. Y., Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C., Tremethick, D. J. The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different chromatin conformational states. Nature Structural Biology. 9 (3), 172-176 (2002).
  37. Carruthers, L. M., Bednar, J., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. Linker histones stabilize the intrinsic salt-dependent folding of nucleosomal arrays: mechanistic ramifications for higher-order chromatin folding. Biochemistry. 37 (42), 14776-14787 (1998).
  38. Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined "30 nm" Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone. Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).
  39. Dorigo, B., Schalch, T. Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail. J. Mol. Biol. 2836 (03), 85-96 (2003).
  40. Qian, R. L., Liu, Z. X., et al. Visualization of chromatin folding patterns in chicken erythrocytes by atomic force microscopy (AFM. Cell Research. 7 (2), 143-150 (1997).

Tags

Cellular Biology chromosoomstructuren chromatine Nucleosomen Histones Microscopie Atomic Force (AFM) Biochemie chromatine Nucleosome Nucleosomale Array histon Analytische Ultracentrifugatie sedimentatiesnelheid
Assemblage van Nucleosomale Arrays van Recombinant kernhistonen en Nucleosome Positioning DNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rogge, R. A., Kalashnikova, A. A.,… More

Rogge, R. A., Kalashnikova, A. A., Muthurajan, U. M., Porter-Goff, M. E., Luger, K., Hansen, J. C. Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA. J. Vis. Exp. (79), e50354, doi:10.3791/50354 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter