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Biology

Isolamento de microrganismos do solo nativas com potencial para romper as biodegradáveis ​​Palha filmes plásticos usados ​​na agricultura

Published: May 10, 2013 doi: 10.3791/50373
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 2, 2, 1
1Biology Department, Western Washington University, 2Washington State University Northwestern Research and Extension Center, 3Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University

Summary

Filmes plásticos rotulados como "biodegradável" estão disponíveis comercialmente para uso agrícola como coberturas. Preparo representa um método de eliminação atraente, mas a degradação sob condições de campo é mal compreendida. O objetivo deste estudo foi desenvolver métodos para isolar fungos de solo nativo e bactérias que colonizam filmes mulch plástico após o enterro de campo.

Abstract

Fungos nativas em solos agrícolas que colonizaram mulch (BDM) filmes biodegradáveis ​​disponíveis comercialmente foram isolados e avaliados quanto ao potencial de degradar plástico. Normalmente, quando as formulações são conhecidos de plásticos e uma fonte de matéria-prima está disponível, o plástico em pó pode ser suspensa em meio à base de agar e degradação determinadas pela visualização de zonas de compensação. No entanto, esta abordagem pouco imita degradação in situ de BDMs. Primeiro, BDMs não são dispersas na forma de partículas pequenas em toda a matriz do solo. Em segundo lugar, BDMs não são vendidos comercialmente como polímeros puros, mas sim como filmes contendo aditivos (por exemplo agentes de enchimento, plastificantes e corantes) que podem afectar o crescimento microbiano. Os procedimentos aqui descritos foram usados ​​para os isolados obtidos a partir de filmes de cobertura do solo enterrado. Isolados fúngicos adquiridos de BDMs escavados foram testados individualmente para o crescimento em pedaços de novos BDMs desinfestadas estabelecidas sobre meio definido contendo nenhuma fonte de carbono eXCEPT ágar. Os isolados que cresciam em BDMs foram ainda testados em meio líquido onde BDMs foram a única fonte de carbono adicionado. Depois de aproximadamente 10 semanas, colonização e degradação BDM foram avaliadas por microscopia eletrônica de varredura. Isolados foram identificados através da análise de seqüências de genes de RNA ribossômico. Este relatório descreve métodos para isolamento de fungos, bactérias, mas também foram isolados utilizando esses métodos, substituindo os meios adequados para as bactérias. Nossa metodologia deve ser útil para os estudos que investigam quebra de filmes plásticos intactos ou produtos para os quais matérias-primas plásticas são desconhecidos ou não disponível. No entanto, nossa abordagem não fornece um método quantitativo para comparar as taxas de degradação da BDM.

Introduction

Degradação tem sido historicamente considerada um atributo indesejável de polímeros plásticos, porque quebra reduz a vida útil do produto e durabilidade. Recentemente, a consciência dos problemas ambientais apresentados por resíduos de plástico no meio ambiente natural 1,2,3 fez plásticos biodegradáveis ​​uma alternativa atraente para materiais plásticos convencionais. A degradação (definida como alterações estruturais, a fragmentação e redução do peso molecular, a integridade e força 4,5) ocorre através de uma série de eventos, incluindo ambos os processos abióticos (tensão térmica, foto-oxidação, a hidrólise, a erosão ea tensão mecânica), e degradação biológica 6. Enquanto os processos abióticos pode alterar o tamanho do fragmento e as características dos plásticos, os microorganismos são necessários para a sua mineralização final a água e dióxido de carbono (em condições aeróbicas) e / ou metano (sob condições anaeróbicas).

Um nicho substancial paraplásticos biodegradáveis ​​existe na agricultura, onde coberturas de plástico são usados ​​para impedir o crescimento de ervas daninhas, para manter a humidade do solo e para aumentar a temperatura do solo 7,8. Centenas de milhares de hectares nos Estados Unidos só são cobertos com coberturas de plástico nove, incluindo coberturas compostas de plástico biodegradável. Após uma época de cultivo, as opções para a eliminação de coberturas biodegradáveis ​​(BDMs) incluir a eliminação em aterro, incineração para recuperação de energia 10, a degradação via compostagem, ou degradação no solo após o preparo 11. Destes, o destino menos trabalhoso é arar BDMs no solo, mas sem degradação eficiente e mineralização durante os meses de não-colheita (geralmente no inverno), fragmentos de plástico podem permanecer e interferir com equipamentos agrícolas durante o cultivo e plantio de primavera, e persistem no ambiente onde elas impactam significativamente fauna, flora e microbiota 1,2,3,10.

12. No inverno, a temperatura do solo na maioria dos locais seria menor do que qualquer uma dessas temperaturas, presumivelmente resultando em ainda menor atividade microbiana e, conseqüentemente, menor mineralização. Além de diminuir as taxas de degradação, mau uso do termo "biodegradável" levou a desconfiar destes produtos por parte dos consumidores 13,14, incluindo aqueles na indústria agrícola. A biodegradação é a conversãode polímeros para o dióxido de carbono (e / ou metano) e água 14 por microrganismos que ocorrem naturalmente 4. Portanto, a biodegradação deve ser medido quimicamente, a associação física dos microorganismos com um substrato não implica a degradação microbiana do material.

Como parte de um esforço para examinar o uso sustentável dos BDMs na agricultura, este estudo centrou-se na descoberta de microrganismos nativos de solos agrícolas que colonizam e degradar BDMs comercialmente disponíveis. Métodos de ensaio normalizados foram publicados para medir quimicamente a composição de plásticos biodegradáveis ​​por meios abióticos e biológicos 15,16,17. No entanto, estes métodos não resolvem degradação de plásticos por espécies microbianas individuais ou fornecer métodos para o seu isolamento. A metodologia aqui se assemelha mais de perto os métodos padronizados para avaliar plásticos para a resistência à ruptura microbiana após a inoculação de amostras com os esporos dos fungos18,19.

Quando as formulações são conhecidos de plásticos e uma fonte de matéria-prima está disponível, o plástico em pó pode ser suspensa em meio à base de agar e degradação determinadas pela visualização de zonas de compensação 13. Este método já foi utilizado anteriormente para identificar microorganismos que degradam polímeros, tais como o poliuretano 20, poli-(butileno succinato-co-adipato) 21, e poli (ácido láctico) 22. Um processo semelhante envolve a suspensão de plástico em pó puro em meio líquido, onde o plástico é a única fonte de carbono 20,23. Embora estes métodos possuem a vantagem de um sistema definido, mal eles imitam degradação in situ de BDMs. Em primeiro lugar, a área de superfície é distribuído de forma diferente, porque BDMs não são dispersos em pequenas partículas por toda a matriz do solo, mas sim, vendidos e usados ​​como filmes. Em segundo lugar, a composição química do BDMs é diferente a partir de polímeros puros. BDMs geralmente conter aditivos tais comoagentes de enchimento, plastificantes, e corantes, e estes aditivos poderão afectar o crescimento microbiano e, portanto, a taxa de mineralização. Por esta razão, e porque a composição de certos filmes comerciais neste estudo foram, película plástica, na sua forma proprietária campo pronta foi utilizada para o isolamento de fungos e bactérias. Para simplificar, os métodos abaixo descritos são apenas para os fungos, com as modificações observadas onde apropriado para isolamentos bacterianos.

Em um estudo recente 24, três BDMs comercialmente disponíveis e um filme experimental foram usados ​​em locais agrícolas em três diferentes regiões dos Estados Unidos para um período de crescimento, e posteriormente colocadas em mesh (250 mícron) malas e enterrado por um inverno no solo nos mesmos locais. Os 250 mícron aberturas de malha permitir hifas fúngicas penetrar, excluindo a maioria das raízes e fauna do solo e minimizar a invasão do solo 25,26. Materiais de nylon saco de evitar a degradação do solo. Após escavação, fungal isolados foram recuperados a partir de pedaços BDM e avaliada para crescimento em meio mínimo, sem uma fonte de carbono, excepto para o agar e de 5 cm x 5 cm quadrados de superfície de película desinfestadas BDM novo, não utilizado, que foi pré-autoclavado. A maioria dos filmes plásticos usados ​​como não pode ser esterilizado, sem perda da integridade, assim luz UV foi utilizado para matar as células microbianas que residem nos plásticos. ISO 19 846 recomenda-desinsectização superfície em 70% de etanol e subsequente secagem, mas se utilizar este método, deve-se assegurar que nenhum componente ou aditivo da película é afectada negativamente pelo etanol. Desde BDMs presumivelmente são fabricados para suportar a luz solar, os raios UV foi escolhida como método de descontaminação.

Os isolados que cresciam em pedaços BDM melhor do que em meio mínimo sozinho foram seleccionados para estudo posterior. Agar, um polissacárido produzido por algas marinhas, é utilizado para solidificar meios microbianos porque ele normalmente não é utilizado por metabolicamente agricolamente e não medicamentemicroorganismos capazes, no entanto, ágar-hidrolisantes enzimas têm sido isolados a partir de bactérias e bactérias marinhas 27 hidrolisável agar também foram isoladas a partir do solo 28. BDM polímeros e ágar É esperado que sejam substratos raras para enzimas secretadas pelos fungos do solo, o que não evoluíram em ambientes que contêm esses polímeros, como potenciais fontes de nutrientes, mas ambos os substratos estão presentes na placa de bioensaio aqui descritas (Passo 7). Fungos que utilizam BDMs agar, mas não como uma fonte de carbono pode ser diferenciado a partir de fungos, que utilizam apenas de ágar, por meio da comparação do crescimento em meio solidificado com ágar contendo i) sem adição de fonte de carbono, excepto ágar (controlo negativo), ii) filmes BDM (experimental) e iii) a glicose (controle positivo). O crescimento de todas as amostras é esperado em meio mínimo e glicose; fungos não proveniente de glicose contendo placas poderão não ser capazes de crescer em meio mínimo específico utilizado na experiência. Potengiai BDM degradadores deve crescer em agar solidificado meio mínimo + filme BDM melhor do que crescem em meio solidificado com ágar mínimo sozinho. Os fungos crescem em placas de meio mínimo de agar são-degradadoras ou oligotrophs, e também devem crescer no ágar relacionado com BDM filmes em placas de bioensaio, mas não nas próprias películas (a menos que por acaso também degradam polímeros BDM).

Para eliminar a possibilidade de ver o crescimento microbiano devido à utilização de ágar e não da BDMs, seguimos o nosso ensaio inicial para a colonização BDM em placas de agar com um bioensaio em meio de caldo definida (Passo 9). BDM peças representada a fonte de carbono conhecida apenas nos tubos de bioensaios.

Após a triagem inicial, e sobre reviver stocks glicerol dos isolados, alguns formados micélio escasso, mas visível em meio líquido definido contendo nenhuma fonte de carbono conhecido. Estes resultados sugerem que alguns dos isolados foram adquiridos oligotrophs - organismos que crescem por varrimento muito pequenas quantidades de carbono, azoto e outros nutrientes dissolvidos, quer em meio aquoso ou que existe como materiais voláteis no ar 29,30,31. Identificação das espécies através de análise de DNA ribossomal 18S apoiado este ponto de vista, como muitos dos isolados correspondentes gêneros de fungos relatado anteriormente para expor oligotrofia 32. Oligotrophs, que são vulgarmente saprófitas, requerem um amplo leque de capacidades metabólicas para a utilização do substrato numa gama de ambientes de 30. Assim, não é de estranhar que os mesmos fungos isolados de nós BDMs (presumivelmente exigindo capacidades enzimáticas incomuns) demonstraram capacidades oligotróficas, e foram capazes de crescer em traços de contaminantes, como óleos de pele de impressões digitais, poeira ou traço voláteis no ar. Devido ao isolamento de oligotrophs, concluiu-se que o crescimento sobre uma superfície BDM por si só não pode ser usada para inferir a ruptura de BDM. Os métodos descritos aqui refletem os nossos esforços para screen colonizadores BDM nativas de solos agrícolas para a quebra BDM bona fide.

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Protocol

Este processo requer pelo menos vários meses para a incubação de filmes BDM no solo, e vários meses para bioensaios sequenciais, tanto em placas de ágar-ágar e livre, caldo definido quimicamente para avaliar a colonização e degradação. Os métodos individuais são listados pela ordem em que será realizada.

1. Incubação de Films BDM no solo

Incorporar filmes BDM no solo em condições que imitam aqueles em que se espera para se degradar. Adquirir 400 g (peso seco equivalente) de solo residente e sanduíche de 10 cm x 10 cm BDM com o solo dentro de um x 13 cm de nylon de malha 13 (250 micra) saco. Feche com fio de nylon. Os tempos de incubação são a critério do experimentador. Monitor e / ou modificar os parâmetros relevantes para a actividade microbiana (por exemplo, temperatura, nutrientes do solo e da humidade) em intervalos regulares durante todo o período de incubação, conforme apropriado.

2. Preparação de Mídiae Reagentes

Para evitar a introdução de fontes de nutrientes, inadvertidamente, em media e tubos de cultura, uso de reagentes químicos de grau, tubos de cultura recém-adquiridos, Tipo I ultrapura (eg NanoPure), água e copos rigorosamente lavados por meio de mistura. Evitar a contaminação cruzada de reagentes - o melhor é usar um conjunto específico de reagentes e vidraria para esta finalidade. Note-se que é possível que os fungos podem ser isolados cujo crescimento é inibido por um ingrediente nos reagentes listados abaixo. Se isso ocorrer, pode ser necessária alguma optimização.

  1. Antes de fazer meios, lavar todos os vidros necessário, com um detergente de laboratório e em seguida com ácido aquoso (por exemplo, molho durante a noite em 10% de HCl). Lavar um mínimo de doze vezes em água destilada e duas vezes em água ultrapura. Cobrir o material de vidro com uma folha de alumínio limpos de excluir poeira. Use luvas e evite tocar no interior e bordas de navios para excluir a oleosidade da pele a partir de impressões digitais. Para evitar qualquer sabão residívidas e arranhões no vidro que facilitam a colonização, fungos cultura em tubos de ensaio de vidro recém-comprados (não utilizado), lavados e autoclavada e bonés.
  2. Agar de dextrose de batata (PDA), é utilizado para o isolamento inicial de fungos do solo, e para o estabelecimento de colónias individuais isolados e geração de inoculo para a armazenagem a longo prazo. Preparar os meios de comunicação de acordo com as instruções do fabricante e depois de tratamento em autoclave (quando arrefecida a 50 ° C), adiciona cloranfenicol (a partir de 10 mg / ml de solução em etanol) a uma concentração final de 30 ug / ml, de excluir bactérias. Este meio é agora referido como PDA chl 30.
  3. Fúngica meio mínimo (FMM) é usado como uma base sólida para BDMs inoculados com potenciais degradadores plástico fúngicas. Além do ágar (quando utilizados para solidificar o meio), é livre de carbono. A cerca de 800 ml de H2O desionizada, adicionar 6,0 g de NaNO3, 0,52 g de KCl, 0,52 g de MgSO4 7H ·2 O, 1,52 g KH 2 PO 4, e uma solução de elementos traço do ml Hutner (2,2 g ZnSO4 · 7H 2 O, 1,1 g H 3 BO 3, 0,5 g MnCl 2 · 4H 2 O, 0,5 g FeSO4 · 7H 2 O, 0,16 g de CoCl2 · 5H 2 O, 0,16 g de CuSO4 · 5H 2 O, 0,11 g de (NH 4) O 24 7 6mo · 4H 2 O, e 5,0 g de Na 4 EDTA em 100 ml de H2O destilada 33 , 34. Ajustar o pH para 6,5 utilizando NaOH, e perfazer o volume a 1 L. Para o bioensaio líquido, filtro-esterilizar FMM para evitar a precipitação de sais. meio sólido Se for desejado, adicionar 16 g de ágar e autoclave. Quando ágar semi-sólido é necessário, reduzir ágar a 8 g / L. Quando arrefecida até 50 ° C, adicione cloranfenicol a uma concentração final de 30 ug / ml. Este meio é agora referido como FMM chl 30. Como controlo, para assegurar que os isolados de fungos crescem em este meio, FMM deve ser made tal como acima, mas contendo 10 g de glucose por litro. Isto é chamado de glicose meio mínimo 35 (GMM).
  4. Salina tamponada com fosfato 36 (PBS) é usado para suspender as partículas do solo e as células microbianas na diluição de série inicial de BDMs solo exposto. Para tornar PBS, adicionar 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, e 0,24 g de KH 2 PO 4 a 800 ml de água destilada. Dissolve-se os sais e ajustar o pH para 7,4 com HCl. Levar o volume total a 1 L com água ultrapura. Preencha tubos de cultura limpas com 9,5 ml e 4,5 ml PBS por tubo. Autoclave.
  5. 30% (v / v) de glicerol é utilizado para suspender as células criopreservadas bacterianas e por fungos, esporos e micélio de fungos durante o armazenamento a -80 ° C. Faça esta solução em água ultrapura. Autoclave.
  6. 0,01% (v / v) de Triton X-100 é utilizado para suspender os esporos de fungos, a detergente actua como um agente de humidificação não-tóxico para os esporos hidrofóbicos. Dissolve-se 100 ul de Triton X-100 Em 1 L de água ultrapura. Autoclave.
  7. Tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,2) é utilizado como solvente para o glutaraldeído durante a fixação SEM. Misture 68,4 ml de 1 M de Na 2 HPO 4 e 31,6 ml de 1 M de NaH 2 PO 4 e perfazer o volume total a 1 L com água ultrapura 36.

3. Elaboração de Materiais bioensaios: descontaminação de superfícies de BDM Films

  1. Porque restos de contaminantes como o de papel e fita em utensílios de corte são potenciais fontes de carbono, use uma tesoura recém-adquirido ou lâminas de barbear frescas, e uma superfície inorgânico para o corte. Usar luvas para evitar a contaminação dos filmes BDM com a oleosidade da pele. Cortar filmes BDM em pequenos quadrados (4,25 x 4,25 cm). Esta praça tamanho se encaixa em um 100 x 15 mm placa de Petri padrão.
  2. Use uma lâmpada UV germicida (emissão de comprimento de onda = 253,7 nm) para descontaminar filmes BDM. Essa lâmpada é freqüentemente encontrado em uma cabine de segurança biológica padrão. Certifique-se de que, quandoa luz UV está a funcionar, não existe um fluxo de ar externo dentro da cabine de segurança biológica, que pode contaminar as películas BDM.
  3. Superfícies molhadas dentro do capô com etanol 70% e deixar correr ventilador por 15 minutos para limpar o ar. Em seguida, feche o cinto e descontaminar a superfície do capô com UV por 2 horas.
  4. Coloque os filmes BDM na capa descontaminados, nas linhas. Permitir que a luz UV para brilhar em filmes de 2 horas.
  5. Use um pano limpo, pinça esterilizada para virar os filmes BDM. Comece na fila da frente e trabalhar para a linha de volta para minimizar o tempo que as mãos e os braços são diretamente acima das superfícies BDM recém-descontaminados. Quando lançando BDMs, coloque o lado recém-desinfestadas descendente sobre uma área limpa exposto à luz UV, mas não previamente em contacto com o lado não desinfestadas do filme.
  6. Depois de 2 horas de tratamento UV em cada lado, retire os filmes BDM da cabine de segurança biológica com uma pinça estéril, mais uma vez o trabalho de frente para trás para evitar colocar as mãos e os braços ao longo já descontaminaçãofilmes nados. Coloque os filmes em BDM, seco, contentores fechados estéreis, como copos folha cobertas. Guarde à temperatura ambiente na escuridão.

4. Setup Bioassay placa

Execute todas as etapas em uma capa de transferência estéril, utilizando técnica asséptica.

  1. Colocar as peças BDM UV desinfestadas à superfície de placas de agar. Defina-se um canto em primeiro lugar, suavemente e deixou o restante do rolo quadrado em contacto com o ágar. Evite rugas. Alguns filmes vão formar rugas como durante o armazenamento, o que é inevitável. Particularmente películas finas pode exigir a utilização de duas pinças, a fim de fixar a peça plana.
  2. Coloque as contas do semi-FMM chl 30 agar em cima do filme plástico para fornecer uma água e fonte de nutrientes para a colonização inicial de plásticos hidrofóbicas. Grânulos não são necessárias para as películas permeável à água. Re-derreter o agar no microondas, e utilizar uma micropipeta para transferir quatro gotas 10 ul de agar derretido sobre a cobertura morta (um em cada corner). Não toque na ponta da pipeta directamente para a cobertura, pois pode perfurar. Não exceder 10 ml por gota, por excesso de peso no mulch plástico pode puxar fora da superfície do agar quando as placas são invertidas.
  3. Deixe as placas de sentar do lado direito com tampas durante a noite para solidificar completamente, e depois armazená-luvas fechados do lado do agar-se a 4 ° C no escuro. Quando estiver pronto para executar o bioensaio (Passo 7), uso i) uma placa de FMM chl 30 (controlo negativo), ii) uma placa de bioensaio contendo quatro gotas 10 ul de semi-sólido FMM chl 30 na película de plástico, e iii) uma placa de GMM (controlo positivo). Deste modo, quatro repetições de cada isolado pode ser testada por placa de meio.

5. Setup Bioassay líquido

  1. Siga as instruções para o corte BDM no Passo 3.1. Antes de cortar filmes plásticos para o bioensaio líquido, escolha um tamanho que se encaixa dentro do tubo de cultura.A área necessária à obtenção de uma massa uniforme entre os vários tipos de plástico irá depender da espessura do filme. Descobrimos que as peças equivalentes a 0,0175 g encaixam bem em 15 x tubos de cultura de 150 mm.
  2. Surface-descontaminar filmes com luz UV, tal como descrito no Passo 3 acima.
  3. Para cada réplica de um microbiana isolar, preparar três tubos para inoculação: i) de 5 ml contendo um fragmento FMM BDM do tamanho pré-determinado (experimental), ii) a 5 mL de FMM sem fonte de carbono (controlo negativo), e iii) de 5 ml GMM (controlo positivo). Adicionalmente, preparar tubos de replicar FMM contendo cada RCA a ser testado, mas não lhes inocular. Estes tubos de controlo irá revelar qualquer crescimento microbiano resultante de contaminação.

6. Isolation of Fungi

Incubação do solo e remoção seguinte exemplo, os fungos são isolados do solo que adere aos filmes BDM. Se desejado, as bactérias podem simultaneously ser isolado com o mesmo método, usando meios adequados para o isolamento de bactérias do solo, tais como 1/10X diluído levedura agar de soja tríptica suplementado com 50 ug / ml de cicloheximida para impedir o crescimento de fungos 37. Ao meio definido é necessário para isolamentos bacterianos nas etapas 5 e 7, M9 38 (mais cicloheximida) é uma boa escolha.

  1. Antes de processamento da amostra, preparar PBS e PDA chl 30. Permitir PDA chl 30 placas para secar (ensacados) à temperatura ambiente durante aproximadamente 24 horas para eliminar a condensação na pálpebra e a superfície do ágar. Pré-label PDA chl 30 placas.
  2. Escavar sacos de malha contendo peças BDM de cemitérios escolhidos na Etapa 1. Navio e armazenar a 4 ° C no máximo 48 horas após a extração do solo.
  3. Usando uma espátula e uma pinça estéril, retire delicadamente o solo até que o plástico é exposto, mas não escovar solo que está agarrado a superfície do filme BDM. Corte filme BDM em um centímetroDuas peças até 0,5 g de material recuperado para cada uma das quatro repetições totais. Transferir 0,5 g película BDM e solo ligado a tubos de cultura de 25 ml contendo 9,5 ml de PBS. Se a cobertura é completamente degradado ou um controle somente o solo está sendo processado, adicionar 0,5 g de solo para a PBS, se possível, escolher peças que ainda estão descoloridos a partir do bagaço residual.
  4. Vortex os tubos de cultura contendo 9,5 ml de PBS e 0,5 g de palha de 30 segundos a alta velocidade, sonicar sonicação num banho de água durante 10 minutos, e novamente vórtice durante 30 seg. A agitação se destina a quebrar biofilmes, remover fisicamente as células embutidos ou aderir a peças palha, e criar uma suspensão homogénea.
  5. Prepare-se para diluir em série a solução PBS / solo para obtenção de unidades formadoras de colônias individuais de revestimento. Para cada amostra, coloque em uma capela de fluxo laminar um tubo de cultura cheia de 4,5 ml estéril PBS. Para cada amostra, encher três poços de uma placa de 96 poços profundos bem cheio com 450 ul de PBS.
  6. A suspensão de plástico / solo original (0,5 g cobertura mais 9,5 ml de solução de PBS) representa um 5,0 x 10 -2 diluição de material microbiano aderente ao plástico. Adicionar 0,5 ml de suspensão a partir deste tubo original para 4,5 ml de PBS estéril num tubo de cultura para se obter uma diluição x 10 -3 5,0. Vortex durante 30 segundos a alta velocidade. Adicionar 50 ul a 450 pi de PBS na placa de 96 poços. Repita o procedimento para todas as amostras / repetições. Use uma pipeta multicanal para diluir as amostras em massa. Misture cada nova diluição pipetando cima e para baixo dez vezes. Alterar dicas entre diluições. Diluir até 5,0 x 10 -6.
  7. (Opcional) isolados de bactérias eram mais abundantes do que isolados de fungos em amostras aqui descritos, assim se simultaneamente isolamento de bactérias, em seguida, realizar diluições até 5 x 10 -8 no Passo 6.6 acima.
  8. Uniformemente distribuídos 100 jil de cada uma das 5,0 x 10 -3 através do 5,0 x 10 -6diluições em toda a superfície de agar PDA chl 30 placas com hastes de vidro dobrados chama-esterilizados. Placas de guardar na posição vertical por 30 minutos para deixar de molho em líquido, em seguida, selar as placas com Parafilm para evitar a fuga de esporos de isolados não identificados. Incubar as placas invertidas a 20 ° C, no escuro, durante 5 dias para permitir que ambos os fungos rápidas e de crescimento lento, para formar colónias.

7. Seleção inicial de fungos plástico de degradação

Importante: Todas as culturas a partir deste ponto em diante só deve ser aberta em uma cabine de segurança biológica (e não uma capela de fluxo laminar) para evitar a contaminação do ambiente com esporos de identidade desconhecida. Alguns fungos e bactérias são potenciais patógenos humanos.

  1. Examinar as placas de diluição contendo colónias bem isoladas. Selecione uma colônia que não está tocando outra colônia.
  2. Usando um único palito estéril, tocar suavemente uma colônia e, em seguida, tocar o agar do FMM (feita no Passo 2.3 etapa 4), ​​e GMM (feita no Passo 2.3) placas, nessa ordem. Para inocular os grânulos de agar no topo de películas de plástico, o palito esfregar suavemente sobre a superfície do ponto de agar e, em seguida, passe através da película de plástico. Repita a inoculação a partir da mesma fonte de colónias até há quatro estrias replicar em cada placa.
  3. Repita os passos 7.1 a 7.2 até várias repetições de cada tipo de colônia visualmente único são selecionados a partir de cada amostra BDM.
  4. Placas de vedação com parafilme, inverter e incubar a 20 ° C no escuro, durante 5 dias.
  5. Identificar isolados que crescem em BDMs melhor do que eles crescem no FMM. Se o crescimento não é óbvia, ver a amostra sob um microscópio de dissecação para verificar a colonização ou a falta dela (Fig. 1). Mantenha a tampa, se a tampa tem condensação, substitua por uma nova tampa, mas fazê-lo no gabinete de biossegurança.
  6. Uma vez que os potenciais degradadores BDM são selecionados, usar comoterile palito para raspar inóculo do fungo colonizar o próprio plástico, e raia para isolamento de simples formadoras de colônia-unidades em PDA chl 30 placas.
  7. Placas de vedação com Parafilm e incubar PDA chl 30 placas inoculadas com isolados de plástico que degradam a 20 ° C durante 5 dias no escuro.
  8. Agora que o único colônias isoladas são purificados, garantir que eles são realmente capazes de colonizar os plásticos que está sendo testado. Recolhe inóculo (esporos, células de levedura, ou de hifas) a partir de uma única unidade de formação de colónias com um palito estéril. Repita os passos 7.2 a 7.5. Após 5 dias de incubação a 20 ° C, examinar as placas de bioensaio para o crescimento fúngico. Se o isolado cresce sobre uma película de BDM melhor do que cresce em FMM em ambas as primeira (7.5) e segunda (7.8) ensaios, em seguida, armazena o isolado tal como descrito no Passo 8.

8. Armazenamento de longo prazo de degradadores de plástico Em geral, os isolados de plástico degradam será testada no bioensaio de placa (7,5), re-purificada, isolada para unidades formadoras de colónias (7.6), que foi testada no bioensaio de placa de novo (7.8) e, finalmente, testada no bioensaio de líquido ( 9,1-9,5). Durante o teste, os isolados devem ser transferidas para meio fresco todos os meses e placas estoque de trabalho armazenado a 4 ° C assim como é visível um crescimento suficiente. Isolados também devem ser armazenados como stocks de glicerol a -80 ° C, e / ou esporos como secas sobre discos de filtro estéril, a 4 ° C. Ambos os métodos de armazenamento encontram-se descritos abaixo.

  1. Para cada um dos isolados que cresceu numa película BDM melhor do que cresceu em FMM em ambas as primeira (7.5) e segunda (7.8) bioensaios de placa, preparar duas placas de PDA chl 30 com dois ou três discos de papel de filtro esterilizados, cerca de 1 cm de diâmetro , sobre a superfície. Inocular estas duas placas demesma colónia única escolhido no Passo 7.8 acima. Faça um gramado, espalhando uniformemente inóculo sobre o agar para maximizar o crescimento. Selar as placas com parafilme e incubado a 20 ° C durante 5 dias. Este passo pode ser iniciada em simultâneo com o passo 7.8 para a eficiência.
  2. O disco de filtro sobre a superfície do ágar deve ser coberto com micélio / esporos. Remova os discos de filtro a partir da superfície de agar com uma pinça esterilizada, e coloque em um tubo Eppendorf estéril. Air secar os discos de filtro durante a noite dentro dos tubos Eppendorf (com o off cap) em uma cabine de segurança biológica ou outro ambiente seco, estéril, com o movimento do ar mínima para evitar a contaminação cruzada. Em seguida, selar com Parafilm e armazenar a 4 ° C.
  3. Use um cotonete estéril ou palito para colher esporos e micélio das placas de gramado. Suspender esporos e hifas em 30% de glicerol em criotubos, flash-congelar em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C.

9. Co rigorosasnfirmation de Utilização Plastic via Bioassay líquido

  1. Gerar esporos frescos e / ou de células com as quais para inocular culturas liquidas: inocular PDA chl 30 placas com esporos de potenciais isolados degradantes de plástico. Selar as placas com parafilme e incubadas a 20 ° C até que os esporos fúngicos são visíveis.
  2. Numa câmara de biossegurança, os esporos de colheita por lavagem da placa com 0,01% de Triton X-100 (5 ml por 15 x 100 mm funciona bem placa de Petri) e esfregando os esporos (ou células de levedura), a partir da superfície com uma vareta de vidro esterilizada dobrada . Aspirar esporos (ou células) de suspensão e transferência para um recipiente estéril.
  3. Contagem de esporos ou de células com um hemacitómetro e determinação do volume apropriado adicionar a 5 ml de caldo FMM para um total de 1 x 10 6 esporos / tubo. O volume deve ser inferior a 10 ml. A diluição dos concentrados de suspensões de esporos em 0,01% de Triton X-100 podem ser necessários.
  4. Em uma capa de transferência estéril, inocular tubos de cultura preparados 6 esporos (ou células de levedura). Selar as tampas com Parafilm para evitar qualquer fuga de esporos, em particular para os isolados não identificados. Incubar no escuro a 20 ° C e observar as amostras semanais para o crescimento.
  5. O crescimento micelial dos fungos sobre películas plásticas podem ser visíveis dentro da primeira semana após a inoculação, especialmente nas arestas das películas plásticas. Para levedura planctônicas (como evidenciado pela fraca a media), o crescimento pode ser monitorizada por leituras de densidade óptica a 600 nm. Porque os fungos são susceptíveis de fixar directamente à película de plástico, o crescimento pode ser avaliado a olho nu, e pode ser confirmado por microscopia óptica e / ou microscopia electrónica de varrimento (MEV).
  6. Em apenas FMM controles, procure manchas brancas minúsculas que são muito pequenas para registrar uma mudança na densidade óptica utilizando métodos espectrofotométricos. Estas manchas podem ser aspirada com uma pipeta de Pasteur e observadas utilizando microscopia de interferência diferencial (DIC). Manchas são muitas vezes irreconhecíveis precipitate, mas em alguns casos, eles podem ser aglomerados do inoculante original que tinha germinado, mas não cresceu de forma substancial.
  7. Use observações visuais e microscópicas para comparar a colonização de amostras experimentais e controles, e atribuir classificações para o crescimento de cada amostra de filme BDM. Porque muitas BDMs são de cor escura e permitir a observação mínima via microscopia exceto nas bordas, e espessura do filme proíbe observação sob uma lente de imersão em óleo, SEM é útil para estimar i) a presença de crescimento microbiano, por exemplo, através do sistema de classificação descrito no Tabela 1, e ii) a extensão da degradação BDM.

10. SEM Amostra Preparação

  1. Use limpas, tesoura esterilizada para cortar pequenos pedaços de BDM de amostras idênticas. Fix BDMs por imersão em 2,5% de glutaraldeído em tampão de fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,2) durante 24-48 horas.
  2. Enquanto fixação está ocorrendo, desidratar o etanol 100% puro, adicionando 5-10% volume da peneira molecular 3 A (activados no forno de secagem a 175-260 ° C e arrefecida num excicador), e deixa-se repousar à temperatura ambiente durante a noite para assegurar a desidratação total.
  3. BDMs imerso em tampão de fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,2) por quatro lavagens de 15 minutos cada.
  4. BDMs mergulhe em água ultrapura para três lavagens de 5 minutos cada.
  5. Desidratam BDM amostras numa série de etanol, a imersão durante 20 minutos a cada concentração: 50%, 70%, 80%, 90%, 95% e 100%. Enxaguar BDMs duas vezes mais em etanol a 100% durante 20 min por lavagem.
  6. Assunto amostras para secagem de pontos críticos e revestimento por pulverização catódica.

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Representative Results

Em um estudo recente 24, quatro repetições cada uma das três BDMs comercialmente disponíveis rotulados como "biodegradáveis", além de um filme experimental e um controle de plástico convencional, foram colocadas sobre o solo como cobertura morta para a produção de tomate, na primavera de 2010, em Mount Vernon, WA, Knoxville, TN, e Lubbock, TX. No outono de 2010, quadrados BDM filme foram cortadas de cada resistido bagaço, em quatro parcelas de replicar, e do solo nativa removida imediatamente abaixo da área onde a cobertura da amostra tinha sido excisada. Cada resistiu praça BDM foi imprensado no solo dentro de um saco de malha de nylon, conforme descrito na Etapa 1. A-só solo controle também foi incluído. Sacos foram enterrados com menos de 7,5 cm de solo nas mesmas parcelas e linhas anteriormente abrangidos pela cobertura morta e deixada no local até a primavera de 2011 plantio direto, sete meses depois. Sacos foram então levantadas a partir das parcelas com uma pá, colocado em sacos de plástico Ziplock, e enviados para o laboratório em blocos de gelo para entrega no dia seguinte.

<p class = "jove_content"> Aqui nós relatamos resultados representativos do nosso estudo. Fungos nativos do solo foram isolados a partir de cada BDM em todos os três sítios, para um total de 54 isolados. Descrevemos isolados a partir de dois dos produtos comerciais utilizados em um local (Mount Vernon). Um dos produtos é um plástico biodegradável chamado BIOAGRI. Este filme preto é rotulado como "à base de amido" (Bioagri, Palm Harbor, FL) e feita a partir de Mater-Bi bioplástico por Novamont (Terni, Itália). Mater-Bi é uma mistura de "amido de milho, e polímeros biodegradáveis ​​obtidos tanto a partir de matérias-primas renováveis ​​e matérias-primas fósseis" ( http://www.novamont.com/default.asp?id=505 ). O outro produto não era de plástico, mas sim um marrom "material de papel-like feito de fibra de celulose, especialmente de engenharia" (WeedGuard Além disso, SunShine Paper Co, Aurora, CO); ( http://www.weedguardplus.com/faqs.php ). Este produto originalmente foi incluído como um controlo e a degradação dos seus componentes celulósicos era esperado.

Usando o bioensaio placa aqui descritos, três potenciais isolados BDM-degradantes de WeedGuard Plus e três da Bioagri foram recuperados. Estas amostras foram submetidas ao bioensaio líquido (Passos 9,1-9,7 acima) em triplicado. Embora alguns o crescimento fúngico era visível ao longo das bordas BDMs após uma semana no bioensaio de líquido, as amostras foram incubadas durante 68 dias antes da colheita e última observação. Utilizando SEM, hifas de fungos foram observados em todas as amostras excepto XX e YY, onde se observou células em forma de bastonete (Tabela 2). Porque XX e YY crescer na forma de levedura em PDA chl 30, esta observação foi o esperado.

Para os WeedGuard positivos isolados, nenhum crescimento foi observado nos controlos somente FMM. A degradação mais BDM foi observado nas amostras colonizado por Isolar SS. No contro não inoculadols de WeedGuard Bonés cobertura (Figura 2A), elementos traqueais residuais das fibras derivadas de plantas são apenas detectável como ligeira poc-marcação visto em fileiras em algumas das fibras. Apesar de hifas de fungos foram observadas em todas as três amostras inoculadas, elementos traqueais eram claramente visíveis apenas nas amostras de SS (Figura 2B), sugerindo que a digestão de material celulósico revelou os elementos traqueais lenhificados abaixo. Isolar SS foi tentativamente identificados usando DNA ribossomal 18S como um sordariomycete dentro dos Sordariales ordem.

Para os isolados BIOAGRI, qualquer crescimento significativo foi observado nas somente FMM controlos. Manchas brancas simples visíveis em cima girando os tubos de cultura de isolados VV e ZZ foram observados por microscopia DIC. Para isolar VV, a partícula era uma massa de esporos (não mostrado), presumivelmente residual da inoculação inicial. Para Isolar ZZ, a massa era composta de malha solta de hifas de aproximadamente 0,2 mm de diâmetro, Sugerindo que o inoculo original de esporos germinaram, mas não tinha crescido para além da massa representada na Figura 3A.

Nos controlos não inoculados para a cobertura BIOAGRI (Figura 3B), uma textura irregular é observado. A identidade das características brancas é desconhecida, mas estão ausentes em um filme colonizado por Isolar VV (Figura 3C). Ambas as partículas brancas e solavancos sumiram em um filme colonizada por Isolar ZZ (Figura 3D). Além disso, esta amostra revelou a ocorrência de fissuras uniforme em toda a superfície de BDM. Isolados VV e ZZ foram tentativamente identificados usando 18S DNA ribossomal como Penicillium sp. (VV) e uma sordariomycete dentro dos Hypocreales ordem (ZZ), respectivamente.

Contagem Aparecimento de crescimento microbiano
0 Nenhum crescimento aparente a olho oupor microscopia
1 Esporos germinados, mas não o crescimento subsequente resulta
2 Crescimento cobrindo ≤ 25% da superfície de ensaio ou médio
3 ≤ Desenvolvimento cobrindo 50% da superfície de teste ou médio
4 ≤ Desenvolvimento cobrindo 75% da superfície de teste ou médio
5 Desenvolvimento cobrindo> 75% da superfície de teste ou médio

Tabela 1. O sistema de pontuação para o crescimento microbiano classificação de amostras de ensaio de películas de plástico.

> Mycelia e cadeias de esporos observados na borda
Isolar BDM

Somente FMM controle (score)

FMM contendo 0,0175 g BDM (pontuação e / ou comments)
Visual avaliação A microscopia de luz SEM
SS WG 0 Hifas e fibras BDM indistinguíveis Hifas e fibras BDM indistinguíveis 2; hifas fúngicas visível
TT WG 0 Hifas e fibras BDM indistinguíveis Hifas e fibras BDM indistinguíveis 2; hifas fúngicas visível
XX WG 0 Caldo nublado Poucas células observadas em caldo 2, as células em forma de bastonete na superfície
VV BA 1 Belas micélio visível na borda 4; hifas prolífico e conidióforos
YY BA 0 Caldo nublado Poucas células observadas em caldo 2, as células em forma de bastonete na superfície
ZZ BA 1 Crescimento micelial de luxo em toda a superfície As hifas visível na borda 5; hifas Prolific

Tabela 2. Observações e avaliações de crescimento para fungos isolados obtidos a partir resistiu filmes BDM enterrados em parcelas de campo do outono de 2010 até a primavera de 2011 (7 meses) em Mount Vernon, depois inoculadas em material de BDM unweathered e incubados por 68 dias a 20 ° C na escuridão . WG = WeedGuard Além disso, BA = Bioagri. Ver Tabela 1 para o esquema de classificação de crescimento.

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Figura 1. Colonização da BIOAGRI mulch no bioensaio placa descrito no Passo 7, como visto sob um microscópio de dissecação com ampliação de 20x.

Figura 2
Figura 2. Aparecimento de WeedGuard mais cobertura morta depois de 68 dias no FMM, mas não inoculados (A), ou inoculadas com o isolado ZZ, provisoriamente identificado como Chaetomium sp. (B). Note os elementos traqueais (setas) que são praticamente indistinguíveis em A, mas claramente visto em B. Nenhum crescimento era visível somente no FMM controlo para isolar o Chaetomium. As amostras foram revestidas com Au / Pd utilizando uma quorum SC7640 revestidor por crepitação, e fotografada com uma tensão de aceleração de 15 kV em Tescan VEGA 5136 MM SEM.


Figura 3. Aparecimento de cobertura BIOAGRI depois de 68 dias no bioensaio líquido. Um único grupo de esporos germinados foi observada no somente FMM controlo para isolar o ZZ, tentativamente identificado como Sordariomycete (A). Bioagri mulch incubadas em FMM não inoculado (B), Bioagri mulch inoculadas com o isolado VV, provisoriamente identificado como Penicillium sp. (C), e Bioagri mulch incubadas com isolar ZZ (D). As amostras foram revestidas com Au / Pd utilizando uma quorum SC7640 revestidor por crepitação, e fotografada com uma tensão de aceleração de 15 kV em Tescan VEGA 5136 MM SEM.

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Discussion

O procedimento aqui descrito representa uma técnica de primeira passagem para o isolamento de potenciais degradadores BDM partir do solo, e foi utilizado com sucesso o isolamento de fungos de BDMs enterrados no solo, durante sete meses. Fungos cresceram quando reinoculados em material de BDM fresco do mesmo tipo, que indica que os fungos isolados eram efectivamente colonizadores, e que as películas não foram inibidoras para o crescimento fúngico. Isolamento de fungos plástico de degradação e bactérias potencialmente poderia levar à sua utilização, individualmente ou em combinações, para a alteração do solo ou compostagem, onde plásticos precisam ser degradada.

Em seu ambiente nativo do solo, espécies microbianas não existem isoladamente. Degradadores de plástico e até mesmo organismos oligotróficas crescendo em BDMs, mas usando outras fontes de carbono e energia, podem ser espécies-chave na colonização destas fontes de nutrientes recalcitrantes. Em um esforço para avaliar a degradação BDM in vitro, mas melhor imitar uma verdadeira solo Microbiai comunidade, a metodologia aqui descrita pode ser alterada para controlo de misturas, e que os isolados puros de inóculos fúngicos e bacterianos.

De nota, isola TT, XX, VV, e YY alcançado degradação mínima das BDMs, mas cada um mostrou colonização BDM visível em ambos os bioensaios placa e líquidos. Assim, a colonização visível não significa necessariamente degradação do polímero BDM. Isola TT, XX, VV, e YY representam, provavelmente, nutrientes que oligotrophs obtidos a partir do meio ambiente, bem como a partir da BDM 29,30,31.

Evidência definitiva de que os fungos são usando uma BDM especial como fonte de carbono requer a medição da degradação por métodos químicos. Libertação de dióxido de carbono durante a incubação de plásticos com microogranisms indica a respiração, e podem ser usadas como uma medida indirecta de desagregação polímero 15,16,39. Vários métodos são usados ​​para obter informações sobre o tamanho ea estrutura de polímeros, including cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia de exclusão de tamanho, calorimetria diferencial de varrimento, a análise termogravimétrica, a espectroscopia de ressonância magnética nuclear, de difracção de raios-X e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier. Os estudos para avaliar a evolução de CO 2 e de desagregação de polímeros iria representar uma progressão lógica do processo de rastreio aqui descritos. No entanto, os métodos químicos para medir o tamanho do polímero não é possível diferenciar a degradação por hidrólise enzimática a partir de ácidos orgânicos secretados durante o crescimento de fungos e bactérias. A implicação de um mecanismo enzimático, no colapso plástico iria requerer o isolamento de uma enzima pura (s) com capacidade de degradação de polímeros in vitro.

Os procedimentos aqui descritos devem ser amplamente aplicáveis ​​a qualquer plástico que é utilizado numa conformação de filme, tal como o material de embalagem de alimentos ou de sacos de lixo. Estes procedimentos têm várias vantagens. Em primeiro lugar, os filmes de plástico utilizado no bioassay estão em sua forma comercial, como disponíveis para a compra no mercado ea eventual degradação no meio ambiente. A ressalva é que os plásticos utilizados, como os BDMs colhidas após a estação de crescimento de 2010, em estudo, pode ser mais do que resistiu novos filmes plásticos utilizados na bioensaios in vitro. Ataque microbiano Prior, UV, vento, abrasão por partículas do solo, a hidrólise química via componentes inorgânicos do solo e fauna do solo contribuem para a oxidação e fragmentação dos polímeros, alterando a eficiência da ação enzimática sobre BDM filmes 11. Uma segunda vantagem é que este método pode ser empregue com ou sem constituintes individuais de plástico de produtos patenteados são conhecidos e / ou estão disponíveis na sua forma pura para o teste. No entanto, uma limitação da utilização de materiais plásticos com desconhecido ou múltiplos componentes é de que a degradação visível não pode ser definitivamente atribuídas a um único componente. Por exemplo, a degradação na Figura 3D pode representar amido bEPARTIÇÃO sem degradação dos polímeros mais recalcitrantes da película BIOAGRI "à base de amido". Em um estudo anterior sobre a degradação em solo de filmes plásticos de amido modificado, as taxas de evolução de dióxido de carbono reflete as quantidades de amido e corante adicionado aos filmes, enquanto os pesos moleculares do polímero inalteradas apoiou a hipótese de que os aditivos, e não polímeros, estavam sendo utilizados por microrganismos 39. Finalmente, este procedimento é focado na degradação in vitro, proporcionando assim um sistema mais definido do que os actualmente em uso normal 15,16. Espera-se que as amostras de degradação em meio quimicamente definido irá ser mais fácil avaliar por métodos químicos do que as amostras de degradação no solo ou composto. Essas avaliações são o foco atual do trabalho.

Este procedimento foi bem sucedido para o isolamento de fungos que degradam a BDM e bactérias a partir de quatro tipos de filmes BDM em três locais nos Estados Unidos (TN, WA, e TX), com diferentes nósather, tipos de solo, e as estruturas da comunidade microbiana. Este procedimento tem uma visão reducionista, focando isolados individuais com a capacidade de crescimento em cima, e quebra de BDMs. No entanto, os resultados ressaltam a importância da análise da comunidade microbiana para descrever os papéis distintos e ligados de colonizadores oligotróficas depolymerizers BDM, bona fide, e outros membros da comunidade, os quais deverão ser importante para o objetivo final da degradação completa de filmes plásticos a biomassa, o dióxido de carbono e / ou metano e água.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Dr. Stephen Alderman, Dr. David Leaf e Erin Macri é reconhecido agradecimento por ajuda com microscopia. Esta pesquisa foi financiada através de uma doação da Iniciativa de Pesquisa NIFA Specialty Crops, USDA SCRI-SREP Grant Award No. 2009-02484. Briana Kinash, Kevin Kinloch, Megan Leonhard Joseph McCollum, Maria McSharry e Nicole Pálido prestou assistência técnica excelente e discussões atenciosas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potato Dextrose Agar Becton Dickinson 8X05491
Agar Fisher BP 1423-2
Chloramphenicol Acros Organics 200-287-4
Glutaraldehyde Electon Microscopy Sciences 16216-10 Toxic
Molecular sieve Fisher M-8892
Ethanol Pharmco-Aaper E200
Contrex Decon Labs, Inc. 5204
Parafilm M Pechiney Plastic Packaging S37440
Mineral salts for buffers and media Fisher Various Various vendors sell these reagents

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