高效，快速的早期胚胎分离<em>拟南芥</em>种子
Summary
我们报告了一种简单有效的方法分离胚胎在早期发展阶段<em>拟南芥</em>种子。多达40个胚胎可以在1小时至4小时，分离根据下游应用。该程序是适用于转录，DNA甲基化，报告基因的表达，免疫荧光<em在原位</em>杂交分析。
Abstract
开花植物，胚胎发育滋补组织 – 胚乳 – 经产妇种子珠被包围（或种子大衣）。其结果是，隔离植物胚胎早期阶段（1细胞球形期）在技术上具有挑战性，由于它们的相对位置偏远。在早期阶段高效的手动剥离强烈影响年轻的拟南芥种子的小尺寸和对周围组织的密合性的胚胎。在这里，我们描述了一种方法，使拟南芥幼胚的高效分离，得到在1小时至4小时，根据下游应用的40个胚胎。通过略微粉碎250-750种子用塑料杵在Eppendorf管中，的胚胎被释放到隔离缓冲器。一种玻璃微毛细管连接到一个标准实验室吸液管（通过橡胶管）或液压控制的微量注射器是用来收集胚胎从液滴位上多井倒置显微镜上滑动。所需的技术很简单，很容易转移，并基本安装不需要昂贵的设备。收集胚胎适合用于各种下游应用如逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR），RNA测序，DNA甲基化分析， 荧光原位杂交（FISH），免疫荧光，和报告基因检测。
Introduction
开花植物的胚胎被包围的胚乳，营养组织来自第二施肥事件。胚和胚乳种皮包围几层细胞。总的来说，这些组织形成了一个种子，这里面的水果开发。因此，组织和细胞特异性分析拟南芥胚胎强烈受损，由于他们无法进入。然而，胚胎后期球状或更高的阶段是相对适合人工清扫使用细钨针，体视显微镜下，或使用镊子提取它们施加轻微压力种子。这种技术已成功用于转录或表观基因组的分析，如分析芯片杂交，亚硫酸氢盐测序，RNA测序（ 如 1-3）。相反，研究胚胎在球状早期受精卵保持技术上的挑战。至目前为止，只有少数的研究有代表转录组分析orted固定的种子第4或个人从种子的胚胎，用细的工具5手动提取的胚胎组织可以使用激光捕获显微切割（LCM）的幼胚。然而，LCM设备是不常用的和手动提取胚胎在早期阶段是耗费时间和需要优秀的清扫技能是不会轻易转让。除的全基因组分析， 原位基因表达分析也难以进行，年轻，整个安装拟南芥胚胎。在一定程度上被释放幼胚在种子上的温和的压力来在显微镜玻片上，并用于报告基因检测或蛋白的检测通过免疫组化（例如见6,7）。然而，该技术中，不允许高通量胚胎隔离，从而阻碍了定量分析。
因此，我们开发了一个高效，快速的协议从拟南芥种子，设置简单，很容易转移，适合各种下游应用的早期胚胎隔离。其基本原理是轻轻压碎种子 – 从解剖幼荚Eppendorf管中，使用塑料杵在适当的隔离缓冲区。籽提取物被放置在液滴上的多井滑动的存在下释放的胚胎进行筛选使用倒置显微镜在所需的阶段。用玻璃微毛细管连接到微量注射器或标准实验室吸液管收集胚胎。对于分子的应用，胚胎洗涤两次，反复滴释放到新的隔离缓冲，然后将他们转移到目标缓冲区在一个最小的体积。进行细胞学的应用程序（报告基因分析，免疫染色，FISH），洗涤步骤可以省略。
该方法有几个优点：（一）〜45分钟进行细胞学的应用程序产生25-40个胚胎的lications或在3-4小时的分子的应用程序（包括清洗步骤），（ii）其允许隔离特异性胚胎阶段，（ⅲ）是很容易转移到其他人的实验室由于其简单的设置，（ⅳ）需要可负担得起的设备的基本设置，这是可以升级，以及（v）被成功地用于各种下游应用，如RNA测序，基因特异性的DNA甲基化分析9，报告基因分析（10和Raissig 等。准备），鱼（J.詹尼士，U. Grossniklaus，C. Baroux未发表的，请参阅图5）。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们开发了一个胚胎隔离协议，它是快速，有效，并可以很容易地转移到其他实验室。
这里所叙述的设备包括倒置显微镜，显微操作，玻璃微毛细管，垂直灯丝拉出器和微量注射器（ 图3A）。其设置与一个单一的动物细胞分离的转录组学分析17。我们还成功地与玻璃微毛细管手动伸过来的火焰（切带菱形刀片），并通过标准实验室移液器（P-200的Pipetman）?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢塔尔Nawy和马丁拜耳他们的意见，在胚胎隔离。地铁，VG，UG和CB的设计胚胎隔离设备。地铁，VG和CB的发展胚胎隔离协议。地铁，VG和CB成立的协议，分离出的胚胎，产生的胚胎基因，VG进行地铁GUS染色，PCR，JJ鱼实验。地铁，VG，CG和UG写的手稿。这项工作是由苏黎世大学，罗氏研究基金会（地铁）名衔，以及从瑞士国家基金会（UG和CB）补助。
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies |
References
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