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Biology

Assembleia da nucleosomal Arrays de recombinantes Núcleo Histones e Nucleosome Posicionamento DNA

Published: September 10, 2013 doi: 10.3791/50354
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biochemistry and Molecular Biology, Colorado State University

Summary

Um método é apresentado para a reconstituição do modelo matrizes nucleossomais de histonas centrais recombinantes e de DNA em tandem repetido posicionamento nucleosome. Nós também descrevem como experimentos de velocidade de sedimentação na ultracentrífuga analítica, e microscopia de força atômica (AFM) são usados ​​para monitorar o grau de saturação disposição nucleosomal após a reconstituição.

Abstract

Octâmeros histonas centrais que são espaçadas repetitivamente ao longo de uma molécula de DNA são chamados de matrizes nucleossomais. Matrizes nucleossomais são obtidos de uma de duas maneiras: a purificação de fontes in vivo, ou a reconstituição in vitro a partir de histonas de núcleo e de ADN recombinante em tandem repetido posicionamento nucleossoma. O último método tem a vantagem de permitir a montagem de uma mais uniforme em termos de composição e matriz nucleossomal precisamente posicionado. Experiências de velocidade de sedimentação em a informação analítica rendimento ultracentrífuga sobre o tamanho ea forma das macromoléculas através da análise da velocidade à qual elas migram através de uma solução sob a força centrífuga. Esta técnica, juntamente com a microscopia de força atómica, podem ser usadas para controlo de qualidade, garantir que a maior parte dos moldes de ADN são saturados com nucleossomas após reconstituição. Aqui nós descrevemos os protocolos necessários para reconstituir quantidades de miligramas de comprimento e de composição dmatrizes nucleossomais efined adequados para estudos bioquímicos e biofísicos da estrutura e função da cromatina.

Introduction

Genomas eucarióticos não existir como DNA nu, mas sim são compactadas e organizada por proteínas ligadas. Estes complexos de ADN e de proteínas são conhecidos como cromatina. A unidade de repetição básica de cromatina é o nucleossoma. Um nucleossoma é constituído por octâmero histona e 146 pares de bases de ADN envolvida em torno da histona octâmero cerca de 1,6 vezes uma. O octâmero histona é composto por duas cópias de cada um dos H2A histonas centrais, H2B, H3, e H4. Octâmeros histonas centrais que são espaçadas repetitivamente ao longo de uma molécula de DNA são chamados de matrizes nucleossomais. A estrutura estendida de matrizes nucleossomais tem sido referido como a fibra de 10 nm ou as "pérolas num fio" estrutura e está presente in vitro sob condições de baixo teor de sal 2. A fibra de 10 nm é capaz de condensar em estruturas de ordem superior através de compactação intra-array e / ou inter-array oligomerization 2. Estas estruturas de ordem superior pode ser induzida na presença de sais,ou pode ser influenciada por meio da ligação de proteínas de arquitectura da cromatina para a matriz nucleossomal 3,4. Os níveis de compactação da cromatina são inversamente correlacionada com a taxa de transcrição in vivo 5,6. Uma pesquisa recente destaca a importância da organização estrutural de genomas em processos como a diferenciação, o desenvolvimento de câncer, e outros 7,8. O uso de matrizes nucleossomais para estudar a estrutura e função da cromatina tornou-se generalizada. Aqui nós descrevemos um método para a montagem de matrizes nucleossomais de histonas centrais recombinantes e DNA posicionamento nucleosome.

Usando DNA recombinante com repetições em série de sequências de posicionamento nucleossomas permite a reconstituição de matrizes que contêm nucleossomas regularmente espaçados. Duas das seqüências de posicionamento mais populares são a seqüência do gene 5S rRNA eo "601" seqüência 9,10. A sequência de 601 foi derivado de experiências de SELEX e more posiciona fortemente nucleossomos do que a seqüência 5S 11. Por conseguinte, o comprimento do DNA adaptador das matrizes 601 é mais homogénea. DNA posicionamento nucleosome tandem repetido é obtido por filtração em gel 4,12. Histonas recombinantes são purificados a partir de E. Coli sob condições de desnaturação 13. O uso de histonas recombinantes permite controlar cuidadosamente a composição das histonas nucleossomais matrizes. Por exemplo, o núcleo histonas com mutações específicas 14 ou modificações pós-traducionais 15,16 pode ser substituído por histonas centrais de tipo selvagem.

Experimentos de velocidade de sedimentação monitorar a taxa de sedimentação de macromoléculas em solução sob uma força centrífuga aplicada 17. Este fornece informação sobre o tamanho e forma de macromoléculas numa amostra. Experimentos de velocidade de sedimentação são, portanto, uma ferramenta adequada para o estudo de soluções mudanças de estado em fibras de cromatinaestrutura devido à condensação da cromatina 18. Importante, é primeiro necessário utilizar experiências de velocidade de sedimentação, como um passo de controlo de qualidade em nucleossomal reconstituição matriz. Se o DNA e nucleossomos não são combinados na proporção molar apropriado, os conjuntos podem ser sub-ou sobre-saturado com histonas do núcleo. Assim, a informação obtida a partir de experiências de velocidade de sedimentação é usado para garantir que o ADN está adequadamente saturada com nucleossomas. É importante a utilização de métodos alternativos para estimar a saturação de ADN com os nucleossomas, especialmente se a trabalhar com um molde de ADN anteriormente não caracterizada. Portanto, nós também descrevem um método para análise de matrizes nucleossomais usando microscopia de força atômica (AFM). AFM é uma técnica poderosa que permite a visualização dos efeitos de uma série de parâmetros, tais como o nível de saturação, o efeito da presença de variantes de histona ou os efeitos de MgCl2 19,20. AFM também tem sido aplied para estudar a dinâmica nucleossomos usando tempo de imagem lapso 21. In vitro montado nucleossomais matrizes 12-meros são particularmente passíveis de estudos de AFM, porque eles pertencem à faixa de tamanho certo para AFM 22. No presente estudo, utilizamos AFM de matrizes nucleossomais como um controle de qualidade, bem como um meio de afirmar os dados da AUC ("ver para crer"). Além de simples visualização, AFM permite a medição de perfis de altura de amostras como uma métrica adicional.

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Protocol

1. Assembléia dos recombinantes Núcleo Histones em octâmeros

Justificativa: O primeiro passo para nucleosomal reconstituição matriz é preparar octâmeros histonas centrais nativas da liofilizados histonas centrais recombinantes. Proteínas histona são combinados em quantidades equimolares e montadas em octâmeros histonas por diálise das amostras de um tampão de desnaturação em tampão de redobragem.

  1. Purifica-se e liofiliza histonas centrais recombinantes (H2A, H2B, H3, H4), tal como descrito 13.
  2. Dissolve-se cerca de 5 mg de cada grupo de histonas liofilizado em 3 ml de tampão de revelação (6 M de guanidina HCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM de DTT). Permitir que cada alíquota para dissolver durante pelo menos uma hora. Certifique-se de que nenhuma proteína permanece nos lados do recipiente.
  3. Medir a absorvância de cada histona a 276 nm, utilizando tampão de desdobramento como referência.
  4. Calcula-se a molaridade de cada histona usando seus coeficientes de extinção (Ver Tabela 1 Xenopus coeficientes de extinção histona). Comparar a absorção determinada concentração de histona para o peso seco liofilizado, e estimar se a maioria da proteína é dissolvida.
  5. Determine quais histona você tem o menor número de moles de, como este será o número-limite de moles de todos os histonas.
  6. Combina-se as histonas em quantidades molares iguais e diluir com desdobramento tampão até uma concentração final de 1 mg / ml.
  7. Coloque a amostra em 6-8 kDa MWCO tubos de diálise. Veda-se o tubo e colocar em 2 L de tampão de re-enrolamento a frio (2 M NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM de EDTA, 5 mM de β-mercaptoetanol).
  8. Dializar a amostra durante 18 horas a 4 ° C com agitação. Verifique se o tubo de diálise pode girar livremente e vigorosamente, ou então as histonas pode precipitar.
  9. Altere o tampão de diálise duas vezes no período de 18 horas (ou seja, mudar o tampão de redobramento sobre cada 6 horas até feito). Mesmo se precipitado é formado não descartea amostra, alguns octâmero pode ser recuperado, embora o rendimento será diminuída.

Nota: Veja o passo 2,1-2,2 para preparar a coluna de equilíbrio para o dia seguinte.

2. Purificação de histona octâmeros por cromatografia de exclusão de tamanho

Justificativa: Depois de concluir com a secção 1, amostras conterá octâmeros histonas, bem como outros complexos de histona tais como agregados, tetrâmeros H3/H4 e dímeros H2A/H2B. Octâmeros histona vai ser purificado a partir destes outros complexos utilizando cromatografia de exclusão de tamanho (SEC).

  1. Conectar um HiLoad 16/60 Superdex200 16/60 em coluna (S200) a um sistema de FPLC. Certifique-se que as bolhas de ar não entrar no sistema.
  2. Limpe a coluna S200 com 0,2 m de água filtrada. Use uma taxa de fluxo de 0,3 ml / min e definir um limite de pressão de retorno de 0,5 MPa. Verifique se você tem água suficiente e permitir que a coluna para limpar durante a noite.
  3. Equilibrar a coluna e a amostra circular do F S200PLC utilizando tampão de redobramento. Use 1 L de 0,2 um tampão de redobragem filtrada. Fluir tampão de redobragem através da coluna a uma taxa de 1 ml / min e uma pressão máxima de 0,5 Mpa durante cerca de 2 horas.
  4. Equilibrar um concentrador centrífugo Vivaspin (50 kDa MWCO) com 1 ml de tampão de redobragem. Retirar a amostra do tubo de diálise e centrifugar a amostra a 4 ° C, para remover quaisquer precipitados. Pipetar o sobrenadante da amostra no concentrador. Concentra-se a amostra a um volume de aproximadamente 500 ul.
  5. Retirar a amostra octâmero concentrada para um novo recipiente e enxaguar o concentrador com 1 ml de tampão de redobragem. Concentra-se a lavagem até 500 mL, e adicioná-lo à amostra octâmero. Isto ajuda a recuperar qualquer octâmero remanescente no concentrador.
  6. Girar a amostra num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml durante 5 minutos a 10.000 rpm a 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante e transferir para um tubo novo. Isso ajuda a remover qualquer precipitado antes de colocar a amostra no FPLC.
  7. Carregar a amostra na coluna S200. Carregar um máximo de 1,5 ml de volume total, ou 15 mg de octâmero em um único purificação.
  8. Eluir a amostra usando o tampão de redobramento feitos na hora. Use uma taxa de fluxo de 1 ml / min e um limite de pressão de retorno de 0,5 MPa. Usar dois volumes de coluna (400 ml) de tampão de redobragem e recolher fracções de 2 ml. Monitorar a absorvância a 280 nm durante a eluição. As espécies diferentes irá eluir por ordem decrescente de tamanho. Agregados histona normalmente elui a aproximadamente 45 ml, octâmero em cerca de 65 ml, e dímero de cerca de 84 ml (Figura 1).
  9. Analisar as fracções de eluição de pico de interesse, executando as amostras em um 18-20% de SDS-PAGE. As fracções contendo octâmeros purificadas deve ter quantidades molares iguais das quatro proteínas histona nucleares (Figura 1).
  10. Reunir as fracções que contêm octâmeros purificados, e concentrar a ≤ 15 mg / ml com um filtro centrífugo Vivaspin. Se não for diluído, octâmeros pode dissociar-idímeros nto H2A/H2B e tetrâmeros H3/H4.
  11. Determinar a concentração de octâmero medindo a absorvância a 280 nm e calcula utilizando o coeficiente de extinção a partir da Tabela 1.
  12. Octâmeros histonas pode ser mantido curto prazo em tampão de redobramento a 4 ° C. Se a ser armazenadas a longo prazo, os octâmeros será mais estável a -20 ° C e em uma solução de glicerol a 50%. Octâmeros armazenados em glicerol deve ser dialisado para tampão de re-enrolamento fresco, antes de medições de absorvância e utilizar em reconstituições matriz nucleossomais.

3. Reconstituição de nucleosomal matrizes de DNA e purificada octâmeros

Justificativa: Reconstituição de matrizes nucleossomais exige que octâmeros histonas e DNA template ser combinados em proporções molares específicas. Misturas de DNA e histonas octâmeros em 2 M NaCl são dialisados ​​passo em buffers de diminuir a força iônica. Uma mudança gradual para reduzir sal garante formação nucleosome adequada. Obtenção de nmatrizes ucleosomal com o nível desejado de saturação histona octâmero do ADN molde requer reconstituições de teste em pequena escala, seguida por uma reconstituição em larga escala preparativa. As condições adequadas definidas pelos reconstituições de pequena escala são utilizados para orientar a reconstituição preparativa.

  1. Purifica-se em tandem repetido ADN posicionamento nucleossoma como descrito 4,12. Resumidamente, isolar o DNA de plasmídeo usando o kit Qiagen GigaPrep ou um produto semelhante. Defina-se uma enzima de restrição digerir a fim de libertar o DNA molde e digerir o ADN do plasmídeo a tamanhos menores (≤ 700 pb). O ADN molde pode, então, ser purificado a partir dos pequenos fragmentos de ADN de plasmídeo, utilizando cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). A coluna alimentada por gravidade, com uma altura de cerca de 115 cm cheia com Sephacryl S-1000 grânulos é suficiente para a purificação de 601 x de DNA 207bp 12mer.

Notas: Para a purificação de DNA plasmídeo em redução de custos, mas aumentou effort, pode-se utilizar a lise alcalina com fenol / clorofórmio, a purificação do DNA a fim de isolar o ADN de plasmídeo a partir de E. coli 23,24. Estratégias para a separação do molde de DNA a partir de DNA de plasmídeo pode variar com mudanças no tamanho do ADN molde. Por SEC é importante estabelecer a enzima de restrição digerir de uma forma que maximiza a diferença no tamanho entre o molde e o DNA de plasmídeo.

  1. Determinar quais as relações molares (r) a ser usado para reconstituições. R é igual à razão de moles de octâmero de moles de repetição de DNA. Para os testes iniciais de pequena escala, os valores de r de 0,9, 1 e 1,1 são apropriadas se a intenção é obter matrizes nucleossomais saturadas.
  2. Preparar as amostras em pequena escala por meio do cálculo da quantidade de octâmero para adicionar cerca de 18 ug de ADN para cada razão molar a ser testado. Misture o ADN e histonas octâmeros. A concentração final de NaCl, a amostra deve ser ≥ 2 M, e a concentração final de DNA deve ser em torno de 0,3 mg / mL. As condições finais de tampão de amostra devem também incluir 10 mM Tris pH 7,8, e EDTA 1 mM.
  3. As amostras estão agora prontas para diálise. Coloque as amostras em 12k-14k MWCO tubos de diálise. Dializar as amostras contra 2L de tampão de diminuição da força iónica como se segue.

Componentes em todos os tampões: 10 mM Tris pH 7,8, EDTA 1 mM. Tampão 1 (adicionar 1 M de NaCl, 1 mM de DTT) por 5-6 horas. Tampão 2 (adicionar NaCl 0,75 M, DTT a 1 mM) durante a noite. Tampão 3 (adicionar NaCl 2,5 mM, DTT 1 mM) durante 5-6 horas. Tampão 4 (adicionar NaCl 2,5 mM, PMSF 0,1 mM) durante a noite.

  1. Retirar as amostras do tubo de diálise e siga para seções 4-6. Se as amostras de pequena escala produzir os resultados desejados, repita os passos nas seções 3-6 em larga escala.

Nota: A fim de preservar os recursos, as amostras de pequeno porte devem ter o volume mínimo necessário para bastar para testes de rastreio a jusante. Para ter enough amostra para as experiências de velocidade de sedimentação e AFM listados aqui, amostras de 50 ul a 0,3 mg / ml de DNA são apropriados. O tamanho de grande escala, amostras de preparação são dependentes do seu uso pretendido. Uma amostra de grande escala, devem ser preparados da mesma maneira que as amostras de pequena dimensão.

4. Sedimentação Velocity Análise de reconstituídos nucleosomal matrizes

Razão: experiências de velocidade de sedimentação das informações rendimento ultracentrífuga analítica Beckman Xl-A / I do tamanho e forma das moléculas em solução. Experiências de velocidade de sedimentação realizadas sob condições de baixa de sal são usados ​​para determinar o grau em que as matrizes são reconstituídos saturado com nucleossomas.

  1. Dilui-se a amostra a uma absorvância de cerca de 0,5 a 260 nm, utilizando tampão TEN (10 mM Tris pH 7,8, EDTA 1 mM, NaCl 2,5 mM). Carregar 400 ul de amostra em uma célula com uma peça central de duas sector, com a amostra, de um lado e a referênce (tampão TEN) na outra 25. Mantenha as menisco referência mais elevados do que o menisco da amostra (ie adicione 420 mL solução de referência).
  2. Carregar as células em que o rotor, e alinhar as células usando adequadamente os cerquilhas na parte inferior das células e o rotor 25. Cuidadosamente a poeira das lentes das células usando ar comprimido.
  3. Ligue a centrífuga XL-A/XL-I, insira o rotor, e anexar e garantir a ótica conforme descrito no manual. Abra o software Proteome Lab e selecione o arquivo: novo.
  4. Configurar uma única corrida de digitalização a 3.000 rpm e uma temperatura de 25 ° C. Em Opções, selecione Parar após a última verificação e calibração radial run (calibração radial não é necessário se o rotor foi o último rotor utilizado na AUC).
  5. Para cada célula, o nome das amostras, selecione um comprimento de onda (260 nm), selecione absorção, e escolha um local em seu computador salvar o arquivo. Comece a única corrida de varredura.
  6. Use o único exame para determinar a ra apropriadadiscar o comprimento da digitalização (Figura 2A). Diminuição do comprimento da célula que vai ser digitalizada diminui o tempo de execução. No entanto, não se esqueça de incluir o menisco amostra e estender o fim muito próximo, ou na parte inferior da célula.

Nota: scans Solteiro permitir área de medição para ser reduzido por medidas a partir pouco antes do menisco da amostra (Figura 2A). A maioria das verificações gerados durante a execução AUC deve ter fracções de limite últimos menisco, bem como planaltos estável (Figura 2B). As lentes sujas sobre as células da AUC podem gerar scans com grandes picos, que podem afectar a análise dos dados. O software UltraScan inclui um manual, que é um grande recurso para obter informações sobre a análise de dados ultracentrifugação analítica 26.

  1. Usando o painel de controle XL-A/XL-I, digite uma velocidade de 0 e começar a pressionar. Isso fará com que a câmara de centrifugação para puxar um vácuo e todosow a temperatura da câmara para equilibrar. Espere 1 hora para permitir a temperatura de equilíbrio, antes de começar a correr.
  2. Use o software para definir o prazo para a velocidade desejada eo número de exames. Velocidades mais altas aumenta a resolução, mas deve-se coletar pelo menos 20 exames (de preferência mais) antes de a amostra ter sedimentado para o fundo da célula. É conveniente para sobrepor os últimos exames realizados (no menu de opções), a fim de monitorar o progresso da execução e verificar se há problemas potenciais, tais como células vazando. Monitore o primeiro par de exames para garantir o funcionamento adequado.

5. Editar e analisar dados de sedimentação Velocity

Justificativa: dados de velocidade de sedimentação Raw deve ser analisada por um programa que produz uma distribuição coeficiente de sedimentação com correção de difusão. Esta informação, por sua vez indica que a fracção de uma amostra reconstituída que contém um determinado nível de saturação, por exemplo,

  1. Use AUC software de análise de dados, como UltraScan para editar os dados 26. Edição de dados de varredura deve ser feito para cada célula e cria um conjunto de dados para análise posterior. Edição adequada de varreduras envolve a definição de menisco da amostra, reduzindo os dados para uma região de interesse, e a definição de linha de base, bem como as regiões de planalto (Figura 2). Varreduras indesejadas pode também ser removido do conjunto de dados neste ponto. No entanto, uma vez que é possível remover as verificações não desejadas durante a análise, recomenda-se que todas as verificações de ser mantida a este ponto.
  2. Nós recomendamos fortemente que o método van Holde-Weischet reforçada ser usado para analisar os dados 27. Este método de análise corrige os efeitos de difusão ao longo da corrida e produz a distribuição integrante dos coeficientes de sedimentação. Em especial, O método aprimorado van Holde-Weischet (implementada em UltraScan) vai permitir a inclusão de exames que faltam platôs estáveis, ou que contêm frações de fronteira que não limpou o menisco na análise 28.
  3. Determinar a distribuição dos coeficientes de sedimentação para as matrizes montadas. Os resultados representativos para 601-12 (207bp, 12-mer) matrizes nucleossomais são mostrados na Figura 3.
  4. Se uma das amostras em pequena escala contém matrizes com a faixa desejada de coeficientes de sedimentação, em seguida, repita o processo em um aumento da escala começando com a seção 3. Se nenhuma das amostras de pequena escala tem uma distribuição adequada dos coeficientes de sedimentação, em seguida, repetir os testes de pequena escala com uma nova gama r começando na seção 3.

6. Visualizando nucleosomal matrizes com Microscopia de Força Atômica (AFM)

Razão: AFM permite a visualização do nível de saturação de nucleosomal matrizes. Esta técnica complementa velocidade de sedimentação com a AUC e a digestão com enzimas de restrição, como um ensaio de controlo de qualidade.

  1. Usando os métodos descritos acima, obter uma matriz de nucleossoma bem saturado (Figura 5A).
  2. Preparar APTES tratada lâminas de mica, colocando ~ 30 ul de diluição de 1:1.000 comercial (Sigma-Aldrich (3-aminopropil) trietoxi-A3648-100 ml) em 0,22 um filtrado de água nanopura para 30 min.
  3. Após 30 minutos lave as APTES com água filtrada e seque-os delicadamente em um fluxo de nitrogênio.
  4. Coloque adequadamente diluído amostra variedade nucleosome (~ 1,5 ng / mL) no slide, e incubar coberto em temperatura ambiente por 15 min.
  5. Enxágüe provar off com tampão de amostra filtrada, seque como antes, e lugar de slides no palco do AFM (neste caso, um Microscópio de Força Atômica Asylum Research MFP-3D).
  6. Comece pela imagem 2 x 2 m scans com 512 linhas de varredura. Contar o número de nucleossomos para determinar nível de saturação (Figura 5B).
  7. Idealmente, você deve áreas de imagem no slide com matrizes nucleossomos bem separados.
  8. Para imagens de alta resolução, um nm de digitalização de 500 x 500 pode ser obtido (Figura 5C).
  9. As imagens podem ser achatado e analisados ​​usando o software MFP-3D fornecido pelo Asilo.
  10. Cada imagem pode ser dividida em quatro quadrantes e ampliada digitalmente para obter uma visão mais clara de matrizes bem separados e várias linhas de mão livre podem ser tiradas através das matrizes e perfis de altura são obtidos para os nucleossomos (Figura 5C, certo traço painel altura e 5D).
  11. Várias dessas imagens deverá ser analisada para cada tipo de matriz que abrange várias centenas de nucleossomas. Altura perfis são registrados, classificados e plotados em MS Excel.

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Representative Results

Para ilustrar o protocolo que reconstituído matrizes nucleossomais recombinantes de histonas de núcleo de Xenopus e de ADN consistindo em 12 conjunto 207 repete pb da sequência de posicionamento 601 (601 207 x 12). O primeiro montado octâmeros nativas de histonas de núcleo liofilizados e, em seguida, purificado os octâmeros por FPLC usando uma coluna S200 (Figura 1A). Complexos maiores eluir mais cedo a partir da coluna S200. As histonas geralmente eluir nesta ordem: agregados histonas não específicos, octâmero histona, H3/H4 tetrâmero, e H2A/H2B dímero (Figura 1A). Os picos da coluna S200 foram analisadas por SDS-PAGE. Os géis de fracções purificadas octâmero deve indicar quantidades equimolares dos quatro proteínas de histonas (Figura 1B). Note-se que Xenopus H2A e H2B têm pesos moleculares que diferem por apenas cerca de 200 Da e, portanto, eles aparecem como uma ica banda no gel de SDS. Tetrâmeros H3/H4 e dímeros H2A/H2B eluirá depois, mas very perto do pico da histona octâmero. Ao selecionar quais as frações que para mantê-lo é prudente descartar frações aparecendo no final do pico octâmero no cromatograma. Estas fracções podem ter um aumento da quantidade de complexos de histona não octamérico. Neste caso frações 64-67 foram reunidas e guardadas para reconstituição matriz nucleossomal (Figura 1).

Dentro UltraScan há duas maneiras diferentes de ver a distribuição corrigida difusão de coeficientes de sedimentação que é obtida a partir da análise aprimorada van Holde-Weischet. A linha vermelha representa a distribuição integral dos coeficientes de sedimentação. Para qualquer dado ponto no gráfico, o eixo y indica a fracção da amostra que tem um coeficiente de sedimentação igual a ou menor do que o valor indicado no eixo dos x. Assim, uma linha vertical, é indicativa de uma amostra homogénea, enquanto que uma amostra heterogénea terá uma curva com inclinação positiva. A linha verde é o dederivativo de distribuição integral. A área sob o pico é proporcional à fracção da amostra que tem o referido coeficiente de sedimentação. Completamente saturados 601 207 x 12 matrizes nucleossomais tem um coeficiente de sedimentação de 29S 29. Para o exemplo mostrado na Figura 3, os dados indicam que aproximadamente 70% das matrizes são saturados e 30% são mais saturado.

Microscopia de força atômica passou de uma técnica emergente de uma abordagem complementar popular para estudar organização da cromatina in vitro. Aqui nós usamos AFM ao lado de ultracentrifugação analítica para estabelecer a extensão da saturação do modelo após a reconstituição. Na Figura 6, a maioria do 27S matrizes ~ (Figura 4A) utilizado para a imagiologia continha 10-11 nucleossomas (Figura 4B), o que demonstra uma excelente concordância entre a AFM e dos resultados da AUC. Os resultados aqui obtidos AFM assim validar estaaproximar e torná-lo uma técnica confiável para a caracterização de matrizes nucleossomais.

Histone Protein Σ276, proteínas desdobradas cm -1 M -1 Peso Molecular Da
H2A 4350 13.960
H2B 7250 13.774
H3 4640 15.273
H4 5.800 11.236
Octâmero 44080 108486

Tabela 1. Coeficientes de extinção e pesos moleculares de Xenopus laevis histonas centrais e renaturado octâmero histona.

Figura 1
Figura 1. A. perfil de eluição da coluna S200, conforme descrito na seção 2. O pequeno pico em cerca de 44 ml é devido a grandes agregados de histonas. O pico proeminente em 67 ml é o octâmeros histonas. O ombro largo 76-90 ml contém os tetrâmeros H3/H4 e H2A/H2B dímeros. B. 20% SDS-PAGE das frações selecionados da coluna S200. As primeiras fracções do pico octâmero deve ser coletado como eles são menos susceptíveis de estarem contaminados pelos complexos de histona não octamérico. Neste caso frações 64-67 foram recolhidas e guardadas para nucleosomal reconstituição matriz. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2
Figura 2. A. ProteomeLab software de captura de tela de um único exame coletado a 3.000 rpm (com labels nosso). Note-se que a amostra não sedimentos neste baixa velocidade. O único exame é utilizado para definir a gama de medida para a verificação de células AUC (passo 4.6) captura B. Tela de uma série de exames de velocidade de sedimentação obtidos utilizando o programa UltraScan (com legendas adicionadas) 26.. Esta série de exames é editado para gerar um conjunto de dados para a análise (veja o passo 5.1).

Figura 3
Figura 3. Uma captura de tela da UltraScanII. As linhas vermelhas e verdes são dois métodos diferentes para a visualização da distribuição dos coeficientes de sedimentação em UltraScan. A linha vermelha é a distribuição integral dos coeficientes de sedimentação, enquanto que o verde é a derivada. Informações adicionais sobre a interpretação pode ser encontrada na seção de resultados.


Figura 4. AFM. Perfil de velocidade A. Sedimentação para 601 207 x 12 matrizes montadas com rato octâmero indicando o coeficiente de sedimentação média é de 27S. B. As mesmas matrizes em A foram fotografadas pela AFM eo número de nucleossomos contadas em várias imagens foram plotadas em MS Excel. O enredo indicou que a maioria das matrizes tinha 10-11 nucleossomos corroborando os dados da AUC. C. A 500 ​​x 500 nm de digitalização de 601 207 x 12 matrizes nucleossomos com o DNA linker claramente visível. O painel superior direito é o traço amplitude eo painel direito do meio é o traço fase para a matriz mostrada na C. O painel inferior direito é o mesmo traço altura mostrada à esquerda, mas com uma linha de mão livre desenhado através dos nucleossomos para determinar o perfil de altura do nucleosomes. perfis Altura D. dos nucleossomos na imagem acima demonstram que todos os nucleossomos variar dentro de 1,5-2,5 nm altura conforme relatado anteriormente 40.

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Discussion

Matrizes nucleossomais modelo são uma ferramenta muito útil para o estudo in vitro da estrutura e função da cromatina. Por exemplo, eles têm sido amplamente utilizado para estudar o mecanismo da condensação de cromatina na fibra solução 30-34, e tornou possível a obtenção de uma estrutura de raios-x de um tetranucleosome 35. Mais recentemente, eles têm se mostrado útil para decifrar os efeitos estruturais de variantes de histonas núcleo específico, mutantes e modificações pós-translacionais 14-16,36. Aqui nós descrevemos um método geral para a montagem de matrizes nucleossomais modelo de DNA posicionamento nucleosome e histonas centrais recombinantes.

A reconstituição de matrizes nucleossomais de octâmeros purificada e 601 207 x 12 DNA é simples, envolvendo várias etapas de diálise que sequencialmente diminuir a concentração de NaCl de 2 M a 2,5 mM. A parte mais difícil do protocolo é a utilização de um valor de r que produz a temperatura desejadanível de saturação de prato. O valor de r adequado é primeiro determinada empiricamente em pequena escala e, em seguida repetido numa escala maior para gerar as matrizes nucleossomais utilizados nas experiências. No nosso caso, fomos tentar obter 601 207 x 12 modelos de DNA principalmente saturadas com 12 nucleossomos por DNA. O coeficiente de sedimentação de uma totalmente saturado 601 207 x 12 nucleossomal matriz é de 29 S, enquanto que o mesmo molde de ADN, com apenas 11 por nucleossomas sedimentos de ADN em 29 ~ 27S. Assim, a velocidade de sedimentação na ultracentrífuga analítica proporciona um método muito sensível para a determinação do nível de saturação do nucleossoma após reconstituição. Analisou-se os dados usando o método melhorado van Holde-Weischet, que produz uma distribuição do coeficiente de sedimentação corrigiu-difusão. Esta informação é essencial, pois diz uma como homogênea ou heterogênea a amostra é após a reconstituição. Em outras palavras, para um modelo de 601 207 x 12 ADN, eleindica a fracção da amostra que tem 12 por nucleossomas ADN, 11 nucleossomas por ADN, etc A Figura 3 mostra os resultados da análise melhorada van Holde-Weischet de 601 207 x 12 matrizes nucleossomais reconstituídos durante um r de 1.1, em que cerca 30% das matrizes são mais saturado. A utilidade da amostra é geralmente ligada à percentagem de matrizes saturados, mas é dependente das experiências, as matrizes serão usadas dentro Algumas aplicações podem exigir matrizes muito homogéneas e / ou saturados. Um número de métodos existentes para melhorar a homogeneidade e a saturação de matrizes nucleossomais.

Neste caso, as matrizes supersaturados pode ser removido por precipitação selectiva com a adição de MgCl 2 37. Matrizes mais homogéneos podem também ser obtidas através da purificação da amostra usando a centrifugação de gradiente de sacarose, electroforese em gel preparativa e cromatografia de troca iónica 10,13. Um nu modificadométodo de disposição reconstituição cleosomal chama para adicionar DNA competidor curto para as amostras antes da reconstituição através de diálise sal 38,39. Isto permite montar matrizes nucleossomais com um excesso de histona octâmero, sem excesso de saturação do modelo de DNA. Matrizes nucleossomais reconstituído usando DNA competidor irá requerer um passo de purificação para a remoção do ADN e histonas concorrente extra.

Mesmo depois de os conjuntos de matriz piloto em pequena escala, é possível que as matrizes nucleossomais reconstituídos em grande escala, não será adequadamente saturado. A fim de evitar o desperdício de DNA modelo e histona octâmero na amostra, é possível fixar sobre ou sob matrizes saturadas. Se as matrizes são mais saturada, ADN extra pode ser adicionada à amostra. Se as matrizes estão sob saturado, octâmero extra pode ser adicionado para o corrigir. No entanto, a adição de octâmero para matrizes já dialisados ​​em baixo sal pode resultar octâmero dissociação. Se acrescentar o adicionalctamer ou DNA para matrizes, dializar as matrizes de volta em 2 M NaCl antes de adicionar octâmero extra ou DNA para a amostra global. Repita a etapa de diálise para amostras fixas de alta para baixa sal como por passo 3.4. A quantidade de octâmero a adicionar, a fim de corrigir as matrizes podem ser estimadas a partir de coeficientes de sedimentação de matrizes sob saturados 29. Após ajuste da amostra de matrizes nucleossomais, as medições de nível de saturação deve ser feito uma vez.

Enquanto AFM é um método poderoso para a caracterização de matrizes nucleossomais, é complicado e um processo de trabalho intensivo. Isto faz com que uma má técnica para o rastreio de reconstituições de pequena escala, mas uma técnica excelente para a caracterização de amostras em larga escala, e para o estudo da organização da cromatina. Anteriormente usamos AFM para visualizar partículas "macro" geradas por uma construção exclusão macroH2A que foi até mesmo para baixas concentrações de MgCl2 "hiper-sensível". Likewisi, Montel et al. (2009) demonstraram que a variante H2A Bbd faz com que as matrizes de nucleossomas para ser mais "aberto" em comparação com as matrizes de tipo selvagem. Assim, a AFM é uma técnica de confiança para controlo de qualidade, bem como para o estudo da estrutura das fibras de cromatina em geral.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo NIH concede GM45916 e GM66834 para JCH e uma bolsa da Fundação Internacional de Síndrome de Rett para AK Este trabalho também foi financiado pelo NIH conceder GM088409 e do Instituto Médico Howard Hughes contribuições para KL

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich A3648-100ML
6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing Fisher 21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 Column GE 17-1069-01
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator Sartorius VS2031
12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing Fisher 08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine GE 17-0476-01
XL-A/I Analytical Ultracentrifuge Beckman-Coulter

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