Isolation efficace et rapide des embryons à un stade précoce de<em> Arabidopsis thaliana</em> Graines
Summary
Nous rapportons une méthode simple et efficace pour isoler les embryons aux premiers stades de développement de<em> Arabidopsis thaliana</em> Graines. Embryons jusqu'à 40 peuvent être isolés dans 1 h à 4 h, en fonction de l'application en aval. Le procédé est approprié pour transcriptome, la méthylation de l'ADN, l'expression du gène rapporteur, et la fluorescence immunomarquage<em> In situ</em> Analyses d'hybridation.
Abstract
Chez les plantes à fleurs, l'embryon se développe au sein d'un tissu nourricier – l'endosperme – entouré par les téguments de la graine mère (ou tégument). En conséquence, l'isolement des embryons de plantes à des stades précoces (1 cellule de stade globulaire) est techniquement difficile en raison de leur inaccessibilité relative. Dissection manuelle efficace à un stade précoce est fortement altérée par la petite taille des jeunes graines d'Arabidopsis et l'adhérence de l'embryon aux tissus environnants. Nous décrivons ici une méthode qui permet l'isolement efficace des jeunes embryons d'Arabidopsis, produisant jusqu'à 40 embryons en 1 h à 4 h, en fonction de l'application en aval. Les embryons sont libérés dans le tampon d'isolement d'un peu écrasant 250-750 graines avec un pilon en plastique dans un tube Eppendorf. Un verre microcapillaire monté soit une pipette de laboratoire standard (par l'intermédiaire d'un tube de caoutchouc) ou un micro-injecteur à commande hydraulique est utilisé pour recueillir des embryons d'un endroit gouttelettesd sur un chariot multi-puits sur un microscope optique inversé. Les compétences techniques requises sont simples et facilement transférables, et la configuration de base ne nécessitent pas de matériel coûteux. Embryons collectés sont adaptés à une grande variété d'applications en aval telles que la RT-PCR, séquençage de l'ARN, des analyses de méthylation de l'ADN, l'hybridation fluorescente in situ (FISH), immunologique, et des dosages de gènes rapporteurs.
Introduction
L'embryon de plantes à fleurs est entouré par l'albumen, un tissu nutritif dérivé d'un deuxième événement de la fécondation. Les deux embryon et de l'endosperme sont entourés de plusieurs couches cellulaires de l'enveloppe de la graine. Collectivement, ces tissus constituent une graine, qui se développent à l'intérieur du fruit. Ainsi, les tissus et les analyses spécifiques des cellules d'embryons d'Arabidopsis sont fortement altérées en raison de leur inaccessibilité. Néanmoins, les embryons au stade tardif globulaires ou plus sont relativement bien prête à dissection manuelle en utilisant des aiguilles de tungstène fines au microscope stéréoscopique, ou en appliquant une légère pression sur la graine en utilisant une pince pour les extraire. Ces techniques ont été utilisées avec succès pour les analyses de profilage épigénome telles que l'hybridation de puces à ADN, séquençage au bisulfite, ou de l'ARN (par exemple 1-3) ou transcriptome. En revanche, les études d'embryons au zygote jusqu'au début du stade globulaire restent techniquement difficile. À ce jour, seules quelques études ont repLes analyses du transcriptome signalés auparavant sur les jeunes embryons en utilisant soit microdissection laser-capture (LCM) de tissus embryonnaires de sections de semences fixe 4 ou extraction manuelle des embryons individuels de semences à l'intérieur en utilisant des outils fines 5. Toutefois, l'équipement LCM n'est pas couramment disponibles et extraction de l'embryon aux premiers stades manuel prend du temps et exige d'excellentes compétences de dissection qui ne sont pas facilement transférables. En plus des analyses du génome entier, dans les analyses d'expression génique in situ sont également difficiles à réaliser sur les jeunes, l'ensemble du montage embryons d'Arabidopsis. Dans une certaine mesure, les jeunes embryons peuvent être libérés sur des lames de microscope par une légère pression sur les graines et utilisés pour des essais de gène rapporteur ou la détection des protéines par coloration immunologique (voir par exemple 6,7). Cette technique, cependant, ne permet pas l'isolement des embryons à haut débit, entravant ainsi les analyses quantitatives.
Par conséquent, nous avons développé un protocole efficace et rapidepour l'isolement précoce de l'embryon à partir de graines d'Arabidopsis qui est simple à mettre en place, facilement transférable et approprié pour une variété d'applications en aval. Le principe de base est d'écraser doucement graines – disséqué de jeunes siliques dans un tube Eppendorf à l'aide d'un pilon en plastique dans un tampon d'isolement approprié. L'extrait de graines est placée sous forme de gouttelettes sur un chariot multi-puits et est projeté pour la présence d'embryons libérés au stade souhaité à l'aide d'un microscope inversé. Les embryons sont recueillies à l'aide d'un verre MICROCAPILLAIRE attaché à un micro-injecteur ou une pipette de laboratoire standard. Pour les applications moléculaires, les embryons sont lavés deux fois par libération répétées dans des gouttes d'un nouveau tampon d'isolement avant de les transférer à la mémoire tampon de destination dans un volume minimal. Pour les applications cytologiques (dosages de rapporteur, immunomarquage, poisson), des étapes de lavage peuvent être omises.
La méthode présente plusieurs avantages: (i) il donne 25-40 embryons ~ 45 min pour app cytologiquecations ou à 3-4 h pour les applications moléculaires (qui comprend les étapes de lavage), (ii) il permet l'isolement des stades embryonnaires spécifiques, (iii) il est facilement transférable à d'autres personnes et les laboratoires en raison de sa configuration simple, (iv) nécessite un équipement abordable pour la configuration de base qui se prête à la mise à niveau et (v) il a été utilisé avec succès pour diverses applications en aval telles que séquençage de l'ARN 8, analyse méthylation de l'ADN spécifique du gène 9, des dosages de rapporteur (10 et Raissig et al., en prép.) et le poisson (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux inédit, voir figure 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons élaboré un protocole d'isolement de l'embryon qui est rapide, efficace, et peuvent être facilement transférées à d'autres laboratoires.
L'équipement décrit ici se compose d'un microscope inversé, un micromanipulateur, verre microcapillaires, un extracteur de filament vertical et un micro-injecteur (figure 3A). La configuration est similaire à celle décrite pour l'isolement de cellules animales unique pour l'analyse transcript…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Tal Nawy et Martin Bayer pour leurs conseils sur l'isolement de l'embryon. MTR, VG, UG et CB conçu le matériel d'isolation de l'embryon. MTR, VG et CB ont développé le protocole d'isolement de l'embryon. MTR, VG et CB établi le protocole, isolés les embryons, et l'embryon ADNc généré, VG réalisé la PCR, le MTR de coloration GUS, JJ des expériences du poisson. MTR, VG, CG et UG écrit le manuscrit. Ce travail a été financé par l'Université de Zürich, une bourse de la Fondation de recherche Roche (à MTR), et des subventions de la Fondation nationale suisse (à UG et CB).
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies |
References
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