Aislamiento eficaz y rápida de los embriones en etapa temprana de<em> Arabidopsis thaliana</em> Semillas
Summary
Se presenta un método eficiente y simple para aislar embriones en las primeras etapas de desarrollo desde<em> Arabidopsis thaliana</em> Semillas. Hasta 40 embriones se pueden aislar en 1 hora a 4 horas, dependiendo de la aplicación aguas abajo. El procedimiento es adecuado para transcriptoma, la metilación del ADN, la expresión del gen reportero, inmunotinción y fluorescencia<em> In situ</em> Análisis de hibridación.
Abstract
En las plantas con flores, el embrión se desarrolla dentro de un tejido nutritivo – el endospermo – rodeado por los tegumentos de semillas materna (o cubierta de la semilla). Como consecuencia de ello, el aislamiento de los embriones de la planta en las primeras etapas (1 celda a la etapa globular) es técnicamente difícil, debido a su relativa inaccesibilidad. La disección manual de eficiente en las primeras etapas está fuertemente afectada por el pequeño tamaño de jóvenes semillas de Arabidopsis y la adhesividad del embrión a los tejidos circundantes. Aquí, se describe un método que permite el aislamiento eficiente de pequeños embriones de Arabidopsis, un rendimiento de hasta 40 embriones en 1 hora a 4 horas, dependiendo de la aplicación aguas abajo. Los embriones se liberan en tampón de aislamiento por aplastamiento ligeramente 250-750 semillas con una mano de mortero de plástico en un tubo Eppendorf. Un vaso capilar se adjunta a una pipeta de laboratorio estándar (a través de un tubo de goma) o una microinyector mando hidráulico se utiliza para recoger los embriones de un lugar gotitasd en un portaobjetos de pocillos múltiples en un microscopio de luz invertida. Las habilidades técnicas requeridas son simples y fáciles de transferir, y la configuración básica no requiere de equipos costosos. Embriones recogidos son adecuados para una variedad de aplicaciones aguas abajo, tales como RT-PCR, secuenciación de ARN, análisis de metilación del ADN, hibridación fluorescente in situ (FISH), la inmunotinción, y ensayos de genes informadores.
Introduction
El embrión de plantas con flores está rodeado por el endosperma, un tejido nutritivo derivado de un segundo evento de la fertilización. Tanto el embrión y el endospermo están rodeadas por varias capas de células de la cubierta de la semilla. Colectivamente estos tejidos forman una semilla, que se desarrollan en el interior de la fruta. Por lo tanto, el tejido y los análisis específicos de células de embriones de Arabidopsis están fuertemente deteriorados por razón de su inaccesibilidad. Sin embargo, los embriones en las fases finales de globulares o temprano son relativamente susceptibles a la disección manual con el uso de agujas finas de tungsteno bajo el microscopio estereoscópico, o aplicando una ligera presión sobre la semilla utilizando pinzas para extraerlos. Tales técnicas se utilizaron con éxito para el análisis de perfiles de transcriptoma o epigenoma tales como microarrays de hibridación, secuenciación de bisulfito, o la secuencia de ARN (por ejemplo, 1-3). Por el contrario, los estudios de embriones en el cigoto a la etapa globular temprana siguen siendo un desafío técnico. Hasta la fecha, sólo unos pocos estudios han repanálisis de transcriptoma orted en embriones jóvenes que utilizan ya sea microdisección de captura por láser (LCM) de tejidos embrionarios de semillas secciones fijas 4 o extracción manual de los embriones individuales desde dentro de las semillas utilizando herramientas finas 5. Sin embargo, equipos de LCM no está comúnmente disponible y la extracción manual de embriones en las primeras etapas es mucho tiempo y que requiere excelentes habilidades de disección que no son fácilmente transferibles. Además de los análisis de todo el genoma, en el análisis de expresión génica in situ también son difíciles de realizar en los jóvenes, todo el montaje embriones de Arabidopsis. Hasta cierto punto, los embriones jóvenes pueden ser liberados en portaobjetos de microscopio por una suave presión sobre las semillas y se utilizan para ensayos de genes informadores o la detección de proteínas mediante inmunotinción (por ejemplo, véase 6,7). Esta técnica, sin embargo, no permite el aislamiento de embriones de alto rendimiento, lo que dificulta los análisis cuantitativos.
Por lo tanto, hemos desarrollado un protocolo eficiente y rápidapara el aislamiento del embrión a partir de semillas de Arabidopsis que es fácil de configurar, fácil de transferir, y adecuado para una variedad de aplicaciones posteriores. El principio básico es machacar suavemente las semillas – disecado de silicuas jóvenes en un tubo Eppendorf con una mano de mortero de plástico en un tampón de aislamiento adecuado. El extracto de la semilla se coloca en gotas sobre un portaobjetos de múltiples pocillos y se analiza para detectar la presencia de embriones liberados en la etapa deseada usando un microscopio invertido. Los embriones se recogieron usando un vaso capilar se une a un microinyector o una pipeta de laboratorio estándar. Para aplicaciones moleculares, los embriones se lavan dos veces por la liberación repetida en gotas de nuevo tampón de aislamiento antes de transferirlos a la memoria intermedia de destino en un volumen mínimo. Para aplicaciones citológicas (reportero ensayos, inmunotinción, pescado), etapas de lavado se pueden omitir.
El método ofrece varias ventajas: (i) que produce 25-40 embriones en ~ 45 min para aplicación citológicocaciones o en 3-4 horas para aplicaciones moleculares (incluyendo los pasos de lavado), (ii) que permite el aislamiento de las etapas embrionarias específicas, (iii) que es fácilmente transferible a otras personas y laboratorios debido a su configuración sencilla, (iv) requiere un equipo asequible para la configuración básica que es susceptible de mejoras, y (v) que se utilizó con éxito para diversas aplicaciones aguas abajo, tales como la secuenciación de ARN 8, el análisis de la metilación del ADN de genes específicos de 9, los ensayos de reportero (10 y Raissig et al., en prep.) y FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux inédita, ver Figura 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos desarrollado un protocolo de aislamiento embrión que es rápida, eficaz, y se puede transferir fácilmente a otros laboratorios.
El equipo descrito aquí consiste en un microscopio invertido, un micromanipulador, vidrio microcapilares, un extractor de filamento vertical y un microinyector (Figura 3A). La configuración es similar a la descrita para el aislamiento de células animales solo para los análisis de transcriptómica 17. También trabajamos con é…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a Tal Nawy y Martin Bayer por sus consejos sobre el aislamiento del embrión. MTR, VG, UG y CB idearon el equipo de aislamiento de embriones. MTR, VG y CB desarrollaron el protocolo de aislamiento de embrión. MTR, VG y CB establecen el protocolo, aislaron los embriones, y el embrión generado cDNA, VG realizó la PCR, MTR la tinción GUS, JJ experimentos de los peces. MTR, VG, CG UG y escribió el manuscrito. Este trabajo fue financiado por la Universidad de Zürich, una beca de la Fundación de Investigación de Roche (a MTR), y subvenciones de la Fundación Nacional de Suiza (a la UG y CB).
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies |
References
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