Summary
Nós relatamos um método eficiente e simples para isolar os embriões em estágios iniciais de desenvolvimento de
Abstract
Em plantas com flores, o embrião se desenvolve dentro de um tecido nutritivo - o endosperma - cercado pelos tegumentos de sementes maternas (ou tegumento). Como consequência, o isolamento de embriões de plantas em fases iniciais (1 célula para a fase globular) é tecnicamente difícil devido à sua relativa inacessibilidade. Dissecção Manual eficiente em fases iniciais é fortemente prejudicada devido ao pequeno tamanho dos jovens de sementes de Arabidopsis e a adesividade do embrião para os tecidos circundantes. Aqui, nós descrevemos um método que permite o isolamento eficiente de embriões jovens de Arabidopsis, originando até 40 embriões em 1 hora e 4 horas, dependendo da aplicação a jusante. Os embriões são libertados no tampão de isolamento por esmagamento ligeiramente 250-750 sementes com um pilão de plástico num tubo Eppendorf. Um copo microcapilar ligado a qualquer uma pipeta padrão de laboratório (através de um tubo de borracha) ou de um microinjetor controlada hidraulicamente é usado para coletar embriões de lugar gotículasd numa lâmina de multi-poços em um microscópio óptico invertido. As competências técnicas necessárias são simples e facilmente transferível, ea configuração básica não requer equipamento caro. Os embriões recolhidos são apropriados para uma variedade de aplicações a jusante, tais como RT-PCR, o RNA de sequenciação, análise de metilação de ADN, hibridação in situ fluorescente (FISH), a imunocoloração, e ensaios de gene repórter.
Introduction
O embrião de plantas floridas está rodeado pelo endosperma, um tecido nutritivo derivado de um segundo evento de fertilização. Ambos embrião e endosperma está cercado por várias camadas de células do tegumento. Colectivamente estes tecidos formar uma semente, que se desenvolvem no interior do fruto. Assim, tecidos e análises específicas de células de embriões de Arabidopsis são fortemente prejudicada devido a sua inacessibilidade. No entanto, os embriões nas fases de fim de globulares ou mais tarde, são relativamente bem passível de dissecção manual utilizando agulhas finas de tungstênio sob o microscópio estereoscópico, ou com uma ligeira pressão sobre a semente, usando uma pinça para extraí-los. Tais técnicas foram utilizadas com sucesso para transcriptoma ou análises de perfis epigenoma como hibridização microarray, sequenciamento bissulfito, ou RNA seqüência (por exemplo, 1-3). Em contraste, os estudos de embriões no zigoto até a fase globular cedo permanecem tecnicamente desafiador. Até o momento, poucos estudos têm repanálises de transcriptoma orted sobre jovens embriões usando tanto microdissection de captura a laser (LCM) de tecidos embrionários de sementes seções fixas quatro ou extração manual dos embriões individuais a partir de sementes, utilizando ferramentas finas 5. No entanto, o equipamento GCV não é vulgarmente disponíveis e extracção manual do embrião em fases iniciais é demorado e que exige excelentes capacidades de dissecação que não são facilmente transferíveis. Em adição à análise de todo o genoma, em análises de expressão de genes in situ também são difíceis de executar em jovens, conjunto de montagem em embriões de Arabidopsis. Em certa medida, os embriões jovens pode ser libertado em lâminas de microscópio por uma suave pressão sobre as sementes e utilizada para os ensaios de gene repórter ou de detecção de proteínas por coloração imunológica (por exemplo, ver 6,7). Esta técnica, no entanto, não permitir o isolamento de embriões de alto rendimento, impedindo assim as análises quantitativas.
Por isso, desenvolvemos um protocolo eficiente e rápidapara o isolamento de embrião a partir de sementes de Arabidopsis que é simples de configurar, facilmente transferíveis, e apropriado para uma variedade de aplicações a jusante. O princípio básico consiste em triturar suavemente sementes - dissecada jovens siliques em um tubo Eppendorf utilizando um pilão de plástico num tampão de isolamento adequado. O extracto de semente é colocada em gotas sobre uma lâmina de multi-poços e é pesquisado quanto à presença de embriões libertados na fase desejada usando um microscópio invertido. Os embriões são coletados por meio de um vidro microcapilar ligado a um microinjetor ou uma pipeta de laboratório padrão. Para aplicações moleculares, os embriões são lavados duas vezes por libertação repetida em gotas de novo tampão de isolamento antes de transferi-los para o buffer de destino num volume mínimo. Para aplicações citológicos (ensaios repórter, positividade, peixe), as etapas de lavagem pode ser omitido.
O método oferece várias vantagens: (i) produz 25-40 embriões em ~ 45 min para aplicação citológicocações ou em 3-4 hr para aplicações moleculares (incluindo as etapas de lavagem), (ii) que permite o isolamento de estágios embrionários específicas, (iii) é facilmente transferível para outras pessoas e laboratórios, devido à sua configuração simples, (iv) requer equipamento acessível para a configuração básica, que é passível de upgrades, e (v) foi usado com sucesso por várias aplicações a jusante, como RNA seqüenciamento 8, a análise de DNA-metilação-específica gene 9, ensaios repórter (10 e Raissig et al., em prep.) e FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux inédito, ver Figura 5).
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Protocol
O procedimento está resumido no diagrama de fluxo mostrado na Figura 1. O microcapilares e a configuração instrumentais são apresentados na Figura 2 e Figura 3, e os passos típicos de isolamento de embriões são mostrados na Figura 4.
1. Material e Preparação de buffer
1,1 Silício revestimento de vidro microcapilares
- Coloque a microcapilares em um tubo Falcon de 15 ml com ~ 5 ml de Sigmacote (Sigma) e gire várias vezes.
- Remover a solução, colocar um tubo Falcon contendo os capilares numa folha de alumínio e cozer durante 3 horas a 60 ° C. Guarde à temperatura ambiente.
1.2 Obter ~ 50-100 micrometros de diâmetro dicas microcapilares
- Puxe um milímetro de diâmetro capilares de vidro manualmente ao longo de um bico de Bunsen ou usando um extrator comercial (vertical puxador de filamento ou micropipeta extrator).
- Use um diamantecaneta de ponta ou lâmina para cortar a extremidade do capilar puxado para criar a abertura desejada. Selecione a melhor forma de capilares sob um microscópio estéreo. A abertura deve ser de 50-100 mM (Figura 2).
1.3 Preparação da lâmina
- Siliconize lâminas limpas, cobrindo todos os poços com Sigmacote (~ 1 ml / lâmina), durante 5 minutos, remover. Asse 3 hr em papel alumínio. Guarde à temperatura ambiente.
- Lavar os múltiplos poços lâminas microscópicas de vidro durante 10 min em SDS a 10%, 2 x 2 minutos em água livre de nuclease (autoclavado DEPC ddH2O), 2 min em etanol a 70%, 2 minutos em etanol a 100%, com ar- secar. Todas as etapas são feitas em frascos autoclavados Coplin. As lâminas podem ser reutilizados várias vezes proporcionando limpeza completa entre cada uso.
- Pouco antes do isolamento propagação embrião ~ 0,5 l de 10 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA), com uma pipeta ao longo de toda a superfície de cada poço e ar seco.
1.4 Microscópio e configuração capilar
<ol>1,5 Buffers
A Tabela 1 lista os buffers de isolamento e de destino, dependendo das aplicações a jusante.
- Prepare ~ 1 ml de tampão de isolamento por amostra imediatamente antes da utilização e mantenha-o no gelo.
- Prepare o buffer de destino em um ml tubo de baixa ligação 0,5 Eppendorf no gelo (aplicações moleculares) ou em uma lâmina de microscópio (aplicações citológicas) em uma câmara úmida.
2. Dissecção sementes e extração de embriões
2.1 Sincronização de desenvolvimento da semente
- Emasculate flores e mantê-los 2 dias em câmara de crescimento, evitando o contacto dos pistilos expostas com outras flores, então polinizar deles (por exemplo, 11).
- Teste o estágio de desenvolvimento em suas condições de crescimento por meio de investigação microscópica de sementes limpas. Com as nossas condições de crescimento (16 horas de luz a 21 ° C, 8 horas escuro, a 18 ° C e 70% de humidade), as sementes recolhidas 2,5 dias após a polinização (DAP) rendeu principalmente 2-4 embriões de células e as sementes colhidas 3,5-4 DAP rendeu globular embriões.
2.2 Dissecção de Sementes e Rupture
- Remover a sEEDS 10-15 siliques (~ 2,5 DAP) sob um microscópio estereoscópico com uma pinça e agulhas de insulina.
- Mergulhar as sementes em 20 ul de tampão de isolamento, em 2 ml de um tubo de fundo redondo de Eppendorf colocada em gelo.
- Suavemente esmagar as sementes com um pilão de plástico (pré-lavado com 10% de SDS, enxaguado com DEPC ddH2O e lavou-se com etanol a 70%) para libertar os embriões até o extracto de semente é turvo. A força a aplicar é determinada pelo utilizador, a cada ensaio.
- Lavar o almofariz com 300 ul de tampão de isolamento para lavar o pilão e diluir a amostra.
- Spin-se o extrato a 5.000 xg por 5 seg. Delicadamente ressuspender o extrato sedimentados por pipetagem cima e para baixo 2-3 vezes.
- Filtrar o extracto com uma malha de nylon de 30 um (montado em adaptadores de tubos, por exemplo, a partir de PartecCelltricks). Lavar a malha com um tampão de isolamento adicional de 200 ul.
3. Isolamento embrião
3.1 Preparação da lâmina
- <li> Coloque um pano limpo, multi-slides bem BSA-revestido e siliconizada no palco do microscópio invertido, ressuspender o extrato de semente de filtrada com cuidado pipetando cima e para baixo e pipetar 2 gotas de extrato de semente de 40-50 mL em um ou dois poços . Screening apenas 1 ou 2 gotas de cada vez evita a evaporação da amostra.
- Transferem-se 50 ul de tampão de isolamento fresco (1 gota de lavagem r) num poço de uma lâmina diferente preparada como antes. Manter este slide em uma coberta, câmara úmida para evitar a evaporação.
3.2 tela, limpar, recolher
- Tela de gotas de extrato de semente de embriões no estágio desejado com o objetivo de ampliação de 10x. Se necessário, confirmar o palco com a ampliação de 20x. Os embriões geralmente descem para o fundo do slide.
- Remover manualmente os restos em torno do embrião com uma agulha de tungstênio, uma agulha de insulina ou equipamento similar.
- Mover o vidro capilar próximo do embrião utilizando o micromanipulador, take-se o embrião com tão pouco quanto possível solução.
- Colete vários embriões (por exemplo, todos uma gota) e liberá-los no gota de lavagem 1 º (aplicação molecular) ou no buffer de destino (aplicações citológicos). Cada rodada coleta deve ser mantido dentro de 5-10 min e embriões devem ser coletadas em um volume mínimo (o volume total de todas as rodadas de coleta deve ser <5 mL).
- Repita a triagem e recolha até a quantidade desejada de embriões é recolhida no r gota uma lavagem (centralmente, se possível, para facilitar a recordação).
- Recordar todos os embriões de uma só vez a partir da queda de lavagem (se os restos são transportados, retire-os com uma agulha antes de recordação).
- Solte os embriões em uma gota de lavagem 2 º de 50 l. Repita 3.2.6.
- Solte os embriões no buffer de destino. A transferência deve envolver apenas um contato, e não de imersão, da ponta do capilar.
- Substitua o microcapilLary para a próxima amostra.
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Representative Results
O processo de isolamento do embrião (Figura 1) permite o isolamento de até 40 embriões em 4 horas, se as lavagens são realizadas, por exemplo, para aplicações moleculares, ou em menos de uma hora, se as lavagens são omitidos, por exemplo, para aplicações citológicos. Figura 2 exibe alta e baixa dicas microcapilares qualidade e A Figura 3 mostra a configuração da máquina de isolamento do embrião. Figura 4 mostra o processo de isolamento do embrião no microscópio invertido.
Realizamos com sucesso o nosso procedimento para várias aplicações publicadas em vários artigos recentes. O método foi originalmente desenvolvido para analisar a contribuição dos pais para o transcriptoma embrionária precoce. Embriões híbridos gerados através de cruzamentos entre dois diferentes acessos de Arabidopsis (Landsberg erecta (L er) e Columbia (Col-0)) foram isolados no estágio de célula 2-4. O RNA total foi extraído de cDNAbibliotecas foram produzidas usando a amplificação linear e sequenciado numa plataforma sólida. Os transcriptomas específicas de alelo foram gerados com base na análise de SNP 8. Para controlar as nossas bibliotecas de cDNA embrionárias antes de seqüenciamento foi amplificado transcritos específicos-embrião, Wuschel-homeobox 2, 8 e 9 (WOX2, WOX8, WOX9) e actina 11 (13,14, Figura 5A).
Adicionalmente, este método foi utilizado para isolar os embriões jovens para analisar os padrões de metilação do ADN-embrionárias em loci específicos no genoma. Os embriões foram isoladas e lavadas em 1x tampão TE. Bissulfito de sequenciação em pequena escala foi realizada conforme descrito 9,15.
Da mesma forma, o isolamento do embrião tem provado ser muito úteis em ensaios de gene repórter com baixa expressão embrionária, e onde o revestimento de semente materna confunde detecção ou é mascarado pela expressão repórter, nos tecidos circundantes do embrião (endosperma, revestimento das sementes). Embriões carr ying o transgene repórter estão manchadas (ß-glucuronidase, GUS) ou diretamente analisado (verde ou vermelho proteína fluorescente, GFP, RFP), após o isolamento. Um exemplo é apresentado na Figura 5B para os embriões que expressam um gene repórter GUS sob o controlo do promotor MEDEA (p MEA) 10. A relativa facilidade com que muitos embriões pode ser isolada também permite análises quantitativas (por exemplo, número de embriões coradas em diferentes origens genéticas, Raissig, Grossniklaus et al., Em preparação).
Finalmente, foi aplicado com sucesso hibridização in situ fluorescente (FISH) e técnicas de imunocoloração para estudar a arquitectura nuclear em embriões isolados incorporado em pastilhas de acrilamida em lâminas. Um exemplo de FISH utilizando sondas contra as repetições de centrómero e regiões organizadoras de nucléolos é mostrado na Figura 5C.
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Figura 1. Fluxograma do procedimento de isolamento do embrião O protocolo é dividido em três partes: 1 - Preparação do material; 2 - Dissecção Semente; 3 - isolamento de embriões..
Figura 2. Dicas microcapilares. A. dicas microcapilares de alta qualidade com uma abertura suave de cerca de 100 mM. B. dicas microcapilares de baixa qualidade, com maior abertura e contorno irregular (essas dicas são aceitáveis apenas para aplicações citológicos). Barra de escala: 2 mm.
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Figura 3. Configure o isolamento microscópio embrião. A. e B. A pesquisa é feita em lâminas de microscópio sob um microscópio invertido. Os embriões são obtidos utilizando um microcapilar de vidro fixado com um micromanipulador para controlar com precisão a sua posição (ver também a Figura 4) e ligado a qualquer um microinjector (A) ou pipeta padrão de laboratório (B). A. O vidro microcapilar está ligada a um comando hidráulico microinjector (ex. Eppendorf celular Bonde Vario) para um controlo preciso durante o embrião colecção B. O vidro microcapilar está ligada a um padrão de P-200 pipeta através de um tubo flexível de borracha. De colheita de embriões e liberação controlada girando a roda de calibração da pipeta. Ponteiras Cut-end são usados como conectores e as junções são selados com parafilme. A microcapillary está fixada no micromanipulador via blocos de poliestireno, tubos Falcon e fita.
Figura 4. Processo de isolamento do embrião. A. Um embrião de 2-4 células (seta) foi identificada em extracto de semente (gotícula de rastreio) e é rodeado por detritos (fragmentos de revestimento de semente). B. Os detritos circundante foi retirado manualmente, utilizando uma agulha. C. O capilar de vidro, foi transferida ao lado do embrião (seta). D. O embrião foi recolhido e agora está dentro dos capilares (seta). E. vários embriões na última gota após lavagens. Escala = 50 um.
F igura 5. Aplicações a jusante do isolamento embrião A. análises de expressão gênica:. PCR de amplificação de WOX9, WOX2, WOX8 e ACTIN11 13,14 em bibliotecas de cDNA (gerado como descrito 8) 2-4 células de embriões lavado 1x vezes (pista 1) e em genômica . DNA (segunda pista) B. ensaio Repórter: Um embrião de 8 células isoladas de plantas que transportam ap MEA construção :: GUS foi manchada em um slide em uma solução padrão de coloração GUS (reproduzido a partir de Raissig et al, 2011, após autorização do. Célula vegetal, ASPB copyright). C. fluorescente hibridização in-situ (FISH): um embrião de 8 células foi hibridizada com sondas contra repete centroméricas (vermelho) e 45S rDNA repete (verde) antes de imunodetecção indireto 16. As imagens PEIXES dual-cores foram sobrepostos com a contracoloração DAPI e imagens DIC (DM6000B microscópio de epifluorescência, Leica, Alemanha).
| Aplicação | Tampão de isolamento | Buffer de destino |
| Extração de RNA (por exemplo, para a amplificação e transcriptômica) | 1x tampão de primeira cadeia (Invitrogen), DTT 1 mM, 4% RNAseOUT | Tampão de extracção de ARN |
| Extração de DNA (por exemplo, para o seqüenciamento bissulfito) | 100 mM Tris, 10 mM de EDTA, pH 8 (TE) | Tampão de extracção de ADN ou 1x tampão TE |
| Análise repórter GFP | 1 M em 0,5 x MS Glycin 1 | 1 M Glycin em 0.5x MS |
| Análise repórter GUS | tampão sem coloração 2 X-Gluc (substrato) | coloração buffer com X-Gluc (substrato) |
| FISH & Imunocoloração | 100 mM tampão fosfato (PBS) | Acryl ativado: mix Bisacryl (33:3) em uma Superfrost Além disso slide-polimerizar por 30 min |
Tabela 1. Isolamento e destino buffers para diferentes aplicações a jusante. Os tampões podem ser adaptados a requisitos específicos experimentais. Murashig 1 & Skoog. Por exemplo 2 Jefferson et al. EMBO J. 6 (13), 3901-3907 (1987).
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Discussion
Foi desenvolvido um protocolo de isolamento do embrião, que é rápida, eficaz, e pode ser facilmente transferido para outros laboratórios.
O equipamento aqui descrito é composto por um microscópio invertido, um micromanipulador, vidro microcapilares, um puxador de filamento vertical e um microinjector (Figura 3A). A instalação é semelhante à descrita para o isolamento única célula animal para análises transcriptomics 17. Também trabalhou com sucesso com uma configuração mais básica onde o vidro microcapilares foram esticados manualmente sobre uma chama (e cortado com uma lâmina de diamante) e operado por meio de uma pipeta de laboratório padrão (Pipetman P-200), em vez de um microinjetor (Figura 3B). Nesse caso, o microcapilar foi anexado a pipeta através de um tubo de borracha. Filtros 10 ul foram usados para fazer as junções, que foram envolvidas com parafilme para torná-los hermético. O capilar - realizada pela ponteira - foi fixado no micrbraço omanipulator usando blocos de isopor e fita adesiva (Figura 3B). Esta configuração básica provou ser eficiente e confiável 8. No entanto, uma das principais dificuldades é a manutenção das junções herméticas entre a pipeta microcapilar e, especialmente quando se muda o capilar. Verificando e ajustando a pressão no capilar - para garantir uma colheita de embriões aperfeiçoá-lo em um volume mínimo - pode ser demorado usando esta configuração básica. A melhor configuração com um micromanipulador controlada hidraulicamente e um extrator de filamento vertical é uma melhoria considerável e economiza tempo.
As habilidades necessárias para o sucesso da aplicação deste método são facilmente transferíveis. Cinco usuários em nosso laboratório aprendeu com sucesso o método em um tempo relativamente curto. Algumas simplificações do protocolo são possíveis dependendo da vontade do usuário em manipulação. Por exemplo, é possível pular os passos 2.2.5 e 2.2.6, enquantodissecando apenas 5 siliques (em vez de 15) e de limpeza do ambiente do embrião completamente de detritos com uma agulha de tungsténio (este procedimento foi aplicado em 8). A sincronização através do desenvolvimento de sementes e polinização emasculação atrasada é facultativa, mas recomendado para aumentar o número de embriões na mesma fase de desenvolvimento, particularmente nas fases iniciais. Além disso, o isolamento do embrião pode ser acelerada se os passos de lavagem são omitidos, por exemplo, para aplicações citológicos. Além disso, a siliconização corrediça (passo 1.3.2) não é necessária para os utilizadores que trabalham de forma rápida, de tal modo que os embriões que aderem à superfície do vidro ao longo do tempo não é um problema.
Se a filtragem ou limpeza manual é aplicada, ela é extremamente importante para evitar a contaminação por restos de tecido que cria a contaminação potencial de RNA a jusante ou aplicações de DNA. Esta questão foi levantada recentemente em um estudo de perfil transcriptoma usando um método diferente de isolamento do embrião18. Em contraste com o protocolo de isolamento de embriões em massa aqui descritas, os autores dissecaram embriões Arabidopsis manualmente a partir de dentro as sementes individuais usando agulhas finas, um processo demorado que exige excelentes habilidades de dissecação. Este procedimento aparentemente necessário dois ou mais lavagens para evitar carry-over de possíveis células contaminantes do tecido circundante semente, uma situação que encontrou ao usar este método, dado o pequeno tamanho dos embriões, as dificuldades em acessá-las com agulhas de dissecação, ea adesividade das células circundantes. Em contraste, o nosso procedimento permite (i) diluição do embriões-extrudido a partir de sementes em cima de esmagamento e de detritos em torno de um grande volume (500 mL) antes de colheita de embriões, (ii) a selecção visual de embriões desprovidas de cola, contaminando detritos, e (iii) a diluição da possível contaminação de RNA-vazamento a partir de células-rompido pelos passos de lavagem. Embora seja possível utilizar apenas uma etapa de lavagem, se aembriões parecem muito limpo e são recolhidas em menos de 5 jul 8, uma segunda etapa de lavagem é recomendado, especialmente para usuários de primeira viagem que podem coletar os embriões em várias rodadas (ou seja, com o volume de aditivo). Os embriões devem ser recolhidas em solução tão pouco quanto possível, permitindo que a diluição máxima de potenciais contaminantes presentes em cada etapa de lavagem. Cada ronda recolha deve ser mantido curto (5-10 minutos), para permitir a máxima recuperação mediante libertação no gota de lavagem (mais presença no capilar tende a reduzir a taxa de recuperação). Além disso, a transferência dos embriões colhidos para o meio de extracção (de acordo com os passos de lavagem) deve envolver um contacto apenas com a abertura da ponta e não microcapilar imersão da ponta, tal como esta pode também transferir detritos furar na parede acima microcapilar a abertura. Finalmente, o capilar deve ser mudado entre cada extracto nova semente.
Nosso protocolo permite várias baixosaplicações tream simplesmente usando um buffer de isolamento apropriado que preservar a integridade molecular de RNA, DNA, cromatina, repórter enzima ou fluorescente. Nós isolado com sucesso embriões em tampão isolamento RNA de proteção para a extração de RNA e análise transcriptômica 8, 1x TE-tampão para as análises de metilação do DNA 9, fosfato 100 mM solução salina tamponada (PBS) por FISH e imuno (Jaenisch, Grossniklaus e Baroux, inédito, Figura 5C), e uma solução de coloração, sem substrato para ensaios de GUS reporter (19, Figura 5B). A aplicação a mais sensível às condições de isolamento / qualidade embrião é certamente extração de RNA e amplificação. A quantidade de RNA extraído a partir de embriões isolados foram bastante reduzidos. De ~ 30 embriões no estágio de célula 2-4 (MR 60-120 células no total) que estima um valor de ~ 1ng do total de RNA com base em ambos Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) e qubit medições (Invitrogen). Following extração de RNA, a qualidade do RNA foi verificada em um Agilent RNA 6000 Chip Pico (Agilent Technologies). No entanto, a baixa quantidade de ARN extraído nem sempre é suficiente para produzir um perfil de confiança. Assim, outros testes podem ser realizados com o material amplificado (cDNA) (por exemplo, detecção por PCR, genes específicos de embrião de baixo expressos e / ou um perfil de Bioanalyzer).
Finalmente, a capacidade de isolar os embriões por critérios visuais em nosso protocolo é um grande trunfo. Os embriões a partir do mesmo silique (frutos de Arabidopsis) não se desenvolvem de forma síncrona. Assim, o trabalho em extractos silique inteiro (por exemplo, para as análises de RT-PCR ou ensaios quantitativos repórter) não permite uma perfeita correlação com um determinado estado de desenvolvimento. Isolando embriões numa fase de desenvolvimento específico resolve este problema. Além disso, um problema semelhante apresenta-se quando trabalhando com os mutantes heterozigotos onde siliques contêm diferentes genótipos de embriões. Isolando embriões com base em critérios visuais para distinguish por exemplo, do tipo selvagem de fenótipos mutantes embrião permite correlacionar análises a jusante com o genótipo. Nós temos feito isso com sucesso para analisar a metilação do DNA em loci específicos em diferentes genótipos 20.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer Tal Nawy e Martin Bayer para os seus conselhos sobre o isolamento do embrião. MTR, VG, UG e CB inventou o equipamento de isolamento de embriões. MTR, VG e CB desenvolveu o protocolo de isolamento de embriões. MTR, VG e CB estabelecido o protocolo, isolado dos embriões, e embrião gerado cDNA, VG realizada a PCR, MTR a coloração GUS, JJ experimentos os peixes. MTR, VG, CG e UG escreveu o manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Universidade de Zurique, uma bolsa da Fundação Roche Research (a MTR), e doações da Fundação Nacional da Suíça (para UG e CB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies | ||
References
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