Summary
Vi viser her
Abstract
Prækliniske forskning i dyremodeller af perifer arteriel sygdom spiller en afgørende rolle i at teste effektiviteten af terapeutiske midler, der skal stimulere mikrocirkulationen. Valget af levering metode til disse midler er vigtigt, fordi indgivelsesvejen dybt påvirker bioaktiviteten og effekten af disse agenter 1,2. I denne artikel viser vi, hvordan man lokalt indgive et stof i iskæmiske baglemmer ved hjælp af en kateteriseres osmotisk pumpe. Denne pumpe kan levere et fast volumen af vandig opløsning kontinuerligt i et fastsat tidsrum. Vi har også præsentere vores musemodel af ensidig bagben iskæmiinduceret af ligering af den fælles femoralarterie proksimalt til oprindelsen af Profunda femoris og epigastrica arterier i venstre bagben. Endelig beskriver vi in vivo kanyle og ligering af den infrarenale abdominale aorta og perfusion af bagbenet vaskulatur med Microfil, en silicone røntgenfaste casting agent. Microfil kan perfundere og udfylde hele vaskulære seng (arteriel og venøs), og fordi vi har ligeret den store vaskulære kanal til udgang, kan midlet tilbageholdes i karrene til fremtidig ex vivo billeddannelse med brug af lille prøve mikro-CT 3 .
Introduction
Perifere kredsløbsforstyrrelser (PAD) er en aterosklerotisk sygdom, der forårsager utilstrækkelig blodforsyning i benene 4.. Det påvirker 8-12.000.000 amerikanere, og aktuelle medicinske behandlinger kun tilbyde begrænset lindring 5,6. Nye terapeutiske midler, der forbedrer blodcirkulationen i benene vil ikke kun begrænse sygdomsprogression, men også øge livskvaliteten. Forekomsten af PAD er højere hos personer over 50 år, så lokale farmakologiske terapi er en mere ønskelig behandlingsmetode, fordi den reducerede nyre-og leverfunktion ofte ses hos ældre patienter kan mindske drug metabolisme og øge bivirkninger ved systemisk administration.
Således har vi skabt en musemodel af PAD at undersøge, om lokalt administrerede agenter afhjælpe hindlimb iskæmi ved at fremme angiogenese og mikrovaskulære remodeling. Specifikt har vi brugt en kateter osmotisk pumpe til kontinuerligt levere det terapeutiske middel tiliskæmisk lårmuskel af mus. Ved hjælp af vores delivery system, vi var i stand til at opretholde optimale koncentrationer af lægemidlet i det lokale miljø, denne tilgang giver mulighed for passende stof bioaktivitet undgår mulige systemiske bivirkninger, og overvinder den ulempe begrænsede lokale stof adgangen forbundet med systemisk administration. Derudover at vurdere, om lokalt administrerede agenter fremme revaskularisering, brugte vi avancerede støbning og high-definition imaging teknikker, der muliggør kvantificering af ændringer i microvasculature. Kollektivt, at kombinationen af metoder, der anvendes i denne video artikel er nyttigt i prækliniske studier til at hjælpe på forståelsen farmakologisk induceret revaskularisering i PAD patienter 7-9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Priming den osmotiske pumpe
- Brug sterile teknikker (f.eks handsker, laminar flow hætte), når udarbejdelsen af pumperne. Fjern pumpen og strømningsmoderatoren fra emballagen. Vej den tomme pumpe og optage vægten (mg).
- Fyld pumpen langsomt og undgå at skabe luftbobler, ved hjælp af en lille 1cc sprøjte og stump spids 27G påfyldningsrør. Når opløsningen når toppen af pumpen, stop påfyldning.
- Tør overskydende opløsning og vejer fyldt pumpe. For de fleste vandige opløsninger, er vægten i mg den samme som den mængde i pi. Forskellen i tom versus fyldt vægt bør være mere end 90% af den angivne middelværdi påfyldningsvolumen. Hvis ikke, evakuere pumpen med sprøjten og refill. Hvis du oplever tekniske vanskeligheder henvises til afsnittet om fejlfinding af pumpens brugsanvisning på http://www.alzet.com/products/guide_to_use/filling.html
- Brug en pincet til at bryde den hvide flangen fra strømmen moderateller, vær forsigtig med ikke at bøje eller knuse glasset. Vedhæft en P50 kateter til enten ende af moderator, der dækker omkring 3-4 mm. Brug en sprøjte til at fylde katetret og vedlagte moderator og forlade sprøjten fastgjort til den distale del af kateteret.
- Sæt strømningsmoderatoren ind i pumpen, indtil kateteret flugter med pumpen overflade. Derefter fjernes sprøjten fra den distale ende af kateteret. Anbring pumpen i en steril 0,9% saltopløsning eller PBS-opløsning i en 37 ° C inkubator i mindst 6 timer (fortrinsvis O / N) til at prime pumpen før implanterer den i musen. Pumpen levering sats varierer med modelnummeret (dvs. Model 1002 = 0,25 gl / time i 14 dage).
2.. Oprettelse Ensidig bagben Iskæmi i mus
- Bedøver mus med isofluran sæt mellem 2-4% i 100% O 2 ved en strømningshastighed på 0,4 l / min og fjerne hår (fortrinsvis dagen før kirurgi) på bagbenet og ryggen med en depilatory creme.
- Sterilisere alle kirurgiske værktøjer, før operationen. Placer musen i induktion anæstesi kammer. Brug de samme anæstesi indstillinger, der beskrives i afsnit 2.1.
- Vent til musen er ikke lydhør over for eksterne stimuli, og derefter placere den i bugleje på operationsbordet med en monteret næse kegle, der leverer en kontinuerlig strøm af isofluran (1,5-2,0%).
- Injicere den anbefalede dosis af bedøvelsesmiddel (Bupivacain, 0,25% (<1 ml / kg)) på incisionssted, behandle huden med en povidon-iod-opløsning efterfulgt af 70% ethanol. Foretag en 4-6 mm indsnit på bagsiden (ved siden af rygsøjlen, i skulderbladene område). Adskil subkutane membran med fine tænger, vend herefter musen til liggende stilling behandle huden med en povidon-jodopløsning efterfulgt af 70% ethanol og gøre 0,8-1 cm snit med mikro-kirurgiske sakse over knæet mod den mediale lår, efter stien af den femorale arterie.
- Tunnel opside af torso med lille kappe-rør (6-fransk) fra den mediale låret til indsnit på ryggen.
- Placer musen i maveleje. Fjern den primede osmotisk pumpe / kateter fra PBS-opløsning og lede kateteret gennem kappen slange til låret.
- Placer pumpen inde i ryggen og lukke den bagerste indsnit med 6-0 prolene sutur (behandle huden med en povidon-iod-opløsning efterfulgt af 70% ethanol). Placer musen tilbage i rygleje, fjerne kappen slanger, forlader kateteret eksponeret gennem snittet på låret. Fastgør benet med kirurgisk tape.
- Adskil det subkutane fedtvæv at afsløre vaskulaturen. For bedre at visualisere karrene, skal du bruge en retraktor til at åbne snit.
- Gennembore membranøs sheath forsigtigt ved hjælp af fine spidse pincet til at få adgang til den vaskulære bundt. Dissekere og adskille femoralarterien fra lårvenen og nerve nær lysken, pas på ikke at forårsage exoverforbrug blødning.
- Place to 8-0 PROLENE tilstødende suturer at afbryde den femorale arterie 2-3 mm proximalt til den femorale forgrening (oprindelsen af dybtliggende femoris og epigastrica arterierne).
- Skær kateteret i passende længde og placer spidsen til anterolateralt region af låret, sikre det med en 6-0 prolene sutur til den overfladiske fascie at sikre målrettet levering af stoffet. Luk ben indsnit med en 6-0 kørende sutur. Administrere en endelig subkutan injektion af smertestillende (Buprenorfin, 0,1 mg / kg), behandle huden med en povidon-iod-opløsning efterfulgt af 70% ethanol og returnere musen til buret. Brug en varmelampe under opsving.
- Efter en 30-min tilbagebetalingsperioden, forberede musen til laser Doppler-billedbehandling for at bekræfte oprettelsen af bagbenet iskæmi.
- Overvåg dyret to gange dagligt i 5 dage efter operationen. Mobilitet af dyret vil blive observeret til at analysere smerter, affald i buret vil tjene som en indiskator af at spise. Også under skærmen periode afgøre, om dyret oplever smerte eller ubehag og give en subkutan injektion af buprenorphin (0.1mg/kg) to gange dagligt.
3.. Imaging Prøvepræparation
- Bedøver musen som anført i afsnit 2.1. Overfør musen på operationsbordet i rygleje. Injicer 1.000 IU heparin subkutant for at forhindre koagulation i karrene. Mens musen er fastgjort til næsekeglens, lave et snit stor nok til at blotlægge brysthulen og underlivet. Flyt abdominale organer til venstre side af dyret for at blotlægge den infrarenale abdominale aorta (IAA). Adskil forsigtigt aorta fra den ringere cava vene.
- Ligere proximale IAA at reducere blødning under kateteret. Så gør et lille snit på IAA. Indsæt en 27 ½ G stump nål (knyttet til en P10 kateter) ind i IAA, og fastgør den med en 6-0 sutur.
- Fyld to20cc sprøjter med hepariniseret saltvand og 10% neutral bufferet formalin (NBF). Fyld en 5cc sprøjte med en kontrast radioopak silikonegummi sammensatte. Bland de tre ingredienser i MV-compound: MV-fortynder: MV-hærdende agent i arbejdsgrupper forhold på 1:1.25:0.5. Da blandingen (Microfil) kun har en arbejdstid på 20 minutter, før midlet polymeriserer, anbefales det ikke at tilføje MV-hærder indtil lige før injektion i vaskulaturen.
- Lav et snit i højre atrium og administrere en overdosis af isofluran at fremkalde eutanasi og give mulighed for dræning af overskydende væske. Fastgør saltvand fyldt injektionssprøjte til nålespidsen og begynde at skylle vaskulaturen i 5 min. Sørg for at alle blod skylles ud af de fartøjer slukke isofluran og afbryd næsekeglens når udskylning begynder. Dernæst fastgøres formalin fyldt injektionssprøjte til kateteret beskrevet ovenfor (3.2) og tryk perfuse for en yderligere 5 min. Endelig perfundere den sidste sprøjte med kontrastenagent, langsomt i musen i 5 min.
- Valgfrit: fotograferes Microfil i karrene med et kamera til at sikre, at kun den arterielle struktur perfunderes.
- Placer musen i en beholder fyldt med 10% NBF og opbevares ved 4 ° CO / N for kontraststof polymerisation. Efter 24 timer, fjern skindet på den nederste halvdel af torso (distalt til den nedre abdominale aorta ligering) ved hjælp af dissektion værktøjer, opdatere 10% NBF, og placere musen tilbage i beholderen yderligere 4 dage ved stuetemperatur.
- Dissekerer kontralaterale og iskæmiske baglemmer, og placer modellerne i en myresyre-løsning (Cal-Ex II) i 48 timer for at lette afkalkning af knoglerne. Derefter skylles prøverne under rindende vand i 1 time og vende tilbage til 10% NBF og fortsætte med Faxitron (x-ray system, der anvendes til at sikre knoglen afkalket) og mikro-CT-scanning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Animationen viser den osmotiske pumpe indsættelse og bagben iskæmi kirurgi beskrevet i protokollen. Figur 1 viser laser Doppler billeder af perfusion af bagbenet, bekræfter iskæmi. Efter vaskulær støbning med Microfil, viser en 3D mikro-CT billede af det vaskulære netværk, Microfil kan fylde skibene effektivt (figur 2A), men at diskontinuiteter kan forekomme (fig. 2B) på grund af forskellige proceduremæssige faktorer (fx luftbobler, manglende tryk, viskositet Microfil).
Animation Legend
- Placer musen i bugleje og lave et snit på ryggen ved siden af rygsøjlen.
- Expose den lille back snit.
- Placer musen i liggende stilling og lave et lille snit over knæet ved den mediale lår.
- Adskil huden, udsætter kar, og indsæt kappe slangen op på siden torso af mouse til bagsiden indsnit.
- Tag den osmotiske pumpe og indsætning af kateteret ind i hylsteret slangen.
- Placer musen i liggende stilling og lede kateteret ned gennem slangen til snit i låret.
- Placer musen i bugleje og placere pumpen på ryggen og lukke snittet.
- Placer musen i liggende stilling, og tag kappen slangen.
- Træk huden med en retraktor og bruge mikrokirurgiske redskaber til at adskille vene fra arterie. Double ligere femorale arterie over den femorale forgrening med sutur.
- Fastgør kateteret til den overfladiske væv af låret.
- Luk ben indsnit med sutur.
Figur 1. Bekræftelse af hindlimb iskæmi via laser Doppler perfusion imager. Repræsentanten Doppler billeder show blodperfusionen før og efter kirurgisk ligering af femoral arterie i mus bagben. Iskæmi blev skabt i venstre bagben (se pile).
Figur 2. 3D Micro-CT billede af bagben vaskulatur. Vaskulær støbning med Microfil afslører et netværk af vener og arterier hele bagbenet (A). Diskontinuitet i Microfil kan også forekomme (B), invaliderende visualisering af en detaljeret vaskulære netværk (se pile).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi en metode til osmotisk stof / stof levering i en musemodel af bagben iskæmi. Herudover beskriver vi en støbeteknik, hvor vi har brugt Microfil at frembringe en 3D-rekonstruktion til analyse af det vaskulære netværk.
Niveauet eller sværhedsgraden af iskæmi varierer efter hvor arteriel ligering / excision er lavet. Vi skabte en dobbelt ligation i fælles femoralarterie proksimalt til oprindelsen af den dybtliggende femoris og epigastrica arterier, denne tilgang kan producere en mere alvorlig iskæmi i den distale bagben. Vær sikker på at overvåge dyrene efter kirurgi og give smertelindring ved lokal administration af analgetika. Derudover kan Microfil ikke altid perfundere lemmer kar fuldstændigt. Derfor er det vigtigt at sikre, at al blodet skylles ud af vaskulaturen efter perfusion af hepariniseret saltvand. Årsager til ufuldstændig perfusion af Microfil omfatter manglen på enpplied tryk eller forkert viskositet Microfil, skal begge være tilstrækkelig til at sikre Microfil når de mest distale regioner i bagbenet, og dermed udfylder hele vaskulatur. For at løse disse problemer, anvender konsekvent pres ved 100 mmHg og eksperimentere med det sammensatte: fortynderrummene nøgletal for den særlige dyr ansøgningen.
At studere arteriogenese (eksisterende kollateral arterievækst), den ideelle fremgangsmåde er at ligere den femorale arterie umiddelbart distalt for oprindelsen af den dybe femorale gren at omdirigere blodtilførslen til kollaterale kar. Men reaktionen på denne fremgangsmåde varierer meget blandt musestammer, og omfanget af iskæmi kan være utilstrækkelig i nogle musestammer (f.eks C57BL / 6). En mindre alvorlig iskæmisk model kan ikke give en forlænget vindue af tid til at undersøge terapeutiske virkninger i stærkt vaskulariserede musestammer, såsom C57BL / 6. For at undgå disse problemer, vi skabt hindlimb iskæmi by ligering af proximale femorale arterie, hvilket skabte en mere alvorlig iskæmi bedre demonstrere de lokale medikamentfrigivelsesprofiler effekter, men denne tilgang udelukker analyse af arteriogenese i de proximale dybe gren kollaterale kar. Således er de terapeutiske virkninger hovedsageligt fra den distale iskæmisk område, som er i overensstemmelse med den anatomiske placering (anterolaterale lår), hvor lægemidlet / stof frigives. Under operationen, er det afgørende ikke at skade den skrøbelige lårvenen fordi lokal blødning kan føre til betændelse og ødem, som påvirker både arteriogenesis og angiogenese. Vi anbefaler at bruge 8-0 PROLENE suturer at ligere lårarterien med en passende knude slips for at undgå stræk, stamme, eller brud af arterien. Desuden skal Microfil anvendes straks (inden for 20 min), efter blanding af de 3 ingredienser (forbindelse, fortyndingsmiddel og hærdemiddel), fordi det hurtigt polymeriserer, hvilket skaber tekniske vanskeligheder til injektion. Som tidligere staTed, er Microfil ikke altid med held perfundere de mindre kar, men praksis og brug af de rigtige teknikker kan hjælpe med at overvinde denne begrænsning.
Pumpen påfyldningsvolumen skal være over 90% af den gennemsnitlige fyldvolumen, hvis ikke, kan ekstra luft bliver fanget inde i pumpen. Yderligere tekniske oplysninger er placeret på www.alzet.com . Desuden skal Microfil middel være ved den foretrukne viskositet for en særlig anvendelse, så forholdet mellem fortyndingsmiddel forbindelse muligvis ændres.
Den hindlimb iskæmi-modellen er meget reproducerbar og gælder for PAD 10,11. Den stabile levering af terapeutiske midler i denne model er nødvendig for at opnå informative resultater 2.. Konklusionen er, 3D imaging teknik, som vi bruges til at visualisere de morfologiske strukturer et glimrende værktøj til at undersøge musen kar og giver et kraftfuldt system for studying vaskulære patologier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt. Alle animalske procedurer blev gennemført i overensstemmelse med retningslinjerne for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr, og blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på University of Texas Health Science Center på Houston.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Keith Michel af MD Anderson Mindre Husdyrs Imaging Facility for sin tekniske bistand med mikro-CT-scanning, Edward TH Yeh, MD, til kirurgisk assistance, og Rebecca Bartow, ph.d., til redaktionel assistance. Dette arbejde blev støttet delvist af American Heart Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Surgical tools | Fine Science Tools | Type: Tool | |
| Puritan sterile cotton swabs | Fisher Scientific | 22-029-499 | Type: Tool |
| Betadine (povidone-iodine) | Fisher Scientific | 19-065534 | Type: Reagent |
| 70% Alcohol pads | Fisher Scientific | NC9926371 | Type: Reagent |
| Phosphate buffered saline | Lonza | 17-516F | Type: Reagent |
| 6-0 prolene suture | Cardinal Health | 8709 | Type: Tool |
| 8-0 prolene suture | Cardinal Health | 2775 | Type: Tool |
| Depilatory cream | Nair | Type: Tool | |
| Osmotic pump |  ALZET |
1002 | Type: Tool, 14 day release |
| Vinyl catheter | ALZET |
7760 | Type: Tool |
| Heparinized saline (0.9%) | Baxter | 2B0944 | Type: Reagent |
| Neutral buffered formalin | Richard-Allan Scientific | 5705 | Type: Reagent |
| Microfil (silicone rubber contrast agent) | Flowtech | MV-112 | Type Reagent, Microfil White |
| Cal-Ex II (formic acid solution) | Fisher Scientific | CS511-1D | Type: Reagent |
| Buprenex | CIII | 7571 | Type: Analgesic |
| Bupivicaine | Hospira, Inc. | 381 | Type: Analgesic |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Carl Zeiss Microimaging | Zeiss Stemi 2000-C | Type:Equipment |
| Laser Doppler perfusion imager | Perimed Inc. | Periscan PIM3 | Type:Equipment |
| Micro-CT imaging system | GE Healthcare | Explore Locus SP | Type:Equipment |
References
- Epstein, S. E., Fuchs, S., Zhou, Y. F., Baffour, R., Kornowski, R. Therapeutic interventions for enhancing collateral development by administration of growth factors: basic principles, early results and potential hazards. Cardiovasc. Res. 49, 532-542 (2001).
- Esaki, J., Marui, A., Tabata, Y., Komeda, M. Controlled release systems of angiogenic growth factors for cardiovascular diseases. Expert Opin. Drug Deliv. 4, 635-649 (2007).
- Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, 1267-1279 (2002).
- Golomb, B. A., Dang, T. T., Criqui, M. H. Peripheral arterial disease: morbidity and mortality implications. Circulation. 114, 688-699 (2006).
- Hiatt, W. R. Pharmacologic therapy for peripheral arterial disease and claudication. J. Vasc. Surg. 36, 1283-1291 (2002).
- Hirsch, A. T., et al. Peripheral arterial disease detection, awareness, and treatment in primary care. JAMA. 286, 1317-1324 (2001).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat. Med. 9, 713-725 (2003).
- Hirsch, A. T., et al. ACC/AHA Guidelines for the Management of Patients with Peripheral Arterial Disease (lower extremity, renal, mesenteric, and abdominal aortic): a collaborative report from the American Associations for Vascular Surgery/Society for Vascular Surgery, Society for Cardiovascular Angiography and Interventions, Society for Vascular Medicine and Biology, Society of Interventional Radiology, and the ACC/AHA Task Force on Practice Guidelines (writing committee to develop guidelines for the management of patients with peripheral arterial disease)--summary of recommendations. J. Vasc. Interv. Radiol. 17, 1383-1397 (2006).
- Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. Molecular imaging of vessels in mouse models of disease. Eur. J. Radiol. 70, 305-311 (2009).
- Losordo, D. W., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109, 2487-2491 (2004).
- Waters, R. E., Terjung, R. L., Peters, K. G., Annex, B. H. Preclinical models of human peripheral arterial occlusive disease: implications for investigation of therapeutic agents. J. Appl. Physiol. 97, 773-780 (2004).
