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Biology

Assemblée des nucléosomiques tableaux de recombinants base histones et nucléosomes ADN positionnement

Published: September 10, 2013 doi: 10.3791/50354
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biochemistry and Molecular Biology, Colorado State University

Summary

Une méthode est présentée pour la reconstitution du modèle nucléosomiques tableaux de histones recombinantes et d'ADN répétées en tandem de positionnement des nucléosomes. Nous décrivons également comment les expériences de la vitesse de sédimentation en ultracentrifugation analytique, et la microscopie à force atomique (AFM) sont utilisés pour mesurer l'ampleur de nucléosomique saturation de tableau après reconstitution.

Abstract

Octamères histones fondamentales qui sont répétitive espacés le long d'une molécule d'ADN sont appelés tableaux nucléosomiques. Tableaux nucléosomes sont obtenus dans une des deux façons suivantes: purification à partir de sources in vivo ou in vitro de reconstitution histones fondamentales recombinants et de l'ADN répétées en tandem de positionnement des nucléosomes. Cette dernière méthode a l'avantage de permettre à l'ensemble d'un uniforme plus de composition et tableau nucléosomique positionné précisément. expériences de vitesse de sédimentation en ultracentrifugation analytique des informations d'élasticité d'environ la taille et la forme des macromolécules en analysant la vitesse à laquelle ils migrent à travers la solution sous la force centrifuge. Cette technique, en même temps que la microscopie à force atomique, peut être utilisé pour le contrôle de qualité, en veillant à ce que la majorité des matrices d'ADN sont saturés avec des nucléosomes après reconstitution. Nous décrivons ici les protocoles nécessaires pour reconstituer quelques milligrammes de longueur et de composition dtableaux nucléosomiques efined appropriés pour les études biochimiques et biophysiques de la structure et la fonction de la chromatine.

Introduction

Génomes eucaryotes n'existent pas d'ADN nu, mais sont compactés et organisées par des protéines liées. Ces complexes d'ADN et de protéines sont connues comme la chromatine. L'unité de répétition de base de la chromatine est le nucléosome. Un nucléosome est constitué d'histone octamère et 146 paires de bases d'ADN enroulé autour de l'octamère d'histone environ 1,6 fois 1. L'octamère d'histones est composé de deux exemplaires de chacun des histones H2A le fondamentales, H2B, H3, et H4. Octamères histones fondamentales qui sont répétitive espacés le long d'une molécule d'ADN sont appelés tableaux nucléosomiques. La structure étendue de tableaux nucléosomiques a été désigné comme la fibre de 10 nm ou les «perles sur un fil" structure et est présent in vitro dans des conditions de faible teneur en sel 2. La fibre de 10 nm est capable de se condenser dans les structures d'ordre supérieur par le compactage intra-groupe et / ou inter-réseau oligomérisation 2. Ces structures d'ordre supérieur peuvent être induites en présence de sels,ou qui peut être influencé par la liaison des protéines de la chromatine à l'architecture du réseau nucléosomale 3,4. Niveaux de compaction de la chromatine sont inversement corrélés avec un taux de transcription dans 5,6 vivo. Les dernières recherches soulignent l'importance de l'organisation structurale des génomes dans des procédés tels que la différenciation, le développement du cancer et d'autres 7,8. L'utilisation de tableaux nucléosomiques pour étudier la structure et la fonction de la chromatine s'est généralisée. Nous décrivons ici une méthode pour l'assemblage de tableaux de nucléosomiques histones recombinantes et d'ADN de positionnement des nucléosomes.

Utilisation de l'ADN recombinant avec des répétitions en tandem de séquences de positionnement des nucléosomes permet la reconstitution des tableaux qui contiennent des nucléosomes régulièrement espacés. Deux des séquences de positionnement plus populaires sont la séquence du gène d'ARNr 5S et le "601" 9,10 de séquence. La séquence 601 a été obtenue à partir d'expériences et la mortalité SELEXe positionne fortement nucléosomes que la séquence 5S 11. Par conséquent, la longueur de liaison de l'ADN des 601 matrices est plus homogène. ADN de positionnement des nucléosomes répétée en tandem est obtenu par filtration sur gel 4,12. Histones recombinantes sont purifiées à partir de E. coli dans des conditions de dénaturation 13. L'utilisation d'histones recombinantes permet de contrôler avec soin la composition de l'histone des matrices nucléosomiques. Par exemple, le noyau histones portant des mutations spécifiques 14 ou modifications post-traductionnelles 15,16 peut être substitué pour histones de type sauvage.

expériences de vitesse de sédimentation de surveiller le taux de sédimentation des macromolécules en solution sous une force centrifuge appliquée 17. Cela donne des informations sur la taille et la forme des macromolécules dans un échantillon. expériences de vitesse de sédimentation sont donc un outil approprié pour l'étude des changements d'état de la solution dans la fibre de chromatinela structure due à la condensation de la chromatine 18. Surtout, il est d'abord nécessaire d'utiliser des expériences de vitesse de sédimentation comme une étape de contrôle de la qualité dans nucléosomique tableau reconstitution. Si l'ADN et les nucléosomes sont pas combinées à un rapport molaire approprié, les tableaux peuvent être sous-ou sur-saturé avec histones. Ainsi, les informations obtenues à partir d'expériences de vitesse de sédimentation est utilisé pour veiller à ce que l'ADN est correctement saturé de nucléosomes. Il est important d'utiliser d'autres méthodes pour estimer la saturation de l'ADN avec des nucléosomes, en particulier si l'on travaille avec une matrice d'ADN non caractérisée. Par conséquent, nous décrivons également un procédé pour l'analyse de réseaux nucléosomales utilisant la microscopie à force atomique (AFM). L'AFM est une technique puissante qui permet la visualisation des effets d'un certain nombre de paramètres, tels que le niveau de saturation, l'effet de la présence de variants d'histones ou les effets de MgCl 2 19,20. AFM a également été applied pour étudier la dynamique des nucléosomes utilisant laps de temps imagerie 21. In vitro assemblés nucléosomiques tableaux 12-mer sont particulièrement favorables à des études de l'AFM, car ils appartiennent à la gamme de la bonne taille pour l'imagerie AFM 22. Dans la présente étude, nous avons utilisé l'AFM de tableaux nucléosomiques comme un contrôle de la qualité ainsi que d'un moyen d'affirmer les données de l'ASC ("voir c'est croire"). En plus de la visualisation simple, l'AFM permet de mesurer des profils de hauteur d'échantillons comme une métrique supplémentaire.

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Protocol

Une. Assemblée des recombinants de base histones dans octamères

Justification: La première étape de nucléosomique tableau reconstitution est de préparer indigènes base histones octamères de lyophilisés histones recombinantes. protéines histones sont combinés en des quantités molaires égales et assemblés en octamers des histones par dialyse les échantillons à partir d'un tampon de dénaturation dans du tampon de repliement.

  1. Purifier et lyophiliser histones recombinantes (H2A, H2B, H3, H4) comme décrit 13.
  2. Dissoudre environ 5 mg de chaque noyau histone lyophilisée dans 3 ml de tampon dépliage (6 M de guanidine HCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM de DTT). Permettre à chaque aliquote pour dissoudre pendant au moins une heure. Faire en sorte que la protéine ne se dépose sur les parois du récipient.
  3. Mesurer l'absorbance de chaque histone à 276 nm en utilisant un tampon déroulement comme une référence.
  4. Calculer la molarité de chaque histone en utilisant leurs coefficients d'extinction (Voir le tableau 1 Xenopus coefficients histone d'extinction). Comparer l'absorbance déterminée concentration de l'histone au poids sec lyophilisé, et estimation si la majorité de la protéine est dissoute.
  5. Déterminer qui histone vous avez moins de moles de, comme ce sera le nombre limite de moles pour tous les histones.
  6. Combiner les histones dans des quantités molaires égales et diluer avec de dépliage tampon à une concentration finale de 1 mg / ml.
  7. Placer l'échantillon dans un tube de dialyse 6-8 kDa MWCO. Sceller le tube et le placer dans 2 L de tampon de repliement à froid (2 M de NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, EDTA 1 mM, 5 mM de β-mercaptoéthanol).
  8. Dialyser l'échantillon pendant 18 heures à 4 ° C sous agitation. Assurer le tube de dialyse peut tourner librement et vigoureusement, ou encore les histones peut précipiter.
  9. Changer deux fois dans la période de 18 heures (c'est à dire changer le tampon de repliement sur ​​toutes les 6 heures jusqu'à ce que fait) le tampon de dialyse. Même si précipité est formé ne rejette pasl'échantillon, une partie peut être récupérée octamère bien que le rendement sera diminué.

Remarque: Voir l'étape 2.1 à 2.2 pour préparer la colonne équilibrage pour le lendemain.

2. Purification des histones octamères par chromatographie d'exclusion stérique

Justification: Après avoir conclu à l'article 1, les échantillons contiennent octamères histones ainsi que d'autres complexes d'histone comme les agrégats, tétramères de H3/H4, et des dimères de H2A/H2B. octamères histones seront purifiés loin de ces autres complexes en utilisant la chromatographie d'exclusion stérique (SEC).

  1. Connectez un HiLoad 16/60 Superdex200 16/60 colonne (S200) à un système FPLC. Veiller à ce que les bulles d'air ne pénètrent pas dans le système.
  2. Nettoyer la colonne S200 avec 0,2 um eau filtrée. Utilisez un taux de 0,3 ml / min et définir une limite de pression de 0,5 MPa. Assurez vous d'avoir assez d'eau et permettre à la colonne pour nettoyer toute la nuit.
  3. Équilibrer la colonne et l'échantillon boucle S200 de la FAutomate à l'aide du tampon de repliement. Utiliser 1 L de 0,2 um tampon de repliement filtré. Tampon de repliement s'écouler à travers la colonne à un débit de 1 ml / min et une pression maximum de 0,5 MPa pendant environ 2 heures.
  4. Équilibrer un concentrateur Vivaspin centrifuge (50 kDa MWCO) avec 1 ml de tampon de repliement. Enlever l'échantillon du tube de dialyse et de centrifuger l'échantillon à 4 ° C pour éliminer tous précipités. Pipeter l'échantillon surnageant dans le concentrateur. Concentrer l'échantillon à un volume d'environ 500 ul.
  5. Retirer l'échantillon octamère concentré vers un nouveau conteneur et rincer le concentrateur avec 1 ml de tampon de repliement. Concentrer le rinçage jusqu'à 500 pi, et l'ajouter à l'échantillon octamère. Cela permet de récupérer toute octamère restant dans le concentrateur.
  6. Faire tourner l'échantillon dans un tube à centrifuger de 1,5 ml pendant 5 min à 10 000 rpm à 4 ° C. Recueillir le surnageant et transférer dans un nouveau tube. Cela aide à éliminer tout précipité avant de charger l'échantillon sur le FPLC.
  7. Chargez l'échantillon sur la colonne S200. Chargez un maximum de 1,5 volume total ml ou 15 mg en une seule octamère purification.
  8. Éluer l'échantillon en utilisant un tampon de repliement fraîchement préparé. Utiliser un débit de 1 ml / min et une limite de contre-pression de 0,5 MPa. Utiliser deux volumes de colonne (400 ml) du tampon de repliement et de recueillir des fractions de 2 ml. Surveillance de l'absorbance à 280 nm au cours de l'élution. Les différentes espèces seront éluer dans l'ordre de taille décroissante. agrégats histones sont élues habituellement à environ 45 ml, octamère à environ 65 ml, et dimère à environ 84 ml (Figure 1).
  9. Analyser les fractions d'élution de pics d'intérêt en exécutant des échantillons sur un SDS-PAGE 18-20%. Les fractions contenant octamères purifiées devraient avoir des quantités molaires égales des quatre protéines histones de noyau (figure 1).
  10. Réunir les fractions qui contiennent des octamères purifiées, et on concentre à ≤ 15 mg / ml avec un filtre centrifuge Vivaspin. Si elle n'est pas diluée, octamères peuvent dissocier idimères nto H2A/H2B et tétramères de H3/H4.
  11. Déterminer la concentration en octamère en mesurant l'absorbance à 280 nm et à calculer à l'aide du coefficient d'extinction du tableau 1.
  12. octamères histones peuvent être conservés court terme dans un tampon de repliement à 4 ° C. Si être stocké à long terme, les octamers seront plus stables à -20 ° C et dans une solution de glycérol à 50%. Octamères stockées dans le glycérol doivent être dialysées dans un tampon de repliement frais avant que les mesures d'absorbance et l'utilisation dans les reconstitutions de tableaux nucléosomiques.

3. Reconstitution de nucléosomiques tableaux de l'ADN et purifiées octamères

Justification: Reconstitution de tableaux nucléosomiques exige que octamères histones et l'ADN matrice être combinés à des rapports molaires spécifiques. Mélanges de l'ADN et des histones octamères à 2 M de NaCl sont pas dialysé dans les tampons de diminution de la force ionique. Un changement progressif de sel inférieure assure la formation de nucléosome bon. Obtention nucleosomal matrices avec le niveau de saturation octamère d'histone de l'ADN matrice souhaitée nécessite petites reconstitutions d'essai à grande échelle, suivie d'une reconstitution preparative à grande échelle. Les conditions appropriées définies par les reconstitutions à petite échelle sont utilisés pour guider la reconstitution de préparation.

  1. Purifier l'ADN de positionnement des nucléosomes répétés en tandem comme décrit 4,12. Brièvement, isoler l'ADN de plasmide en utilisant un kit Qiagen Gigaprep ou un produit similaire. Mise en place d'une digestion de restriction enzymatique pour libérer l'ADN de matrice et à digérer l'ADN plasmidique de plus petites tailles (≤ 700 pb). L'ADN de matrice peut être ensuite purifiée à partir des petits restes d'ADN de plasmide en utilisant une Chromatographie d'exclusion de taille (SEC). Une colonne par gravité, avec une hauteur d'environ 115 cm garnie de perles de Sephacryl S-1000 est suffisante pour la purification de l'ADN x 601 207bp de 12mère.

Notes: Pour la purification d'ADN plasmidique à coût diminué mais augmenté effort, on peut utiliser la lyse alcaline avec la purification de l'ADN au phénol / chloroforme dans le but d'isoler l'ADN plasmidique à partir de E. coli 23,24. Stratégies pour séparer l'ADN matrice du plasmide ADN peuvent varier en fonction des changements dans la taille modèle d'ADN. Pour SEC, il est important de mettre en place la digestion de restriction enzyme d'une manière qui maximise la différence de taille entre le modèle et l'ADN plasmidique.

  1. Déterminer quels rapports molaires (r) à utiliser pour les reconstitutions. R est égal au rapport de moles d'octamère de moles de répétition de l'ADN. Pour les premiers essais à petite échelle, les valeurs de r de 0,9, 1 et 1,1 sont appropriés si l'intention est d'obtenir des tableaux nucléosomiques saturés.
  2. Préparer les échantillons de petite échelle en calculant la quantité d'octamère d'ajouter à environ 18 ug d'ADN pour chaque rapport molaire à tester. Mélanger l'ADN et des histones octamères. La concentration finale en NaCl dans l'échantillon doit être ≥ 2 M, et la concentration finale en DNA devrait être d'environ 0,3 pg / pl. Les conditions de tampon de l'échantillon final devrait également inclure 10 mM Tris pH 7,8, et 1 mM d'EDTA.
  3. Les échantillons sont maintenant prêts pour la dialyse. Charger les échantillons dans des tubes de dialyse 12k 14k-CMM. Dialyser les échantillons contre 2 litres de tampon de diminution de la force ionique de la manière suivante.

Composants dans tous les tampons: 10 mM Tris pH 7,8, 1 mM EDTA. Tampon 1 (ajouter 1 M de NaCl, 1 mM DTT) pour 5-6 heures. Tampon 2 (ajouter 0,75 M de NaCl, 1 mM DTT) pendant la nuit. Tampon 3 (ajouter mM NaCl 2,5, 1 mM DTT) pour 5-6 heures. Tampon 4 (ajouter mM NaCl 2,5 mM, PMSF 0,1) pendant une nuit.

  1. Retirer les échantillons du tube de dialyse et de procéder à des sections 4-6. Si les échantillons de petite taille donnent les résultats souhaités, répétez les étapes dans les sections 3-6 sur la grande échelle.

Remarque: Afin de préserver les ressources, les échantillons de petite échelle doivent avoir le volume minimum nécessaire pour suffire à des tests de dépistage en aval. Afin d'avoir un enough échantillon pour les expériences de la vitesse de sédimentation et AFM énumérés ici, des échantillons de 50 pi à 0,3 mg d'ADN / ml sont appropriées. La taille de grande échelle, de préparation des échantillons dépendent de l'utilisation prévue. Un échantillon à grande échelle doit être préparé de la même manière que les échantillons de petite échelle.

4. Analyse sédimentation de vitesse de reconstitués nucléosomiques tableaux

Justification: expériences de la vitesse de sédimentation dans les informations Beckman Xl-A / I rendement d'ultracentrifugation analytique sur la taille et la forme des molécules en solution. expériences de vitesse de sédimentation réalisés dans des conditions de faible teneur en sel sont utilisés pour déterminer la mesure dans laquelle les matrices reconstituées sont saturés avec des nucléosomes.

  1. Diluer l'échantillon à une absorbance d'environ 0,5 à 260 nm à l'aide du tampon TEN (Tris 10 mM pH 7,8, EDTA 1 mM, NaCl 2,5 mM). Charger 400 pi d'échantillon dans une cellule avec une pièce maîtresse de deux secteurs, avec l'échantillon d'un côté et la réféce (tampon TEN) sur les 25 autres. Gardez le ménisque de référence plus élevés que l'échantillon ménisque (c'est à dire ajouter la solution de référence 420 pi).
  2. Charger les cellules dans le rotor, et d'aligner correctement les cellules en utilisant les marques de hachage sur la partie inférieure des cellules et le rotor 25. Dépoussiérer doucement les verres des cellules à l'aide d'air comprimé.
  3. Mettez la centrifugeuse XL-A/XL-I, insérer le rotor, et fixer et sécuriser l'optique comme décrit dans le manuel. Ouvrez le logiciel du protéome Lab et sélectionnez le fichier: nouveau.
  4. Mettre en place un seul passage de balayage à 3000 rpm et une température de 25 ° C. Sous Options, sélectionnez arrêt après la dernière analyse, et d'exécuter l'étalonnage radiale (calibrage radiale n'est pas nécessaire si le rotor a été le dernier rotor utilisé de l'ASC).
  5. Pour chaque cellule, nommer les échantillons, sélectionnez une longueur d'onde (260 nm), sélectionnez l'absorbance, et choisissez un emplacement d'enregistrer le fichier sur votre ordinateur. Commencer la course de balayage unique.
  6. Utilisez le seul balayage pour déterminer la ra appropriécomposer longueur de balayage (figure 2A). La diminution de la longueur de la cellule qui sera numérisé diminue le temps d'exécution. Cependant, n'oubliez pas d'inclure l'échantillon ménisque et étendre la fin très proche, ou au fond de la cellule.

Remarque: les analyses simples permettent la zone de mesure de raccourcir par des mesures de départ juste avant que l'échantillon ménisque (figure 2A). La plupart des analyses générées pendant l'exécution AUC devraient avoir des limites des fractions passées le ménisque ainsi que les plateaux stable (figure 2B). Lentilles sales sur les cellules de l'ASC peuvent générer des scans avec de grands pics, ceux-ci peuvent affecter l'analyse des données. Le logiciel UltraScan comprend un manuel qui est une excellente source d'information en ce qui concerne l'analyse des données d'ultracentrifugation analytique 26.

  1. Utilisation du panneau de contrôle de XL-A/XL-I, entrez une vitesse de 0 et appuyez sur start. Cela demandera à la chambre de centrifugation pour tirer un vide et toutesoe la température de la chambre de s'équilibrer. Attendez une heure pour permettre l'équilibrage de température avant de commencer une course.
  2. Utilisez le logiciel pour régler la course pour la vitesse souhaitée et le nombre de scans. Des vitesses plus élevées augmentent la résolution, mais il faut recueillir au moins 20 balayages (de préférence plus) avant que l'échantillon a sédimenté au fond de la cellule. Il est commode de superposer les dernières analyses (accomplis dans le menu des options) afin de suivre la progression de la campagne et vérifier les problèmes potentiels tels que les cellules qui fuient. Surveiller le premier couple de scans pour assurer le bon fonctionnement.

5. Modification et analyse des données de vitesse de sédimentation

Justification: les données de vitesse de sédimentation brutes doivent être analysés par un programme qui produit une distribution de coefficient de sédimentation diffusion corrigée. Cette information en retour indique la fraction d'un échantillon de lait reconstitué qui contient un niveau de saturation donné, par exemple

  1. Utilisez AUC logiciel d'analyse de données telles que UltraScan de modifier les données 26. L'édition des données de balayage doit être effectué pour chaque cellule et crée un ensemble de données pour une analyse ultérieure. Le montage correct de balayages consiste à définir le ménisque de l'échantillon, ce qui réduit les données à une région d'intérêt, et la définition de la ligne de base ainsi que des régions de plateau (Figure 2). Analyses indésirables peuvent également être retirés de l'ensemble à ce stade données. Cependant, comme il est possible de supprimer des analyses indésirables lors de l'analyse, il est recommandé que toutes les analyses soient maintenus à ce stade.
  2. Nous recommandons fortement que le van méthode Holde-Weischet renforcée être utilisé pour analyser les données 27. Cette méthode d'analyse pour corriger les effets de la diffusion au cours de la course et donne la répartition intégrale des coefficients de sédimentation. En particulier, La camionnette améliorée méthode Holde-Weischet (telle que transposée dans UltraScan) permettra l'inclusion des scans qui manquent plateaux stables, ou qui contiennent des fractions limites qui ne sont pas compensés ménisque dans l'analyse 28.
  3. Déterminer la distribution des coefficients de sédimentation pour les tableaux assemblés. Les résultats représentatifs pour 601-12 (207bp, 12-mer) tableaux nucléosomiques sont présentés dans la figure 3.
  4. Si l'un des échantillons de petite échelle contient des tableaux avec la gamme désirée de coefficients de sédimentation, puis répétez le processus à une échelle accrue partir de la section 3. Si aucun des échantillons de petite échelle a une bonne répartition des coefficients de sédimentation, puis refaire les tests à petite échelle avec une nouvelle gamme de r à partir de l'article 3.

6. Visualisation nucléosomiques tableaux à l'aide microscopie à force atomique (AFM)

Justification: AFM permet de visualiser le niveau de saturation de nucleosomal tableaux. Cette technique est complémentaire vitesse de sédimentation par l'ASC et la digestion par enzyme de restriction comme un essai de contrôle de qualité.

  1. En utilisant des méthodes décrites ci-dessus, obtenir un tableau de nucléosome bien saturé (figure 5A).
  2. Préparer APTES traités lames de mica en plaçant ~ 30 ul de dilution 1:1000 du commerce (Sigma-Aldrich (3-aminopropyl) triéthoxysilane A3648-100 ml) dans de l'eau filtrée à 0,22 um nanopure pendant 30 min.
  3. Après 30 minutes rincer les APTES avec de l'eau filtrée et doucement les sécher dans un flux d'azote.
  4. Placer l'échantillon dilué de façon appropriée de la matrice des nucléosomes (~ 1,5 ng / ul) sur le coulisseau, et incuber couvert à la température ambiante pendant 15 min.
  5. Rincer déguster le match avec un tampon d'échantillon filtré, sec comme avant, et le lieu diapositive sur la scène de l'AFM (dans ce cas, une recherche MFP-3D microscope à force atomique d'asile).
  6. Commencez par imagerie 2 x 2 pm scans avec 512 lignes de balayage. Comptez le nombre de nucléosomes pour déterminer le niveau de saacculturation (figure 5B).
  7. Idéalement, vous devriez zones de l'image de la diapositive avec des tableaux de nucléosomes bien séparés.
  8. Pour des images haute résolution, une analyse de 500 x 500 nm peut être obtenue (figure 5C).
  9. Les images peuvent être aplatis et analysées en utilisant le logiciel de MFP-3D fourni par l'asile.
  10. Chaque image peut être divisé en quatre quadrants et agrandie numériquement pour obtenir une vision plus claire de réseaux bien distincts et plusieurs lignes de la main libre peut être tracée à travers les tableaux et les profils de hauteur sont obtenus pour les nucléosomes (figure 5C, droit traces panneau hauteur et 5D).
  11. Plusieurs de ces images doivent être analysées pour chaque type de tableau couvrant plusieurs centaines de nucléosomes. Les profils en long sont enregistrés, classés et tracées dans MS Excel.

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Representative Results

Pour illustrer le protocole nous avons reconstitué à partir de matrices histones nucléosomiques recombinants de base de Xenopus et de l'ADN comprenant des 12 séquences répétées en tandem de 207 bp de la séquence de positionnement 601 (601 207 x 12). Nous avons d'abord assemblé octamers natives de histones fondamentales lyophilisées et ensuite purifié par des octamères FPLC en utilisant une colonne S200 (Figure 1A). Grands complexes élues tôt de la colonne S200. Les histones sont élues généralement dans cet ordre: agrégats d'histones non-spécifiques, histone octamère, H3/H4 tétramère, et H2A/H2B dimère (figure 1A). Les pics de la colonne S200 ont été analysés par SDS-PAGE. Les gels de fractions purifiées octamère devraient indiquer des quantités équimolaires des quatre protéines d'histone (Figure 1B). Notez que Xenopus H2A et H2B ont des poids moléculaires qui diffèrent que d'environ 200 Da et par conséquent, ils apparaissent sous la forme d'une bande unique sur des gels de SDS. tétramères et des dimères de H3/H4 H2A/H2B éluent après, mais very près de la pointe de l'histone octamère. Lors de la sélection qui fractions de garder il est prudent de jeter fractions apparaissant vers la fin du pic de octamère dans le chromatogramme. Ces fractions peuvent avoir une plus grande quantité de complexes non-histones octamères. Dans ce cas, les fractions 64-67 ont été rassemblées et enregistrées pour nucléosomique tableau reconstitution (figure 1).

Dans UltraScan il ya deux façons de visualiser la répartition de diffusion corrigée des coefficients de sédimentation qui est obtenu à partir de la camionnette améliorée analyse Holde-Weischet. La ligne rouge représente la distribution intégrale de coefficients de sédimentation. Pour n'importe quel point sur le graphique donné, l'axe des y indique la fraction de l'échantillon qui a un coefficient de sédimentation inférieure à la valeur indiquée sur l'axe des x est égale ou. Ainsi, une ligne verticale est indicatif d'un échantillon homogène, tandis qu'un échantillon hétérogène aura une courbe à pente positive. La ligne verte est la derivative de la distribution intégrale. L'aire sous un pic est proportionnelle à la fraction de l'échantillon qui a ce coefficient de sédimentation. Totalement saturés 601 207 x 12 tableaux nucléosomiques ont un coefficient de sédimentation de 29S 29. Pour l'exemple représenté sur la figure 3, les données indiquent qu'environ 70% des réseaux sont saturés et 30% ont plus saturée.

Microscopie à force atomique est passé de une technique émergente à une approche populaire complémentaire pour étudier l'organisation de la chromatine in vitro. Ici, nous avons utilisé l'AFM aux côtés de l'ultracentrifugation analytique pour déterminer l'étendue de la saturation du modèle après reconstitution. Dans la figure 6, la majorité de la ~ 27S tableaux (figure 4A) utilisés pour l'imagerie contenait 10-11 nucléosomes (figure 4B), ce qui démontre un excellent accord entre l'AFM et les résultats de l'ASC. Les résultats de l'AFM obtenus ici valident donc ceapprocher et faire une technique fiable pour caractériser tableaux nucléosomiques.

Histone protéines Σ276, protéines dépliées cm -1 M -1 Da Poids moléculaire
H2A 4350 13960
H2B 7250 13774
H3 4640 15273
H4 5800 11236
Octamère 44080 108486

Tableau 1. Les coefficients d'extinction et les poids moléculaires de Xenopus laevis histones et renaturé octamère d'histones.

Figure 1
Figure 1. A. profil d'élution de la colonne S200 comme décrit dans la section 2. Le petit pic à environ 44 ml est due à de grands agrégats des histones. Le pic important à 67 ml est octamères les histones. Le large épaulement 76-90 ml contient les tétramères de H3/H4 et H2A/H2B dimères. B. 20% SDS-PAGE des fractions sélectionnées de la colonne S200. Les premières fractions du pic de octamère doivent être collectées comme ils sont moins susceptibles d'être contaminés par les complexes d'histone non octamériques. Dans ce cas, les fractions 64-67 ont été rassemblées et enregistrées pour nucléosomique tableau reconstitution. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2
Figure 2. A. ProteomeLab capture d'écran du logiciel d'un seul balayage recueillies à 3000 rpm (avec labels ajoutée). Notez que l'échantillon ne sédimente pas à cette faible vitesse. Le seul balayage est utilisé pour définir la gamme de mesures pour l'analyse cellulaire AUC (étape 4.6). Capture d'écran B. d'une série d'analyses de vitesse de sédimentation obtenu en utilisant le programme UltraScan (avec étiquettes ajoutées) 26. Cette série de balayages est modifié pour générer un ensemble de données pour l'analyse (voir étape 5.1).

Figure 3
Figure 3. Une capture d'écran de UltraScanII. Les lignes rouges et vertes sont deux méthodes différentes pour visualiser la répartition des coefficients de sédimentation dans UltraScan. La ligne rouge est la distribution intégrale de coefficients de sédimentation, tandis que le vert est la dérivée. Informations supplémentaires sur l'interprétation peut être trouvé dans la section des résultats.


Figure 4. AFM. A. sédimentation profil de vitesse pour 601 207 x 12 tableaux assemblés avec octamère de la souris indiquant le coefficient de sédimentation moyenne est de 27S. B. Les mêmes tableaux dans Un été imagée par l'AFM et le nombre de nucléosomes comptés dans plusieurs images ont été tracés dans MS Excel. L'intrigue a indiqué que la majorité des tableaux avait 10-11 nucléosomes concordantes les valeurs de l'ASC. C. 500 x 500 scan nm de 601 207 x 12 tableaux de nucléosomes avec l'ADN de liaison clairement visible. Le panneau en haut à droite est la trace d'amplitude et le panneau au milieu à droite est la trace de phase pour l'ensemble montré sur C. Le panneau en bas à droite est la même trace de hauteur indiquée sur la gauche mais avec une ligne à main libre établi par les nucléosomes pour déterminer le profil de la hauteur du nucléosomes. D. Les profils en long des nucléosomes dans l'image ci-dessus démontrent que tous les nucléosomes vont dans 1,5-2,5 nm de hauteur comme indiqué précédemment 40.

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Discussion

Modèle tableaux de nucléosomiques sont un outil très utile pour l'étude in vitro de la structure et la fonction de la chromatine. Par exemple, ils ont été largement utilisés pour étudier le mécanisme de la condensation de la chromatine de la fibre dans une solution de 30 à 34, et a permis d'obtenir une structure aux rayons X d'un Tetranucleosome 35. Plus récemment, ils se sont avérés utiles à déchiffrer les effets structurels de variantes noyau d'histone spécifique, des mutants et des modifications post-traductionnelles 14-16,36. Nous décrivons ici une méthode générale pour l'ensemble des tableaux nucléosomiques modèle de l'ADN de positionnement des nucléosomes et les histones fondamentales recombinantes.

La reconstitution des matrices de nucléosomes octamères purifiées et 601 207 x 12 ADN est simple, impliquant plusieurs étapes de dialyse qui abaissent de manière séquentielle à partir de la concentration de NaCl 2 M et 2,5 mM. La partie la plus difficile du protocole est d'utiliser une valeur r qui donne la température souhaitéele niveau de saturation de la plaque. La valeur r approprié est d'abord déterminé de façon empirique sur une petite échelle et ensuite répété sur une plus grande échelle pour générer les matrices nucléosomales utilisés pour les expériences. Dans notre cas, nous avons essayé d'obtenir 601 207 x 12 matrices d'ADN essentiellement saturés avec 12 nucléosomes par ADN. Le coefficient de sédimentation d'un entièrement saturée 601 207 x 12 nucléosomale matrice S est de 29, tandis que la même matrice d'ADN avec seulement 11 nucléosomes par les sédiments d'ADN à 29 ~ 27S. Ainsi, la vitesse de sédimentation en ultracentrifugation analytique du fournit un procédé très sensible pour la détermination du niveau de saturation du nucléosome après reconstitution. Nous avons analysé nos données en utilisant la méthode améliorée van Holde-Weischet, ce qui donne une distribution de coefficient de sédimentation diffusion corrigée. Cette information est essentielle car elle raconte comment un homogène ou hétérogène de l'échantillon est après reconstitution. En d'autres termes, pour un calibre de 207 601 x 12 d'ADN, ilindique la fraction de l'échantillon qui a 12 nucléosomes par l'ADN, 11 nucléosomes par ADN, etc La figure 3 montre les résultats de l'analyse de van renforcée Holde-Weischet de 601 207 x 12 matrices nucléosomes reconstitués à une de r 1.1, dans lesquelles plus ou moins 30% des réseaux sont plus saturés. L'utilité de l'échantillon est généralement lié au pourcentage de groupements saturés, mais dépend des expériences, les matrices seront utilisés po Certaines applications peuvent nécessiter des matrices très homogènes et / ou saturés. Un certain nombre de méthodes existent pour l'amélioration de l'homogénéité et de la saturation des réseaux nucléosomiques.

Dans ce cas, les tableaux sursaturées peuvent être éliminés par précipitation sélective par l'addition de MgCl 2 37. Matrices plus homogènes peuvent également être obtenus par purification de l'échantillon en utilisant une centrifugation à gradient de saccharose, l'électrophorèse preparative sur gel, échange d'ions et chromatographie 10,13. Un nu modifiécleosomal méthode éventail de reconstitution appelle pour ajouter ADN compétiteur court pour les échantillons avant reconstitution par dialyse 38,39 sel. Ceci permet d'assembler des tables nucléosomales avec un excès d'histone octamère sans plus de la saturation de la matrice d'ADN. Tableaux nucléosomes reconstitués en utilisant l'ADN compétiteur nécessitera probablement une étape de purification pour l'élimination de l'ADN compétiteur et les histones appoint.

Même après des ensembles de tableaux de pilote à petite échelle, il est possible que les tableaux nucléosomiques reconstitués à grande échelle ne seront pas correctement saturées. Afin d'éviter le gaspillage de l'ADN matrice et l'octamère d'histone dans l'échantillon, il est possible de fixer sur ou sous ensembles saturés. Si les matrices sont plus saturée, de l'ADN supplémentaire peut être ajouté à l'échantillon. Si les tableaux sont en saturé, octamère supplémentaire peut être ajouté à la corriger. Toutefois, l'ajout octamère de tableaux déjà dialysés en faible teneur en sel peut entraîner octamère dissociation. Si vous ajoutez o supplémentairectamer ou de l'ADN à des tableaux, dialyser les tableaux de nouveau dans 2 M de NaCl avant d'ajouter octamère ou ADN supplémentaire à l'échantillon en vrac. Répétez l'étape dialyse pour les échantillons fixes de haut en bas sel selon l'étape 3.4. Le montant de l'octamère d'ajouter afin de corriger les tableaux peut être estimée à partir des coefficients de sédimentation pour moins de 29 tableaux saturés. Après ajustement de l'échantillon de tableaux nucléosomiques, les mesures de niveau de saturation doivent être faites une fois de plus.

Alors que l'AFM est une méthode puissante pour caractériser tableaux nucléosomiques, c'est compliqué et un processus de travail intensif. Cela en fait une technique de criblage de petites mauvaise reconstitution de l'échelle, mais une excellente technique pour la caractérisation des échantillons à grande échelle et pour l'étude de l'organisation de la chromatine. Auparavant, nous avons utilisé l'AFM pour visualiser particules «macro» générés par une suppression construction macroH2A qui était à même de faibles concentrations de MgCl2 "hyper-sensible". Likewisoi, Montel et al. (2009) ont montré que H2A Bbd variante provoque les tableaux de nucléosomes à être plus «ouvert» par rapport à des réseaux de type sauvage. Par conséquent, l'AFM est une technique fiable pour le contrôle de la qualité, ainsi que pour l'étude de la structure des fibres de la chromatine en général.

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Disclosures

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêt.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le NIH subventions GM45916 et GM66834 à JCH et une bourse de la Fondation internationale pour le syndrome de Rett AK Ce travail a également été soutenu par des subventions du NIH GM088409 et Howard Hughes Medical Institute contributions à KL

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich A3648-100ML
6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing Fisher 21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 Column GE 17-1069-01
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator Sartorius VS2031
12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing Fisher 08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine GE 17-0476-01
XL-A/I Analytical Ultracentrifuge Beckman-Coulter

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