से प्रारंभिक चरण भ्रूण के कुशल और तेजी से अलगाव<em> Arabidopsis thaliana</em> बीज
Summary
हम से विकास की प्रारंभिक अवस्था में भ्रूण को अलग करने के लिए एक कुशल और सरल विधि रिपोर्ट<em> Arabidopsis thaliana</em> बीज. ऊपर से 40 भ्रूण बहाव के आवेदन के आधार पर, 1 घंटा से 4 घंटे में अलग किया जा सकता है. प्रक्रिया, डीएनए मेथिलिकरण, रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति, immunostaining और प्रतिदीप्ति transcriptome के लिए उपयुक्त है<em> बगल में</em> संकरण का विश्लेषण करती है.
Abstract
एण्डोस्पर्म – – मातृ बीज इंटेगुमेंट (या बीज कोट) से घिरे फूल पौधों में, भ्रूण एक पौष्टिक ऊतक के भीतर विकसित करता है. एक परिणाम के रूप में, प्रारंभिक दौर (गोलाकार चरण के लिए 1 सेल) में संयंत्र भ्रूण के अलगाव तकनीकी रूप से उनके रिश्तेदार अप्राप्यता की वजह से चुनौती दे रहा है. प्रारंभिक दौर में कुशल मार्गदर्शन विच्छेदन जोरदार युवा Arabidopsis बीज के छोटे आकार और आसपास के ऊतकों को भ्रूण की चिपचिपाहट से बिगड़ा हुआ है. यहाँ, हम बहाव के आवेदन के आधार पर, 1 घंटा से 4 घंटे में 40 भ्रूण तक की उपज, युवा Arabidopsis भ्रूण के कुशल अलगाव की अनुमति देता है कि एक विधि का वर्णन है. भ्रूण थोड़ा एक Eppendorf ट्यूब में एक प्लास्टिक मूसल के साथ 250-750 के बीज को कुचल से अलगाव बफर में जारी किए हैं. एक गिलास एक मानक प्रयोगशाला विंदुक या तो से जुड़ी microcapillary (एक रबर ट्यूब के माध्यम से) या एक हाइड्रॉलिक नियंत्रित microinjector बूंदों जगह से भ्रूण को इकट्ठा करने के लिए प्रयोग किया जाता हैएक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप पर एक बहु – अच्छी तरह से स्लाइड पर घ. आवश्यक तकनीकी कौशल सरल और आसानी से हस्तांतरणीय हैं, और बुनियादी सेटअप महंगे उपकरण की आवश्यकता नहीं है. एकत्र भ्रूण ऐसे RT-पीसीआर, शाही सेना अनुक्रमण, डीएनए मेथिलिकरण विश्लेषण, सीटू संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति, immunostaining, और पत्रकार जीन assays के रूप में बहाव के अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए उपयुक्त हैं.
Introduction
फूल पौधों की भ्रूण एण्डोस्पर्म, एक दूसरे निषेचन घटना से प्राप्त पोषक ऊतक से घिरा हुआ है. दोनों भ्रूण और एण्डोस्पर्म बीज कोट के कई सेल परतों से घिरे हैं. सामूहिक रूप से इन ऊतकों फल के अंदर विकसित करना जो एक बीज, के रूप में. इस प्रकार, ऊतक और Arabidopsis भ्रूण की सेल विशिष्ट विश्लेषण दृढ़ता से उनकी पहुंच की वजह से प्रभावित कर रहे हैं. फिर भी, देर गोलाकार या बाद के चरणों में भ्रूण अपेक्षाकृत अच्छी तरह stereomicroscope के तहत ठीक टंगस्टन सुई का उपयोग करके पुस्तिका विच्छेदन के लिए उत्तरदायी, या उन्हें निकालने संदंश का उपयोग बीज पर मामूली दबाव लागू करने से कर रहे हैं. इस तरह की तकनीक को सफलतापूर्वक transcriptome या ऐसे माइक्रोएरे संकरण, bisulfite अनुक्रमण, या शाही सेना अनुक्रमण (जैसे 1-3) के रूप में epigenome रूपरेखा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया. इसके विपरीत, जल्दी गोलाकार चरण के लिए युग्मनज में भ्रूण की पढ़ाई तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण रहेगा. तिथि करने के लिए, केवल कुछ अध्ययनों प्रतिनिधि हैनिश्चित बीज वर्गों 4 या ठीक उपकरण 5 का उपयोग कर बीज के भीतर से व्यक्तिगत भ्रूण का मार्गदर्शन निकासी से भ्रूण के ऊतकों के दोनों लेजर कब्जा MICRODISSECTION (LCM) का उपयोग युवा भ्रूण पर orted transcriptome विश्लेषण. हालांकि, एलसीएम उपकरण प्रारंभिक अवस्था में सामान्य रूप से उपलब्ध है और मैनुअल भ्रूण निकासी नहीं है समय आसानी से हस्तांतरणीय नहीं कर रहे हैं कि उत्कृष्ट विच्छेदन कौशल खपत और की आवश्यकता होती है. जीनोम चौड़ा विश्लेषण के अलावा, सीटू जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में भी Arabidopsis के युवा, पूरे माउंट भ्रूण पर प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल हैं. कुछ हद तक, युवा भ्रूण बीज पर कोमल दबाव से खुर्दबीन स्लाइड पर रिहा किया जा सकता है और (उदाहरण के लिए 6,7 देखें) immunostaining द्वारा पत्रकार जीन assays के या प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया. इस तकनीक में, तथापि, इस प्रकार मात्रात्मक विश्लेषण निरोधक, उच्च throughput भ्रूण अलगाव की अनुमति नहीं है.
इसलिए, हम एक कुशल और तेजी से प्रोटोकॉल विकसित, आसानी से हस्तांतरणीय, और नीचे की ओर आवेदनों की एक किस्म के लिए उपयुक्त स्थापित करने के लिए सरल है कि Arabidopsis बीज से जल्दी भ्रूण अलगाव के लिए. एक उपयुक्त अलगाव बफर में एक प्लास्टिक मूसल का उपयोग करते हुए एक Eppendorf ट्यूब में युवा siliques से विच्छेदित – बुनियादी सिद्धांत धीरे बीज को कुचलने के लिए है. बीज निकालने के लिए एक बहु अच्छी तरह से स्लाइड पर बूंदों में रखा गया है और एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर वांछित स्तर पर जारी भ्रूण की उपस्थिति के लिए जांच की जाती है. भ्रूण एक गिलास एक microinjector या एक मानक प्रयोगशाला विंदुक से जुड़ी microcapillary का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं. आणविक अनुप्रयोगों के लिए, भ्रूण एक न्यूनतम मात्रा में गंतव्य बफर करने के लिए उन्हें स्थानांतरित करने से पहले नए अलगाव बफर की बूंदों में दोहराया रिलीज से दो बार धोया जाता है. कोशिकीय अनुप्रयोगों (संवाददाता assays के immunostaining, मछली) के लिए, धोने कदम छोड़ा जा सकता है.
विधि कई लाभ प्रदान करता है: (i) यह कोशिकीय अनुप्रयोग के लिए 45 मिनट ~ में 25-40 भ्रूण पैदावारआणविक अनुप्रयोगों (धोने कदम सहित) के लिए lications या 3-4 घंटे में, (ii) यह है कि यह विशिष्ट भ्रूण चरणों का अलगाव, (iii) (iv) आसानी से अपने साधारण सेटअप के कारण अन्य व्यक्तियों और प्रयोगशालाओं के लिए हस्तांतरणीय है की अनुमति देता है , उन्नयन करने के लिए उत्तरदायी है, जो बुनियादी सेटअप के लिए सस्ती उपकरणों की आवश्यकता है, और (v) यह सफलतापूर्वक शाही सेना अनुक्रमण 8, जीन विशिष्ट डीएनए मेथिलिकरण विश्लेषण 9, संवाददाता assays के (10 और Raissig एट अल. के रूप में विभिन्न बहाव के अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया था में प्रस्तुत करने का.), और मछली (जे Jaenisch, यू Grossniklaus, सी. Baroux अप्रकाशित), चित्रा 5 देखें.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम प्रभावी, तेजी से है कि एक भ्रूण अलगाव प्रोटोकॉल विकसित की है, और आसानी से अन्य प्रयोगशालाओं में स्थानांतरित किया जा सकता है.
यहाँ वर्णित उपकरण एक औंधा माइक्रोस्कोप, एक micromanipulator, कांच microcapillaries, ए?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम भ्रूण अलगाव पर उनकी सलाह के लिए ताल Nawy और मार्टिन बायर को धन्यवाद देना चाहूंगा. एमटीआर, वी.जी., यूजी और सीबी भ्रूण अलगाव उपकरण तैयार कर लिया. एमटीआर, वी.जी. और सीबी भ्रूण अलगाव प्रोटोकॉल विकसित की है. एमटीआर, वी.जी. और सीबी, प्रोटोकॉल स्थापित भ्रूण अलग, और उत्पन्न भ्रूण सीडीएनए, वी.जी. पीसीआर, एमटीआर गस धुंधला, जे जे मछली प्रयोगों का प्रदर्शन किया. एमटीआर, वी.जी., तटरक्षक और यूजी पांडुलिपि लिखा था. इस काम के ज्यूरिख विश्वविद्यालय, रॉश रिसर्च फाउंडेशन (एमटीआर के लिए) की एक फैलोशिप, और स्विस नेशनल फाउंडेशन (यूजी और सीबी) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies |
References
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