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Biology

से प्रारंभिक चरण भ्रूण के कुशल और तेजी से अलगाव Published: June 7, 2013 doi: 10.3791/50371
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Plant Biology and Zürich-Basel Plant Science Center, University of Zürich

Summary

हम से विकास की प्रारंभिक अवस्था में भ्रूण को अलग करने के लिए एक कुशल और सरल विधि रिपोर्ट

Abstract

एण्डोस्पर्म - - मातृ बीज इंटेगुमेंट (या बीज कोट) से घिरे फूल पौधों में, भ्रूण एक पौष्टिक ऊतक के भीतर विकसित करता है. एक परिणाम के रूप में, प्रारंभिक दौर (गोलाकार चरण के लिए 1 सेल) में संयंत्र भ्रूण के अलगाव तकनीकी रूप से उनके रिश्तेदार अप्राप्यता की वजह से चुनौती दे रहा है. प्रारंभिक दौर में कुशल मार्गदर्शन विच्छेदन जोरदार युवा Arabidopsis बीज के छोटे आकार और आसपास के ऊतकों को भ्रूण की चिपचिपाहट से बिगड़ा हुआ है. यहाँ, हम बहाव के आवेदन के आधार पर, 1 घंटा से 4 घंटे में 40 भ्रूण तक की उपज, युवा Arabidopsis भ्रूण के कुशल अलगाव की अनुमति देता है कि एक विधि का वर्णन है. भ्रूण थोड़ा एक Eppendorf ट्यूब में एक प्लास्टिक मूसल के साथ 250-750 के बीज को कुचल से अलगाव बफर में जारी किए हैं. एक गिलास एक मानक प्रयोगशाला विंदुक या तो से जुड़ी microcapillary (एक रबर ट्यूब के माध्यम से) या एक हाइड्रॉलिक नियंत्रित microinjector बूंदों जगह से भ्रूण को इकट्ठा करने के लिए प्रयोग किया जाता हैएक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप पर एक बहु - अच्छी तरह से स्लाइड पर घ. आवश्यक तकनीकी कौशल सरल और आसानी से हस्तांतरणीय हैं, और बुनियादी सेटअप महंगे उपकरण की आवश्यकता नहीं है. एकत्र भ्रूण ऐसे RT-पीसीआर, शाही सेना अनुक्रमण, डीएनए मेथिलिकरण विश्लेषण, सीटू संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति, immunostaining, और पत्रकार जीन assays के रूप में बहाव के अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए उपयुक्त हैं.

Introduction

फूल पौधों की भ्रूण एण्डोस्पर्म, एक दूसरे निषेचन घटना से प्राप्त पोषक ऊतक से घिरा हुआ है. दोनों भ्रूण और एण्डोस्पर्म बीज कोट के कई सेल परतों से घिरे हैं. सामूहिक रूप से इन ऊतकों फल के अंदर विकसित करना जो एक बीज, के रूप में. इस प्रकार, ऊतक और Arabidopsis भ्रूण की सेल विशिष्ट विश्लेषण दृढ़ता से उनकी पहुंच की वजह से प्रभावित कर रहे हैं. फिर भी, देर गोलाकार या बाद के चरणों में भ्रूण अपेक्षाकृत अच्छी तरह stereomicroscope के तहत ठीक टंगस्टन सुई का उपयोग करके पुस्तिका विच्छेदन के लिए उत्तरदायी, या उन्हें निकालने संदंश का उपयोग बीज पर मामूली दबाव लागू करने से कर रहे हैं. इस तरह की तकनीक को सफलतापूर्वक transcriptome या ऐसे माइक्रोएरे संकरण, bisulfite अनुक्रमण, या शाही सेना अनुक्रमण (जैसे 1-3) के रूप में epigenome रूपरेखा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया. इसके विपरीत, जल्दी गोलाकार चरण के लिए युग्मनज में भ्रूण की पढ़ाई तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण रहेगा. तिथि करने के लिए, केवल कुछ अध्ययनों प्रतिनिधि हैनिश्चित बीज वर्गों 4 या ठीक उपकरण 5 का उपयोग कर बीज के भीतर से व्यक्तिगत भ्रूण का मार्गदर्शन निकासी से भ्रूण के ऊतकों के दोनों लेजर कब्जा MICRODISSECTION (LCM) का उपयोग युवा भ्रूण पर orted transcriptome विश्लेषण. हालांकि, एलसीएम उपकरण प्रारंभिक अवस्था में सामान्य रूप से उपलब्ध है और मैनुअल भ्रूण निकासी नहीं है समय आसानी से हस्तांतरणीय नहीं कर रहे हैं कि उत्कृष्ट विच्छेदन कौशल खपत और की आवश्यकता होती है. जीनोम चौड़ा विश्लेषण के अलावा, सीटू जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में भी Arabidopsis के युवा, पूरे माउंट भ्रूण पर प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल हैं. कुछ हद तक, युवा भ्रूण बीज पर कोमल दबाव से खुर्दबीन स्लाइड पर रिहा किया जा सकता है और (उदाहरण के लिए 6,7 देखें) immunostaining द्वारा पत्रकार जीन assays के या प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया. इस तकनीक में, तथापि, इस प्रकार मात्रात्मक विश्लेषण निरोधक, उच्च throughput भ्रूण अलगाव की अनुमति नहीं है.

इसलिए, हम एक कुशल और तेजी से प्रोटोकॉल विकसित, आसानी से हस्तांतरणीय, और नीचे की ओर आवेदनों की एक किस्म के लिए उपयुक्त स्थापित करने के लिए सरल है कि Arabidopsis बीज से जल्दी भ्रूण अलगाव के लिए. एक उपयुक्त अलगाव बफर में एक प्लास्टिक मूसल का उपयोग करते हुए एक Eppendorf ट्यूब में युवा siliques से विच्छेदित - बुनियादी सिद्धांत धीरे बीज को कुचलने के लिए है. बीज निकालने के लिए एक बहु अच्छी तरह से स्लाइड पर बूंदों में रखा गया है और एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर वांछित स्तर पर जारी भ्रूण की उपस्थिति के लिए जांच की जाती है. भ्रूण एक गिलास एक microinjector या एक मानक प्रयोगशाला विंदुक से जुड़ी microcapillary का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं. आणविक अनुप्रयोगों के लिए, भ्रूण एक न्यूनतम मात्रा में गंतव्य बफर करने के लिए उन्हें स्थानांतरित करने से पहले नए अलगाव बफर की बूंदों में दोहराया रिलीज से दो बार धोया जाता है. कोशिकीय अनुप्रयोगों (संवाददाता assays के immunostaining, मछली) के लिए, धोने कदम छोड़ा जा सकता है.

विधि कई लाभ प्रदान करता है: (i) यह कोशिकीय अनुप्रयोग के लिए 45 मिनट ~ में 25-40 भ्रूण पैदावारआणविक अनुप्रयोगों (धोने कदम सहित) के लिए lications या 3-4 घंटे में, (ii) यह है कि यह विशिष्ट भ्रूण चरणों का अलगाव, (iii) (iv) आसानी से अपने साधारण सेटअप के कारण अन्य व्यक्तियों और प्रयोगशालाओं के लिए हस्तांतरणीय है की अनुमति देता है , उन्नयन करने के लिए उत्तरदायी है, जो बुनियादी सेटअप के लिए सस्ती उपकरणों की आवश्यकता है, और (v) यह सफलतापूर्वक शाही सेना अनुक्रमण 8, जीन विशिष्ट डीएनए मेथिलिकरण विश्लेषण 9, संवाददाता assays के (10 और Raissig एट अल. के रूप में विभिन्न बहाव के अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया था में प्रस्तुत करने का.), और मछली (जे Jaenisch, यू Grossniklaus, सी. Baroux अप्रकाशित), चित्रा 5 देखें.

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Protocol

प्रक्रिया चित्र 1 में दिखाया फ्लोचार्ट में संक्षेप. microcapillaries और वाद्य सेटअप चित्रा 2 और 3 चित्र में दिखाया जाता है, और भ्रूण अलगाव की ठेठ कदम चित्रा 4 में दिखाया गया.

1. सामग्री और बफर तैयारी

कांच microcapillaries के 1.1 सिलिकॉन कोटिंग

  1. Sigmacote (सिग्मा) की ~ 5 मिलीलीटर के साथ एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में microcapillaries प्लेस और कई बार पलटना.
  2. समाधान निकालें, 60 डिग्री सेल्सियस पर एक एल्यूमीनियम पन्नी में capillaries युक्त फाल्कन ट्यूब जगह और 3 घंटे के लिए उन्हें सेंकना कमरे के तापमान पर स्टोर.

1.2 ~ 50-100 माइक्रोन व्यास microcapillary युक्तियाँ प्राप्त करें

  1. स्वयं एक लेम्प बर्नर पर या एक वाणिज्यिक खींचने (ऊर्ध्वाधर रेशा खींचने या micropipette खींचने) का उपयोग करके या तो 1 मिमी व्यास कांच capillaries खींचो.
  2. एक हीरे का प्रयोग करेंटिप पेन या वांछित खोलने बनाने के लिए खींच लिया केशिका की नोक कटौती करने के लिए ब्लेड. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत सर्वश्रेष्ठ के आकार केशिकाओं का चयन करें. उद्घाटन 50-100 माइक्रोन (चित्रा 2) होना चाहिए.

1.3 स्लाइड तैयारी

  1. 5 मिनट के लिए Sigmacote (~ 1 मिलीग्राम / स्लाइड) के साथ सभी कुओं को कवर करने से साफ स्लाइड Siliconize, हटा दें. एल्यूमीनियम पन्नी में सेंकना 3 घंटा. कमरे के तापमान पर स्टोर.
  2. 10% एसडीएस, nuclease मुक्त पानी में 2 एक्स 2 मिनट (DEPC-DDH 2 हे autoclaved), 70% इथेनॉल में 2 मिनट, 100% इथेनॉल में 2 मिनट में 10 मिनट के लिए बहु - अच्छी तरह से कांच सूक्ष्म स्लाइड्स धो हवा सूखी. सभी कदम autoclaved Coplin जार में किया जाता है. स्लाइड्स प्रत्येक उपयोग के बीच पूरी तरह से सफाई प्रदान कर कई बार फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. बस से पहले भ्रूण अलगाव प्रसार के लिए ~ 10 के 0.5 μl मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम albumin (BSA) के प्रत्येक अच्छी तरह से और हवा शुष्क की पूरी सतह पर एक विंदुक के साथ.

1.4 माइक्रोस्कोप और केशिका सेटअप

<राजभाषा>
  • एक 10x और 20x बढ़ाई उद्देश्य के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. प्रकाश विपरीत अनुकूलन (भ्रूण काफी पारदर्शी हैं).
  • माइक्रोस्कोप के पास केशिका गिलास पकड़ने के लिये एक micromanipulator रखें. केशिका गिलास एक रबर ट्यूब के माध्यम से एक microinjector (चित्रा 3) के लिए या एक नियमित पी 200 पिपेट से जुड़ा है (चित्रा 3 बी, इस स्थापना का विस्तृत विवरण के लिए चर्चा देखें).
  • एक ~ 70 डिग्री कोण पर खुर्दबीन स्लाइड (चित्रा 3) ऊपर केशिका प्लेस और देखने के क्षेत्र में खोलने के लिए स्थिति को समायोजित.
  • बस से पहले भ्रूण अलगाव को लेने के लिए और जारी ~ 5-10 μl बीएसए (1 मिलीग्राम / एमएल) कोट केशिका लिए.

    • 1.5 बफ़र

    तालिका 1 बहाव के अनुप्रयोगों के आधार पर अलगाव और गंतव्य बफ़र्स सूचीबद्ध करता है.

    1. ~ नमूना प्रति 1 मिलीलीटर अलगाव बफर हौसले से पहले का उपयोग करें और यह बर्फ पर रखने को तैयार.
    2. बर्फ (आणविक अनुप्रयोगों) पर या एक नम कक्ष में एक खुर्दबीन स्लाइड (कोशिका संबंधी आवेदन पत्र) पर एक 0.5 मिलीलीटर Eppendorf कम बाध्यकारी ट्यूब में गंतव्य बफर तैयार.

    2. बीज विच्छेदन और भ्रूण निकालना

    बीज विकास की 2.1 सिंक्रोनाइझेशन

    1. फूलों प्रभावहीन और अन्य फूलों के साथ संपर्क में pistils के संपर्क से बचने जबकि उन्हें विकास कक्ष में 2 दिन रखने के लिए, तो उन्हें (जैसे 11) सेचन.
    2. मंजूरी दे दी बीज की सूक्ष्म जांच करके अपनी विकास शर्तों के तहत विकास के चरण का परीक्षण करें. 4 डीएपी गोलाकार झुकेंगे - हमारे विकास की स्थिति के साथ बीज (डीएपी) परागण के बाद 2.5 दिनों एकत्र (21 पर 16 घंटा प्रकाश डिग्री सेल्सियस, 18 की उम्र में अंधेरा 8 घंटा डिग्री सेल्सियस और 70% आर्द्रता) मुख्य रूप से 2-4 सेल भ्रूण और बीज 3.5 एकत्र झुकेंगे भ्रूण.

    2.2 बीज विच्छेदन और टूटना

    1. एस निकालेंसंदंश और इंसुलिन सुइयों के साथ एक stereomicroscope के तहत 10-15 siliques (~ 2.5 डीएपी) से eeds.
    2. बर्फ पर रखा एक 2 मिलीलीटर दौर नीचे Eppendorf ट्यूब में 20 μl अलगाव बफर में बीज विसर्जित कर दिया.
    3. धीरे बीज निकालने बादल है जब तक भ्रूण जारी करने के लिए एक प्लास्टिक मूसल (DEPC-DDH 2 हे के साथ rinsed, 10% एसडीएस से पूर्व साफ किया और 70% इथेनॉल के साथ धोया) के साथ बीज को कुचलने. लागू करने के लिए शक्ति परीक्षण पर हर उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जा रहा है.
    4. मूसल धोने और नमूना पतला करने के अलगाव बफर के 300 μl के साथ मूसल कुल्ला.
    5. स्पिन से नीचे 5 सेकंड के लिए 5000 XG पर निकाल सकते हैं. धीरे से ऊपर और नीचे 2-3 बार pipetting द्वारा pelleted निकालने resuspend.
    6. एक 30 माइक्रोन नायलॉन जाल (PartecCelltricks से उदा, ट्यूब एडेप्टर पर घुड़सवार) के साथ निकालने फ़िल्टर. एक अतिरिक्त 200 μl अलगाव बफर के साथ जाल कुल्ला.

    3. भ्रूण अलगाव

    3.1 स्लाइड तैयारी

      <ली> प्लेस उलटा माइक्रोस्कोप के मंच पर एक साफ, बीएसए लिपटे और siliconized बहु अच्छी तरह से स्लाइड, ऊपर और नीचे धीरे pipetting द्वारा फ़िल्टर बीज निकालने resuspend और 1 या 2 कुओं में 40-50 μl बीज निकालने की 2 बूंदों पिपेट . एक समय में केवल 1 या 2 बूँदें स्क्रीनिंग नमूना के वाष्पीकरण से बचाता है.
    1. पहले के रूप में तैयार एक अलग स्लाइड के एक कुएं में ताजा अलगाव बफर की जगह 50 μl (1 सेंट धोने ड्रॉप). वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक कवर, नम कक्ष में इस स्लाइड रखें.

    3.2 स्क्रीन, साफ, इकट्ठा

    1. 10x बढ़ाई उद्देश्य के साथ वांछित स्तर पर भ्रूण के लिए बीज निकालने की बूंदों स्क्रीन. यदि आवश्यक हो, 20x बढ़ाई साथ चरण की पुष्टि करें. भ्रूण आमतौर पर स्लाइड के नीचे सिंक.
    2. मैन्युअल एक टंगस्टन सुई, एक इंसुलिन सुई या इसी तरह के उपकरण के साथ भ्रूण के आसपास मलबे को हटा दें.
    3. Micromanipulator, टी का उपयोग भ्रूण के पास केशिका गिलास ले जाएँसंभव के रूप में छोटे समाधान के रूप में साथ भ्रूण ake.
    4. कई भ्रूण (जैसे सब एक छोटी बूंद का) लीजिए और 1 सेंट धोने ड्रॉप (आणविक अनुप्रयोग) में या गंतव्य बफर (कोशिका संबंधी अनुप्रयोग) में उन्हें रिहा. प्रत्येक एकत्रित दौर एक न्यूनतम मात्रा (सभी एकत्रित राउंड की कुल मात्रा <5 μl होना चाहिए) में एकत्र किया जाना चाहिए 5-10 मिनट और भ्रूण के भीतर रखा जाना चाहिए.
    5. भ्रूण के वांछित राशि (केन्द्र, यदि संभव हो तो, स्मरणशक्ति की सुविधा के लिए) 1 सेंट धोने ड्रॉप में इकट्ठा किया जाता है जब तक स्क्रीनिंग और संग्रह दोहराएँ.
    6. धोने ड्रॉप (मलबे पर किया जाता है, स्मरणशक्ति से पहले एक सुई के साथ उन्हें निकालने के लिए) से कम एक बार सभी भ्रूण याद.
    7. 50 μl के एक 2 एन डी धोने ड्रॉप में भ्रूण रिलीज. 3.2.6 दोहराएँ.
    8. गंतव्य बफर में भ्रूण रिलीज. स्थानांतरण केशिका टिप के केवल एक संपर्क, और नहीं विसर्जन को शामिल करना चाहिए.
    9. Microcapil बदलेंअगले नमूना के लिए लैरी.

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    Representative Results

    Washes के आणविक अनुप्रयोगों के लिए जैसे, प्रदर्शन कर रहे हैं अगर हमारे भ्रूण अलगाव प्रक्रिया (चित्रा 1) 4 घंटे में 40 भ्रूण तक की अलगाव की अनुमति देता है, या एक घंटे से भी कम समय में washes, लोप कोशिकाविज्ञान अनुप्रयोगों के लिए जैसे रहे हैं. चित्रा 2 प्रदर्शित करता है उच्च और निम्न गुणवत्ता microcapillary सुझाव और चित्रा 3 भ्रूण अलगाव मशीन की स्थापना से पता चलता है. चित्रा 4 उलटा माइक्रोस्कोप पर भ्रूण अलगाव की प्रक्रिया को प्रदर्शित करता है.

    हम सफलतापूर्वक हाल ही में कई लेख में प्रकाशित विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए हमारी प्रक्रिया लागू. विधि मूल जल्दी भ्रूण transcriptome को पैतृक योगदान का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया था. दो अलग Arabidopsis accessions (लैंड्सबर्ग erecta (एल एर) और कोलंबिया (कर्नल -0)) के बीच पार के माध्यम से उत्पन्न हाइब्रिड भ्रूण 2-4 सेल स्तर पर अलग थे. कुल शाही सेना निकाला गया था, सीडीएनएपुस्तकालयों रैखिक प्रवर्धन का उपयोग कर उत्पादन और एक ठोस मंच पर अनुक्रम निर्धारण किया गया. एलील विशिष्ट transcriptomes SNP विश्लेषण 8 के आधार पर उत्पन्न किया गया. पहले हम, WUSCHEL-homeobox 2, 8 और 9 (WOX2, WOX8, WOX9) और actin 11 (13,14, चित्रा 5A) भ्रूण विशेष टेप प्रवर्धित अनुक्रमण के लिए हमारे भ्रूण सीडीएनए पुस्तकालयों को नियंत्रित करने के लिए.

    इसके अतिरिक्त, इस विधि जीनोम में विशिष्ट loci में भ्रूण डीएनए मेथिलिकरण पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए युवा भ्रूण को अलग किया था. भ्रूण को अलग किया और 1x ते बफर में धोया गया. 9,15 वर्णित के रूप में छोटे पैमाने पर bisulfite अनुक्रमण प्रदर्शन किया गया था.

    इसी तरह, भ्रूण अलगाव कम भ्रूण अभिव्यक्ति के साथ पत्रकार जीन assays में बहुत उपयोगी साबित हुआ है, और मातृ बीज कोट का पता लगाने घालमेल कर दिया है या भ्रूण (एण्डोस्पर्म, बीज कोट) आसपास के ऊतकों में संवाददाता अभिव्यक्ति से छिपा हुआ है, जहां. भ्रूण कर्र (; गस एसएस glucuronidase) या सीधे (हरे या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन, GFP, आरएफपी) का विश्लेषण संवाददाता transgene यिंग दाग रहे अलगाव के बाद. एक उदाहरण MEDEA प्रमोटर (पी विदेश मंत्रालय) 10 के नियंत्रण के अधीन एक गस रिपोर्टर जीन व्यक्त भ्रूण के लिए चित्रा 5 ब में दी गई है. अपेक्षाकृत कई भ्रूण अलग किया जा सकता है जिसके साथ आसानी भी मात्रात्मक विश्लेषण (विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि, Raissig, Grossniklaus एट अल में दाग भ्रूण जैसे संख्या. तैयारी में) के लिए अनुमति देता है.

    अंत में, हम सफलतापूर्वक स्वस्थानी संकरण (मछली) और स्लाइड पर एक्रिलामाइड पैड में एम्बेडेड पृथक भ्रूण में परमाणु संरचना का अध्ययन करने के लिए immunostaining तकनीक में फ्लोरोसेंट लागू. गुणसूत्रबिंदु दोहराता है और nucleolar आयोजन क्षेत्रों के खिलाफ जांच का उपयोग कर मछली का एक उदाहरण चित्रा 5C में दिखाया गया है.

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    चित्रा 1. भ्रूण अलगाव की प्रक्रिया का फ्लो चार्ट प्रोटोकॉल को तीन भागों में बांटा गया है: 1 - सामग्री तैयार करने के लिए, 2 - बीज विच्छेदन, 3 - भ्रूण अलगाव..

    चित्रा 2
    चित्रा 2. Microcapillary सुझाव दिए. करीब 100 माइक्रोन के एक चिकनी खोलने के साथ ए उच्च गुणवत्ता microcapillary सुझाव दिए. व्यापक खोलने और अनियमित समोच्च साथ ख निम्न गुणवत्ता वाले microcapillary सुझावों (उन सुझावों कोशिकाविज्ञान अनुप्रयोगों के लिए ही स्वीकार्य हैं). स्केल पट्टी: 2 मिमी.

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    चित्रा 3. भ्रूण अलगाव खुर्दबीन के सेट करें. ए और बी स्क्रीनिंग एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत खुर्दबीन स्लाइड पर किया जाता है. भ्रूण microcapillary ठीक अपनी स्थिति को नियंत्रित करने के लिए एक micromanipulator पर तय (चित्रा 4 भी देखें) और एक microinjector (ए) या ​​मानक प्रयोगशाला विंदुक (बी) या तो से जुड़े एक कांच का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं. ए microcapillary गिलास एक हाइड्रॉलिक नियंत्रित करने के लिए जुड़ा हुआ है भ्रूण संग्रह बी दौरान एक सटीक नियंत्रण microcapillary कांच के लिए microinjector (जैसे Eppendorf सेल ट्राम Vario) एक रबर फ्लेक्स ट्यूब के माध्यम से एक मानक पी 200 पिपेट से जुड़ा हुआ है. भ्रूण संग्रह और रिहाई पिपेट की अंशांकन पहिया बदल द्वारा नियंत्रित किया जाता है. कट अंत विंदुक युक्तियाँ कनेक्टर्स के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं और जंक्शनों parafilm के साथ सील कर रहे हैं. मीलcrocapillary पॉलीस्टीरिन ब्लॉक, फाल्कन ट्यूबों और टेप के माध्यम से micromanipulator पर तय हो गई है.

    चित्रा 4
    4 चित्रा. भ्रूण अलगाव की प्रक्रिया. ए ए 2-4 सेल भ्रूण (तीर) बीज निकालने (स्क्रीनिंग छोटी बूंद) में पहचान की थी और मलबे (बीज कोट टुकड़े) से घिरा हुआ है. आसपास मलबा एक सुई का उपयोग करते हुए मैन्युअल बी हटा दिया गया था. सी. केशिका गिलास सही भ्रूण (तीर) के पास ले जाया गया था. डी. भ्रूण एकत्र और washes के बाद पिछले ड्रॉप में केशिका (तीर). ई. कई भ्रूण के भीतर अब हो गया है. स्केल = 50 माइक्रोन.

    चित्रा 5
    एफ igure 5. भ्रूण अलगाव के बहाव के अनुप्रयोगों ए जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण:. पीसीआर WOX9, WOX2, WOX8 के प्रवर्धन और 2-4 सेल भ्रूण से सीडीएनए पुस्तकालयों पर ACTIN11 13,14 (8 वर्णित के रूप में उत्पन्न) 1x बार धोया (1 लेन) और जीनोमिक पर . डीएनए (2 लेन) बी रिपोर्टर परख:. एपी विदेश मंत्रालय :: गस निर्माण एक मानक गस धुंधला समाधान में एक स्लाइड (से अनुमति के बाद Raissig एट अल, 2011 से reproduced पर दाग था ले जाने के पौधों से अलग एक 8 सेल भ्रूण संयंत्र सेल, ASPB कॉपीराइट). सी. फ्लोरोसेंट में स्वस्थानी संकरण (मछली): एक 8 सेल भ्रूण centromeric दोहराता (लाल), और अप्रत्यक्ष immunodetection 16 से पहले 45S rDNA दोहराता (हरा) के खिलाफ जांच के साथ संकरित किया गया था. दोहरी रंग मछली छवियों DAPI counterstaining और डीआईसी छवियों (DM6000B epifluorescence माइक्रोस्कोप, Leica, जर्मनी) के साथ मढ़ा गया.

    सामग्री "के लिए: रखने together.within पृष्ठ =" हमेशा ">
    आवेदन अलगाव बफर गंतव्य बफर
    शाही सेना निकासी (प्रवर्धन और transcriptomics के लिए उदाहरण के लिए) 1x पहली किनारा बफर (Invitrogen), 1 मिमी डीटीटी, 4% RNAseOUT शाही सेना निष्कर्षण बफर
    डीएनए निष्कर्षण (bisulfite अनुक्रमण के लिए उदाहरण के लिए) 100 मिमी Tris, 10 मिमी EDTA, पीएच 8 (ते) डीएनए निष्कर्षण बफर या 1x ते बफर
    GFP संवाददाता विश्लेषण 0.5x में 1 एम Glycin एमएस 1 0.5x एमएस में 1 एम Glycin
    गस संवाददाता विश्लेषण एक्स gluc (सब्सट्रेट) के बिना बफर 2 धुंधला हो जाना एक्स gluc (सब्सट्रेट) के साथ धुंधला बफर
    मछली और Immunostaining 100 मिमी फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) सक्रिय Acryl: 30 मिनट के लिए एक Superfrost प्लस स्लाइड भाजन पर Bisacryl मिश्रण (33:3)

    तालिका 1. अलग बहाव के अनुप्रयोगों के लिए अलगाव और गंतव्य बफ़र्स. बफ़र्स विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. 1 Murashig और मध्यम Skoog. 2 जैसे जेफरसन एट अल., EMBO जे 6 (13), 3901-3907 (1987).

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    Discussion

    हम प्रभावी, तेजी से है कि एक भ्रूण अलगाव प्रोटोकॉल विकसित की है, और आसानी से अन्य प्रयोगशालाओं में स्थानांतरित किया जा सकता है.

    यहाँ वर्णित उपकरण एक औंधा माइक्रोस्कोप, एक micromanipulator, कांच microcapillaries, एक खड़ी रेशा खींचने और एक microinjector (चित्रा 3) के होते हैं. सेटअप transcriptomics विश्लेषण 17 के लिए एक जानवर सेल अलगाव के लिए वर्णित एक के समान है. हम भी सफलतापूर्वक कांच microcapillaries स्वयं एक लौ पर फैला (और एक हीरे की ब्लेड से काट) और बजाय एक microinjector का एक मानक प्रयोगशाला विंदुक (Pipetman पी -200) (3B चित्रा) के माध्यम से संचालित किया गया जहां एक और अधिक बुनियादी सेटअप के साथ काम किया. उस मामले में microcapillary एक रबर ट्यूब के माध्यम से विंदुक से जुड़ा था. 10 μl filtertips उन्हें हवा तंग करने के लिए parafilm के साथ लिपटे थे जो जंक्शनों, बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया. केशिका - पिपेट टिप द्वारा आयोजित - माइकर पर तय की गई थीपॉलीस्टीरिन ब्लॉक और टेप का उपयोग omanipulator हाथ (3B चित्रा). इस बुनियादी सेटअप 8 कुशल और विश्वसनीय साबित हुई. फिर भी, मुख्य कठिनाइयों का एक केशिका बदल रहा है, खासकर जब microcapillary और विंदुक के बीच हवा तंग जंक्शनों को बनाए रखने था. सत्यापित किया जा रहा है और केशिका में दबाव एडजस्ट - एक न्यूनतम मात्रा में एक ठीक tuned भ्रूण संग्रह सुनिश्चित करने के लिए - इस बुनियादी सेटअप का उपयोग कर समय लेने वाली हो सकती है. एक हाइड्रॉलिक नियंत्रित micromanipulator और एक ऊर्ध्वाधर रेशा खींचने के साथ सुधार सेटअप काफी सुधार है और समय की बचत होती है.

    इस विधि के सफल आवेदन के लिए आवश्यक कौशल आसानी से हस्तांतरणीय हैं. हमारी प्रयोगशाला में पांच उपयोगकर्ताओं को सफलतापूर्वक एक अपेक्षाकृत कम समय में विधि सीखा. प्रोटोकॉल के कुछ सरलीकरण संभव जोड़ - तोड़ में उपयोगकर्ता आसानी पर निर्भर कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, यह कदम 2.2.5 और 2.2.6 जबकि छोड़ करने के लिए संभव हैकेवल 5 siliques (बजाय 15 के) विदारक और एक टंगस्टन सुई (इस प्रक्रिया 8 में लागू किया गया था) के साथ मलबे से अच्छी तरह से भ्रूण वातावरण की सफाई. निर्बलता और देरी परागण के माध्यम से बीज विकास की सिंक्रोनाइझेशन ऐच्छिक है, लेकिन विशेष रूप से प्रारंभिक दौर में, एक ही विकास के चरण में भ्रूण की संख्या में वृद्धि करने की सिफारिश की. धोने कदम लोप कर रहे हैं इसके अलावा, अगर भ्रूण अलगाव कोशिकाविज्ञान अनुप्रयोगों के लिए जैसे, तेजी लाई जा सकती है. इसके अलावा, स्लाइड siliconization (कदम 1.3.2) जल्दी से काम कर रहे उपयोगकर्ताओं के लिए समय के साथ कांच की सतह से चिपके रहते हैं, जो कि इस तरह के भ्रूण को एक समस्या नहीं है आवश्यक नहीं है.

    फ़िल्टरिंग या मैनुअल सफाई लागू होता है या नहीं, यह नीचे की ओर शाही सेना या डीएनए अनुप्रयोगों के लिए संभावित प्रदूषण पैदा करता है कि ऊतक मलबे से ले जाने से बचने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है. इस मुद्दे भ्रूण अलगाव का एक अलग पद्धति का उपयोग करके एक transcriptome की रूपरेखा अध्ययन में हाल ही में उठाया गया था18. यहाँ वर्णित थोक भ्रूण अलगाव प्रोटोकॉल के विपरीत, लेखकों ठीक सुइयों, उत्कृष्ट विच्छेदन कौशल की आवश्यकता होती है एक लंबी प्रक्रिया का उपयोग कर मैन्युअल व्यक्ति बीज के भीतर से Arabidopsis भ्रूण विच्छेदित. यह प्रक्रिया जाहिरा तौर पर भ्रूण विच्छेदन सुइयों के साथ उन तक पहुँचने में कठिनाई का छोटे आकार दिया इस पद्धति का उपयोग करते समय आसपास के बीज ऊतक, संभावना का सामना करना पड़ा एक स्थिति से संभव contaminating कोशिकाओं के ले जाने से बचने के लिए 2 या अधिक washes के लिए आवश्यक है, और चिपचिपाहट आसपास की कोशिकाओं की. इसके विपरीत, हमारी प्रक्रिया चिपकने से रहित भ्रूण (ii) दृश्य चयन कुचल और भ्रूण संग्रह से पहले एक बड़ी मात्रा में (500 μl) में मलबा आसपास पर बीज से भ्रूण-extruded (i) कमजोर पड़ने, दूषित करने की अनुमति देता है मलबे, और संभव आरएनए धोने कदम कोशिकाओं से उठी से प्रदूषण लीक (iii) कमजोर पड़ने. यह केवल एक धोने कदम अगर उपयोग करने के लिए संभव हैभ्रूण बहुत साफ दिखाई देते हैं और कम से कम 5 μl 8 में एकत्र कर रहे हैं, एक दूसरे धोने कदम विशेष रूप से (additive के मात्रा के साथ) अर्थात् कई दौर में भ्रूण एकत्र कर सकते हैं कि पहली बार उपयोगकर्ताओं के लिए सिफारिश की है. भ्रूण हर धोने के कदम में संभावित दूषित पदार्थों का अधिक से अधिक कमजोर पड़ने की अनुमति, संभव के रूप में छोटे समाधान के रूप में एकत्र किया जाना चाहिए. प्रत्येक एकत्रित दौर धोने ड्रॉप (केशिका में अब उपस्थिति वसूली दर को कम करने के लिए जाता है) में रिहाई पर अधिकतम वसूली की अनुमति (5-10 मिनट के भीतर) कम रखा जाना चाहिए. इस रूप में अच्छी तरह से मलबा ऊपर microcapillary दीवार पर चिपके हुए स्थानांतरण हो सकता है के रूप में इसके अलावा, निकासी मध्यम (धोने कदम के बाद) में एकत्र भ्रूण के हस्तांतरण ही, microcapillary टिप के उद्घाटन और टिप के नहीं विसर्जन के साथ एक संपर्क को शामिल करना चाहिए उद्घाटन. अंत में, केशिका प्रत्येक नए बीज निकालने के बीच परिवर्तित किया जाना चाहिए.

    हमारे प्रोटोकॉल कई चढ़ाव के लिए अनुमति देता हैबस आरएनए, डीएनए, क्रोमेटिन, एंजाइम या फ्लोरोसेंट संवाददाता के आणविक अखंडता की रक्षा है कि एक उचित अलगाव बफर का उपयोग करके tream अनुप्रयोगों. हम सफलतापूर्वक शाही सेना निकासी और transcriptomics विश्लेषण 8, 1x डीएनए मेथिलिकरण विश्लेषण के लिए ते बफर 9, 100 मिमी फॉस्फेट (Jaenisch, Grossniklaus और Baroux, अप्रकाशित, चित्रा मछली और immunostaining के लिए खारा (पीबीएस) buffered के लिए शाही सेना सुरक्षात्मक अलगाव बफर में भ्रूण अलग गस संवाददाता assays के (19, चित्रा 5 ब) के लिए सब्सट्रेट बिना 5C), और धुंधला समाधान. अलगाव की स्थिति / भ्रूण गुणवत्ता के लिए सबसे संवेदनशील अनुप्रयोग निश्चित रूप से निष्कर्षण और प्रवर्धन शाही सेना है. पृथक भ्रूण से निकाले शाही सेना की मात्रा काफी कम था. ~ से 2-4 सेल चरण में 30 भ्रूण (कुल में इस प्रकार 60-120 कोशिकाओं) हम दोनों Agilent 2100 Bioanalyzer (टेक्नोलॉजीज) और qubit (Invitrogen) के माप के आधार पर कुल शाही सेना के ~ 1ng की राशि का अनुमान है. Followiएनजी शाही सेना निकासी, शाही सेना गुणवत्ता एक Agilent शाही सेना 6000 पिको चिप (टेक्नोलॉजीज) पर सत्यापित किया गया था. हालांकि, निकाले शाही सेना के कम राशि हमेशा एक विश्वसनीय प्रोफाइल का निर्माण करने के लिए पर्याप्त नहीं है. इस प्रकार, आगे परीक्षण प्रवर्धित सामग्री (सीडीएनए) (जैसे पीसीआर कम व्यक्त, भ्रूण विशेष जीन और / या एक Bioanalyzer प्रोफाइल का पता लगाने) पर किया जाना चाहिए.

    अंत में, हमारे प्रोटोकॉल में दृश्य मापदंड से भ्रूण को अलग करने की क्षमता एक बड़ी संपत्ति है. एक ही Silique (Arabidopsis फल) से भ्रूण तुल्यकालिक विकसित नहीं है. इस प्रकार, पूरे Silique अर्क (RT-पीसीआर विश्लेषण या मात्रात्मक संवाददाता assays के लिए उदाहरण के लिए) पर काम कर रहे एक दिया विकास मंच के साथ एक सही संबंध को अनुमति नहीं है. एक विशिष्ट विकास के चरण में भ्रूण को अलग करने से इस समस्या को हल करती है. Siliques अलग भ्रूण जीनोटाइप होते हैं जहां विषमयुग्मजी म्यूटेंट के साथ कार्य करते समय इसके अलावा, एक ऐसी ही समस्या प्रस्तुत करता है. घ दृश्य मानदंडों के आधार पर भ्रूण अलगउत्परिवर्ती भ्रूण phenotypes से जंगली प्रकार जैसे istinguish जीनोटाइप के साथ नीचे की ओर विश्लेषण correlating की अनुमति देता है. हम अलग जीनोटाइप 20 में विशिष्ट loci में डीएनए मेथिलिकरण का विश्लेषण करने के लिए सफलतापूर्वक इस किया है.

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    Disclosures

    लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

    Acknowledgments

    हम भ्रूण अलगाव पर उनकी सलाह के लिए ताल Nawy और मार्टिन बायर को धन्यवाद देना चाहूंगा. एमटीआर, वी.जी., यूजी और सीबी भ्रूण अलगाव उपकरण तैयार कर लिया. एमटीआर, वी.जी. और सीबी भ्रूण अलगाव प्रोटोकॉल विकसित की है. एमटीआर, वी.जी. और सीबी, प्रोटोकॉल स्थापित भ्रूण अलग, और उत्पन्न भ्रूण सीडीएनए, वी.जी. पीसीआर, एमटीआर गस धुंधला, जे जे मछली प्रयोगों का प्रदर्शन किया. एमटीआर, वी.जी., तटरक्षक और यूजी पांडुलिपि लिखा था. इस काम के ज्यूरिख विश्वविद्यालय, रॉश रिसर्च फाउंडेशन (एमटीआर के लिए) की एक फैलोशिप, और स्विस नेशनल फाउंडेशन (यूजी और सीबी) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    REAGENTS
    Sigmacote SIGMA SL2-100 ml
    RNAse OUT Invitrogen (life technologies) 10777-019
    First- strand buffer Invitrogen (life technologies) 18064-022 contained in Superscript II package
    DTT Invitrogen (life technologies) 18064-022 contained in Superscript II package
    Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml New England Biolabs Inc. Different suppliers will also work
    Thin wall Capillaries 1.0 mm World Precision Instruments TW100F-4
    DNA LoBind tube 0.5 ml Vaudaux-Eppendorf 0030108.035
    CellTricsΔ 30 μm PARTEC 04-0042-2316
    5wells 10 mm diameter slides Electron Microscopy Sciences 63421-10
    Formaldehyde Solution Sigma-Aldrich F1635
    Superfrost Plus slide Thermo Fisher J1800AMNZ Menzel-Gläser
    Tris Amaresco 0497
    EDTA Applichem A2937
    Glycin Fluka 50050
    SDS pellets Roth CN30.3
    Micro Pestle VWR 431-0094
    Microfine insulin syringes BD U-100
    DEPC Sigma-Aldrich D5758
    Ethanol Schaurlau ET00102500
    Forceps N5 Dumont 0108-5
    Bioanalyzer Pico Chip Agilent Technologies 5067-1513
    EQUIPMENT
    Inverted microscope Nikon TMS (Japan),
    Micromanipulator Leitz Leica
    Micomanipulator Post mount LH1 probe Leica microsystems 39430101 Different brand will also do the work
    Vertical filament puller Sutter instrument P-20 model Other model are also suitable
    Cell Tram vario Vaudaux-Eppendorf 5176.000.033
    Bioanalyzer Agilent Technologies 2100
    Qubit Fluorometer Invitrogen (life technologies

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    References

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    प्लांट बायोलॉजी अंक 76 सेलुलर जीवविज्ञान विकास जीवविज्ञान आण्विक जीव विज्ञान जेनेटिक्स भ्रूणविज्ञान भ्रूण अलगाव, आरएनए प्रवर्धन transcriptomics डीएनए मेथिलिकरण रूपरेखा मछली संवाददाता assays के
    से प्रारंभिक चरण भ्रूण के कुशल और तेजी से अलगाव<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; बीज
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    Raissig, M. T., Gagliardini, V., Jaenisch, J., Grossniklaus, U., Baroux, C. Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds. J. Vis. Exp. (76), e50371, doi:10.3791/50371 (2013).

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