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Biology

Isolement des microorganismes du sol autochtones ayant un potentiel de Breaking Down biodégradables paillis de plastique films utilisés dans l'agriculture

Published: May 10, 2013 doi: 10.3791/50373
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 2, 2, 1
1Biology Department, Western Washington University, 2Washington State University Northwestern Research and Extension Center, 3Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University

Summary

Les films plastiques étiquetés «biodégradable» sont disponibles dans le commerce à des fins agricoles comme paillis. Travail du sol représente une méthode d'élimination attrayant, mais la dégradation des conditions sur le terrain est mal comprise. Le but de cette étude était de développer des méthodes pour isoler les champignons du sol indigènes et les bactéries qui colonisent les films de paillage plastique après l'enterrement de terrain.

Abstract

Les champignons indigènes sur les terres agricoles qui ont colonisé paillis films disponibles dans le commerce biodégradables (BDM) ont été isolés et évalués pour le potentiel de dégrader les plastiques. En règle générale, lorsque des formulations de matières plastiques sont connues, et une source de la charge d'alimentation est disponible, en matière plastique en poudre peut être mis en suspension dans un milieu et la dégradation de la gélose à base déterminés par visualisation des zones de compensation. Cependant, cette approche imite mal dégradation in situ de la BDM. Tout d'abord, BDM ne sont pas dispersés sous forme de petites particules à travers la matrice du sol. Deuxièmement, BDM ne sont pas commercialisés en polymères purs, mais plutôt comme des films contenant des additifs (par exemple des charges, des plastifiants et colorants) qui peuvent affecter la croissance microbienne. Les procédures décrites dans les présentes ont été utilisés pour les isolats acquis de sols enfouis films de paillage. Isolats fongiques acquis de BDM fouilles ont été testés individuellement pour la croissance sur des morceaux de nouvelles, BDM désinfectées fixées au sommet milieu défini contenant aucune source de carbone eauf agar. Les isolats qui poussaient sur BDM ont encore été testés dans un milieu liquide où BDM étaient la seule source de carbone ajoutée. Après environ dix semaines colonisation fongique et la dégradation des BDM ont été évalués par microscopie électronique à balayage. Les isolats ont été identifiés par analyse de séquences de gènes d'ARN ribosomique. Ce rapport décrit les méthodes d'isolement des champignons, des bactéries, mais aussi ont été isolés en utilisant ces méthodes en remplaçant les médias appropriés pour les bactéries. Notre méthodologie devrait s'avérer utile pour des études portant répartition des films de plastique intacts ou produits pour lesquels matières premières en plastique sont soit inconnu ou n'est pas disponible. Cependant, notre approche ne fournit pas une méthode quantitative pour comparer les taux de dégradation BDM.

Introduction

La dégradation a toujours été considéré comme un attribut indésirable de polymères plastiques, parce répartition raccourcit produit durée de vie et de durabilité. Récemment, la sensibilisation aux problèmes de l'environnement présentés par les déchets plastiques dans l'environnement naturel 1,2,3 a fait plastiques biodégradables une alternative intéressante aux matériaux plastiques conventionnels. Dégradation (définis comme des changements structurels, la fragmentation et la réduction de la masse moléculaire, l'intégrité et la force 4,5) se fait par une série d'événements, y compris les processus abiotiques (stress thermique, photo-oxydation, l'hydrolyse, l'érosion et le stress mécanique), et la dégradation biologique 6. Bien que les processus abiotiques peuvent changer la taille des fragments et les caractéristiques des matières plastiques, les microorganismes sont nécessaires pour leur minéralisation ultime à l'eau et le dioxyde de carbone (dans des conditions aérobies) et / ou le méthane (dans des conditions anaérobies).

Une niche importante pourplastiques biodégradables existent dans l'agriculture, où les paillis de plastique sont utilisés pour empêcher la croissance des mauvaises herbes, conserver l'humidité du sol et à augmenter la température du sol 7,8. Des centaines de milliers d'hectares dans les seuls États-Unis sont recouverts de paillis de plastique 9, y compris paillis composé de plastique biodégradable. Après une saison de croissance des cultures, les options pour l'élimination des paillis biodégradables (BDM) comprennent l'élimination dans un site d'enfouissement, l'incinération de récupération d'énergie 10, la dégradation par le compostage ou la dégradation dans le sol après le labour 11. Parmi ceux-ci, le sort moins de main-d'œuvre laboure BDM dans le sol, mais sans dégradation efficace et la minéralisation pendant les mois non cultivées (généralement en hiver), des fragments de plastique pourraient rester et interférer avec l'équipement agricole pendant le labour de printemps et la plantation, et persister dans l'environnement où ils ont un impact significatif faune, la flore, et microbiote 1,2,3,10.

12. En hiver, les températures du sol à la plupart des endroits seraient inférieurs à l'une de ces températures, résultant vraisemblablement de l'activité microbienne encore plus faible et, par conséquent, moins de minéralisation. En plus de ralentir la vitesse de dégradation, l'utilisation abusive du terme «biodégradable» a conduit à se méfier de ces produits par les consommateurs 13,14, y compris dans le secteur agricole. La biodégradation est la conversionde polymères à dioxyde de carbone (et / ou du méthane) et de l'eau 14 par des micro-organismes d'origine naturelle 4. Par conséquent, la biodégradation doit être mesurée chimiquement; l'association physique des micro-organismes avec un substrat n'implique pas la dégradation microbienne de ce matériau.

Dans le cadre d'un effort pour examiner l'utilisation durable de la BDM dans l'agriculture, cette étude se concentre sur la découverte de micro-organismes indigènes sur les terres agricoles qui colonisent et dégradent BDM disponibles dans le commerce. Méthodes d'essai normalisées ont été publiés pour mesurer chimiquement la décomposition des plastiques biodégradables par abiotiques et biologiques 15,16,17. Cependant, ces méthodes ne tiennent pas compte dégradation des plastiques par des espèces microbiennes individuelles, ou fournissent des méthodes pour leur isolement. La méthode ressemble à présent plus étroitement méthodes normalisées visant à évaluer plastiques pour la résistance à la dégradation microbienne après inoculation des échantillons avec des spores fongiques18,19.

Lorsque les formulations de matières plastiques sont connues, et une source de la charge d'alimentation est disponible, le plastique en poudre peut être mis en suspension dans un milieu et la dégradation de la gélose à base déterminés par visualisation des zones de compensation 13. Ce procédé a déjà été utilisé pour identifier les micro-organismes qui dégradent les polymères tels que le polyuréthanne, le poly-20 (butylène succinate-co-adipate) 21, et le poly (acide lactique) 22. Une méthode similaire consiste à suspendre plastique pur en poudre dans un milieu liquide où la matière plastique est la seule source de carbone 20,23. Bien que ces méthodes ont l'avantage d'un système défini, ils imitent mal dégradation in situ de la BDM. Tout d'abord, la surface est répartie différemment parce BDM ne sont pas dispersés en petites particules à travers la matrice du sol, mais plutôt vendus et utilisés comme films. Deuxièmement, la composition chimique du BDM est différente de polymères purs. BDM contiennent généralement des additifs tels quedes charges, des plastifiants, et des colorants, ainsi que ces additifs peuvent influer sur la croissance microbienne, et de ce fait, le taux de minéralisation. Pour cette raison, et parce que la composition de certains films commerciaux dans cette étude étaient propriétaires, film plastique, dans sa forme utilisable sur le terrain a été utilisé pour isoler les champignons et les bactéries. Pour plus de simplicité, les méthodes suivantes sont décrites uniquement pour les champignons, avec des modifications ont noté le cas échéant pour isolements bactériens.

Dans une étude récente 24, trois BDM disponibles dans le commerce et un film expérimental ont été utilisés sur des sites agricoles dans trois régions différentes des États-Unis pour une saison de croissance, et ensuite placés dans mesh (250 microns) sacs et enterrés pour un hiver dans le sol aux mêmes sites. Les ouvertures de maille 250 microns permettent hyphes de pénétrer tout en excluant les racines et la plupart faune du sol, et de minimiser l'empiètement des sols 25,26. matériaux en nylon prévenir la dégradation du sac dans le sol. Après excavation, fisolats Ungal ont été récupérés à partir de morceaux BDM et évalués pour la croissance sur un milieu minimal sans une source de carbone à l'exception de l'agar-agar et de 5 cm x 5 cm carrés de surface désinfectée du nouveau film, encore utilisé de BDM qui a été pré-désinfectés. La plupart des plastiques utilisés comme films ne peuvent pas être passés à l'autoclave sans perte de l'intégrité, de la lumière UV a été utilisé afin de tuer toutes les cellules microbiennes résidant sur les matières plastiques. ISO 846 19 recommande surface désinfestation dans 70% d'éthanol et séchage ultérieur, mais si vous utilisez cette méthode, on doit s'assurer qu'aucun composant ou additif du film subit les conséquences négatives de l'éthanol. Depuis BDM vraisemblablement sont fabriqués pour résister à la lumière du soleil, les UV a été choisie comme méthode de décontamination.

Les isolats qui poussaient sur BDM morceaux mieux que sur un milieu minimal seuls ont été retenus pour une étude plus approfondie. Agar, un polysaccharide produit par les algues marines, est utilisé pour solidifier les milieux microbiens, car il n'est généralement pas utilisé métaboliquement par l'agriculture et médicalement pasmicro-organismes capables, mais enzymes d'agar-hydrolyse ont été isolés à partir de bactéries marines 27 et bactéries d'agar-hydrolyse ont également été isolées du sol 28. Polymères BDM et de l'agar sont tous deux censés être des substrats rares pour les enzymes sécrétées par des champignons du sol, qui n'ont pas évolué dans des environnements qui contiennent ces polymères en tant que sources potentielles de substances nutritives, mais les deux substrats sont présents dans le bio-essai sur plaque décrit ci-après (étape 7). Les champignons qui utilisent BDM mais pas agar comme une source de carbone peuvent être différenciés des champignons qui utilisent agar seulement, en comparant la croissance sur gélose solidifiée contenant i) sans ajout d'une source de carbone à l'exception agar (contrôle négatif), ii) BDM films (expérimental) et iii) le glucose (témoin positif). Croissance de tous les isolats est prévu sur un milieu minimal ainsi glucose; champignons qui ne découlent pas de plaques contenant du glucose peut ne pas être capable d'une croissance sur le milieu minimal notamment utilisé dans l'expérience. Potential BDM dégradeurs devrait croître sur une gélose solidifiée milieu minimum + film BDM mieux que leur croissance sur gélose solidifiée milieu minimal seul. Les champignons qui poussent sur des plaques de milieu minimal sont agar-dégradeurs ou oligotrophes, et devraient également croître sur la gélose des films BDM dans des plaques d'essais biologiques, mais pas sur les films eux-mêmes (à moins qu'ils serendipitously également dégrader les polymères BDM).

Pour éliminer la possibilité de voir la croissance microbienne en raison de l'utilisation de l'agar et non de BDM, nous avons suivi notre analyse initiale de la colonisation BDM sur des plaques d'agar avec un essai biologique en milieu liquide défini (étape 9). Morceaux BDM représentés source de carbone seulement connu dans les tubes à essais biologiques.

Après l'examen initial, et sur la relance de stocks de glycérol des isolats, certains formé mycélium peu mais visible dans un milieu défini liquide contenant aucune source de carbone connu. Ces résultats suggèrent que certains des isolats étaient acquises oligotrophs - organismes qui poussent en piégeant très petites quantités de carbone, d'azote et d'autres nutriments dissous soit dans le milieu aqueux ou existant comme volatiles dans l'air 29,30,31. L'identification des espèces par 18S analyse de l'ADN ribosomal soutenu ce point de vue, comme la plupart des isolats appariés genres fongiques précédemment rapporté exposer oligotrophie 32. Oligotrophes, qui sont communément saprophytes, nécessitent un large éventail de capacités métaboliques pour l'utilisation du substrat dans une variété d'environnements 30. Ainsi, il n'est pas surprenant que les mêmes champignons, nous isolées à partir de BDM (nécessitant vraisemblablement capacités enzymatiques inhabituelles) ont démontré des capacités oligotrophes, et sont capables de croître sur les traces de contaminants tels que les huiles de la peau à partir des empreintes digitales, la poussière ou les volatiles de traces dans l'air. En raison de l'isolement des populations oligotrophes, nous avons conclu que la croissance sur une surface de BDM seul ne pouvait pas être utilisée pour déduire BDM panne. Les méthodes décrites aux présentes reflètent nos efforts pour screen colonisateurs BDM indigènes provenant des sols agricoles pour la rupture du BDM de bonne foi.

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Protocol

Cette procédure nécessite au moins plusieurs mois pour l'incubation des films BDM dans le sol, et plusieurs mois de tests biologiques séquentiels à la fois sur des plaques d'agar agar et frais, bouillon chimiquement définis pour évaluer la colonisation et de la dégradation. Différentes méthodes sont répertoriées dans l'ordre où ils seront effectués.

1. L'incubation de Films BDM dans le sol

Incorporer les films BDM dans le sol dans des conditions mimant celles dans lesquelles ils seront appelés à se dégrader. Acquérir 400 g (soit l'équivalent en poids sec) de sol et résident en sandwich une cm x 10 cm BDM 10 avec le sol à l'intérieur de 13 x 13 cm de maille de nylon (250 microns) de sac. Fermer avec un fil de nylon. Les temps d'incubation sont à la discrétion de l'expérimentateur. Surveiller et / ou modifier les paramètres relatifs à l'activité microbienne (par exemple la température du sol, des nutriments et de l'humidité) à intervalles réguliers tout au long de la période d'incubation, le cas échéant.

2. Préparation des milieuxet réactifs

Pour éviter d'introduire des sources d'éléments nutritifs par inadvertance dans les médias et les tubes de culture, utiliser des produits chimiques de qualité réactif, tubes de culture nouvellement acquis de type I ultra-pure (par exemple NANOpure) d'eau, et la verrerie rigoureusement à la chaux pour les médias de mélange. Éviter la contamination croisée des réactifs - il est préférable d'utiliser un ensemble dédié de réactifs et la verrerie à cet effet. Notez qu'il est possible que les champignons peuvent être isolées dont la croissance est inhibée par un ingrédient dans les réactifs indiqués ci-dessous. Si cela se produit, certains d'optimisation peut être nécessaire.

  1. Avant de prendre médias, laver toute la verrerie nécessaire avec un détergent de laboratoire et ensuite de l'acide de lavage (par exemple tremper toute la nuit dans HCl à 10%). Rincer au moins douze fois à l'eau distillée et deux fois dans de l'eau ultrapure. Couvrir toute la verrerie avec du papier d'aluminium propre pour exclure la poussière. Porter des gants et évitez de toucher l'intérieur et les bords des navires à exclure les huiles de la peau avec les doigts. Pour éviter toute savon résidencerayures en verre qui facilitent la colonisation, les champignons de culture dans des tubes de culture en verre nouvellement acquises (non utilisé), rincé et stérilisé à l'autoclave et casquettes cotisations et.
  2. Potato dextrose agar (PDA) est utilisé pour l'isolement initial des champignons du sol, et pour l'établissement de colonies isolées simples et la production d'inoculum pour le stockage à long terme. Préparez le support conformément aux instructions du fabricant et après l'autoclavage (lorsqu'il est refroidi à 50 ° C), ajouter du chloramphénicol (à partir de 10 mg / ml de solution mère dans de l'éthanol) à une concentration finale de 30 pg / ml, d'exclure les bactéries. Ce milieu est maintenant désigné comme PDA chl 30.
  3. Milieu minimal fongique (FMM) est utilisé comme une base solide pour BDM inoculés avec un potentiel dégradeurs plastique fongiques. En plus de la gélose (lorsqu'il est utilisé pour solidifier le milieu), il est exempt de carbone. Pour environ 800 ml d'eau désionisée H 2 O, ajouter 6,0 g NaNO3, 0,52 g de KCl, 0,52 g MgSO 4 · 7H2 O, 1,52 g KH 2 PO 4, et 1 solution mère d'oligo-éléments de ml Hutner (2,2 g ZnSO 4 · 7H 2 O, 1,1 g de H 3 BO 3, 0,5 g MnCI2 · 4H 2 O, 0,5 g FeSO4 · 7H 2 O, 0,16 g CoCI2 · 5H 2 O, 0,16 g CuSO 4 · 5H 2 O, 0,11 g (NH 4) 6 Mo 7 O 24 · 4H 2 O et 5,0 g Na 4 EDTA dans 100 ml d'eau distillée H 2 O 33 , 34. Ajuster le pH à 6,5 en utilisant NaOH, et porter le volume à 1 L. Pour l'essai biologique liquide, filtre stériliser FMM pour éviter la précipitation des sels. Si milieu solide est souhaitée, ajouter 16 g d'agar et autoclave. Quand agar semi-solide est nécessaire, réduire agar à 8 g / L. Quand on le refroidit à 50 ° C, ajouter du chloramphénicol à une concentration finale de 30 pg / ml. Ce milieu est maintenant désigné comme FMM chl 30. Comme un contrôle pour s'assurer que les isolats fongiques se développent dans ce milieu, FMM devrait être made comme ci-dessus mais contenant 10 g de glucose par litre. C'est ce qu'on appelle glucose milieu minimal 35 (GMM).
  4. Solution tampon phosphate 36 (PBS) est utilisée pour suspendre les particules de sol et des cellules microbiennes dans la dilution en série initiale de BDM sol-exposées. Pour faire du PBS, ajouter 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, et 0,24 g de KH 2 PO 4 à 800 ml d'eau distillée. Dissoudre les sels et ajuster le pH à 7,4 avec HCl. Amener le volume total à 1 L avec de l'eau ultra-pure. Remplir des tubes de culture propres à 9,5 ml et 4,5 ml de PBS par tube. Autoclave.
  5. 30% de glycérol (v / v) est utilisé pour suspendre cellules congelées bactéries et de levures, des spores et le mycélium fongique au cours du stockage à -80 ° C. Faire de cette solution dans de l'eau ultra-pure. Autoclave.
  6. 0,01% (v / v) de Triton X-100 est utilisé pour suspendre les spores fongiques, le détergent agit comme un agent mouillant non-toxique pour les spores hydrophobes. Dissoudre 100 pi Triton X-100 À 1 L d'eau ultra-pure. Autoclave.
  7. Un tampon phosphate 0,1 M de sodium (pH 7,2) est utilisé en tant que solvant pour le glutaraldéhyde pendant SEM fixation. Mélanger 68,4 ml de 1 M Na 2 HPO 4 et 31,6 ml de 1 M NaH 2 PO 4 et porter le volume total à 1 L avec de l'eau ultra-pure 36.

3. Préparation des matériaux d'essais biologiques: Décontamination des surfaces de BDM Films

  1. Parce que les restes de contaminants tels que le papier et le ruban sur les ustensiles de coupe sont des sources potentielles de carbone, utiliser des ciseaux nouvellement achetés ou des lames de rasoir propre, et une surface inorganique pour la coupe. Portez des gants pour éviter la contamination des films BDM avec des huiles de la peau. Couper films BDM en petits carrés (4,25 x 4,25 cm). Ce carré de la taille s'inscrit dans un x 15 mm plaque standard 100 Petri.
  2. Utiliser une lampe UV germicide (onde d'émission = 253,7 nm) pour décontaminer les films BDM. Cette lampe se trouve souvent dans une enceinte de biosécurité standard. Assurez-vous que lorsquela lumière UV est en marche, il n'y a pas d'écoulement de l'air extérieur dans l'enceinte de biosécurité qui pourraient contaminer les films BDM.
  3. Les surfaces mouillées à l'intérieur du capot avec EtOH à 70% et laisser fonctionner le ventilateur pendant 15 min pour chasser l'air. Ensuite, fermez le châssis et décontaminer la surface du capot avec UV pendant 2 heures.
  4. Placez les films BDM dans la hotte décontaminé, dans les rangées. Laisser la lumière UV pour briller sur des films pendant 2 heures.
  5. Utilisez un chiffon propre, pinces stérilisées pour retourner les films BDM. Commencez par le rang et le travail à la rangée arrière pour minimiser le temps que les mains et les bras sont directement au-dessus des surfaces de BDM nouvellement décontaminés. Lorsque retournement BDM, placez le côté nouvellement désinfectés à la baisse sur une zone propre exposé à la lumière UV, mais pas encore en contact avec le côté non désinfectées du film.
  6. Après 2 h de traitement UV de chaque côté, retirez les films BDM du poste de sécurité microbiologique avec une pince stérile, travailler à nouveau à partir de l'avant vers l'arrière pour éviter de mettre les mains et les bras plus déjà décontaminationfilms NAT. Placez les films BDM dans des récipients stériles, sèches, couvertes comme béchers recouvert de papier aluminium. Stocker à température ambiante dans l'obscurité.

4. Configuration des essais biologiques de la plaque

Effectuez toutes les étapes d'une hotte de transfert stérile en utilisant une technique aseptique.

  1. Disposer les morceaux de BDM UV-désinfectées sur la surface des plaques de gélose. Ensemble descendre un premier angle, et à faire doucement le reste du rouleau carrée en contact avec l'agar-agar. Éviter les rides. Certains films seront forment les rides que pendant le stockage, ce qui est inévitable. En particulier des films minces peuvent nécessiter l'utilisation de deux pinces afin de jeter le morceau plat.
  2. Placer les perles de semi FMM chl 30 gélose au sommet de la feuille de plastique pour fournir une eau et source de nutriments pour la colonisation initiale de plastique hydrophobe. Perles ne sont pas nécessaires pour les films perméables à l'eau. Re-fondre l'agar-agar dans le micro-ondes, et d'utiliser une micropipette pour transférer quatre gouttes 10 pl de l'agar fondu sur le paillis (un dans chaque corner). Ne touchez pas la pointe de la pipette directement sur le paillis en soit crevaison. Ne pas dépasser 10 pi par goutte, parce que l'excès de poids sur le paillis plastique peut tirer de la surface de l'agar lorsque les plaques sont inversés.
  3. Laissez les plaques sont assis du côté droit avec des couvercles sur la nuit pour solidifier complètement, puis stocker manches scellés agar-side up à 4 ° C dans l'obscurité. Lorsque vous êtes prêt à exécuter le test biologique (étape 7), utilisez i) une plaque de FMM chl 30 (contrôle négatif), ii) une plaque d'essai biologique contenant quatre 10 gouttes ul de semi FMM chl 30 sur film plastique, et iii) une plaque d' GMM (témoin positif). De cette façon, quatre répétitions de chaque isolat peut être testé par plaque de milieu.

5. Configuration des essais biologiques liquide

  1. Suivez les instructions pour la coupe de BDM à l'étape 3.1. Avant de couper les films plastiques pour l'essai biologique liquide, choisir une taille qui s'adapte dans le tube de culture.La surface nécessaire pour atteindre une masse uniforme entre plusieurs types de plastique dépendra de l'épaisseur du film. Nous avons constaté que les pièces équivalentes à 0,0175 g s'intègrent bien dans 15 x tubes de culture de 150 mm.
  2. Surface-décontaminer films avec de la lumière UV comme décrit dans l'étape 3 ci-dessus.
  3. Pour chaque répétition d'une microbienne isoler, préparer trois tubes pour l'inoculation: i) 5 ml FMM contenant un fragment BDM de la taille prédéterminée (expérimental), ii) 5 ml FMM sans source de carbone (contrôle négatif), et iii) 5 ml GMM (témoin positif). En outre, préparer reproduire tubes de FMM contenant chacun BDM à tester, mais ne pas inoculer eux. Ces tubes de contrôle ne révèle aucune croissance microbienne résultant de la contamination.

6. Isolement des champignons

Incubation du sol suivant et l'enlèvement de l'échantillon, les champignons sont isolés de la terre qui adhère aux films BDM. Si vous le souhaitez, les bactéries peuvent simultaneously être isolé avec la même méthode utilisant les médias appropriés pour l'isolement des bactéries du sol, tels que 1/10X diluée tryptique agar de levure de soja additionné de 50 pg / ml de cycloheximide à dissuader la croissance fongique 37. Quand milieu défini est nécessaire pour isolements bactériens dans les étapes 5 et 7, M9 38 (plus cycloheximide) est un bon choix.

  1. Avant le traitement de l'échantillon, préparer PBS et PDA chl 30. Permettre PDA chl 30 plaques à sec (non ensachées) à température ambiante pendant environ 24 heures pour éliminer la condensation sur les paupières et la surface de la gélose. Pré-étiquette PDA chl 30 plaques.
  2. Creuser des sacs contenant des morceaux BDM de lieux de sépulture choisi à l'étape 1. Expédier et entreposer à 4 ° C pas plus de 48 heures après l'extraction du sol.
  3. Aide d'une spatule et pince stérile, retirez délicatement le sol jusqu'à ce plastique est exposée, mais ne pas brosser le sol qui s'accroche à la surface du film BDM. Couper film BDM de 1 cmDeux morceaux jusqu'à 0,5 g de matériau est récupéré pour chacun des quatre répétitions totales. Transférer 0,5 g films BDM et le sol attachés à des tubes de 25 ml de culture contenant 9,5 ml de PBS. Si le paillis est complètement dégradé ou un contrôle du sol seulement est en cours de traitement, on ajoute 0,5 g de sol à la PBS, si possible, choisir des morceaux qui sont encore décolorée par le paillis résiduel.
  4. Vortex les tubes de culture contenant 9,5 ml de PBS et 0,5 g paillis pendant 30 secondes à une vitesse élevée, Soniquer dans un bain-marie à ultrasons pendant 10 min, et le vortex à nouveau pendant 30 secondes. L'agitation est destiné à briser biofilms, supprimer physiquement les cellules intégrées dans ou en adhérant à des morceaux de paillis et de créer une suspension homogène.
  5. Préparez-vous à diluer en série la solution PBS / sol pour obtenir des unités formant des colonies individuelles à partir de placages. Pour chaque échantillon, placer dans un capot d'un tube de culture à flux laminaire remplie de 4,5 ml de PBS stérile. Pour chaque échantillon, remplir trois puits d'une plaque de 96 puits en puits profond rempli avec 450 pi de PBS.
  6. La suspension de plastique / sol d'origine (0,5 g de paillis et 9,5 ml de solution PBS) représente un 5,0 x 10 -2 dilution des matières microbienne adhérant au plastique. Ajouter 0,5 ml d'une suspension à partir de ce tube d'origine à 4,5 ml de PBS stérile dans un tube de culture afin d'obtenir une dilution de 10 -3 x 5,0. Vortex pendant 30 secondes à grande vitesse. Ajouter 50 pi à 450 pi de PBS dans la plaque de 96 puits. Répétez l'opération pour tous les échantillons / doublets. Utiliser une pipette multicanaux de diluer les échantillons en masse. Mélanger chaque nouvelle dilution par pipetage de haut en bas dix fois. Changer les cônes entre dilutions. Faire des dilutions allant jusqu'à 5,0 x 10 -6.
  7. (Facultatif) Les isolats bactériens étaient plus abondants que les isolats fongiques dans des échantillons décrits ici, donc si isoler simultanément les bactéries, puis effectuer des dilutions en série jusqu'à 5 x 10 -8 à l'étape 6.6 ci-dessus.
  8. Uniformément répartie 100 ul de chacun des 5,0 x 10 -3 à travers le 5,0 x 10 -6des dilutions à travers la surface de la gélose de PDA chl 30 plaques avec stérilisés flamme tiges de verre bombées. plaques Garder debout pendant 30 minutes pour laisser tremper dans de liquide, puis sceller les plaques avec du Parafilm pour éviter évasion de spores des isolats non identifiés. Incuber les plaques inversées à 20 ° C dans l'obscurité pendant 5 jours pour permettre aux deux champignons rapides et une croissance lente de former des colonies.

7. Sélection initiale des champignons en plastique qui dégradent

Important: Toutes les cultures de ce point vers l'avant doivent être ouverts uniquement dans une enceinte de biosécurité (pas une hotte à flux laminaire) pour éviter la contamination de l'environnement avec des spores d'identité inconnue. Certains champignons du sol et les bactéries sont pathogènes humains potentiels.

  1. Examiner les boîtes de dilution contenant des colonies bien isolées. Sélectionnez une colonie qui ne touche pas une autre colonie.
  2. En utilisant une seule cure-dent stérile, toucher doucement une colonie, puis touchez l'agar de FMM (faite à l'étape 2.3 l'étape 4), et GMM (faite à l'étape 2.3) plaques, dans cet ordre. Pour inoculer billes d'agar au sommet de films plastiques, frottez doucement le cure-dent sur la surface du point d'agar-agar, puis glisser à travers le film plastique. Répétez l'inoculation de la même colonie source jusqu'à il ya quatre stries répétés sur chaque plaque.
  3. Répétez les étapes 7.1 à 7.2 jusqu'à plusieurs répétitions de chaque type de colonie visuellement uniques sont choisis dans chaque échantillon BDM.
  4. plaques de sceller avec du Parafilm, inverser, et incuber à 20 ° C dans l'obscurité pendant 5 jours.
  5. Identifier les isolats qui poussent sur BDM mieux qu'ils poussent sur FMM. Si la croissance n'est pas évidente, voir l'échantillon sous un microscope à dissection pour vérifier la colonisation ou de l'absence de celui-ci (Figure 1). Gardez le couvercle, si le couvercle a condensation, remplacer avec un nouveau couvercle, mais le faire dans l'enceinte de biosécurité.
  6. Une fois dégradeurs BDM potentiels sont sélectionnés, utilisent commeterile cure-dents pour gratter inoculum du champignon colonise le plastique lui-même, et sans stries pour l'isolement de colonies formant unités simples sur PDA chl 30 plaques.
  7. plaques de sceller avec du Parafilm et incuber PDA chl 30 plaques inoculées avec des isolats plastique dégradant à 20 ° C pendant 5 jours dans l'obscurité.
  8. Maintenant que les colonies isolées simples sont purifiés, assurez-vous qu'ils sont vraiment capables de coloniser les films plastiques testés. Recueillir inoculum (spores, des cellules de levure, ou hyphes) à partir d'une unité formant des colonies unique avec un cure-dent stérile. Répétez les étapes 7.2 à 7.5. Après 5 jours d'incubation à 20 ° C, d'examiner les plaques d'essais biologiques pour la croissance fongique. Si l'isoler pousse sur un film BDM mieux que cela pousse sur FMM dans les deux premier (7,5) et deuxième (7,8) essais, puis stocker l'isoler comme décrit ci-dessous à l'étape 8.

8. Stockage à long terme de dégradeurs plastique Dans l'ensemble, les isolats plastique qui dégradent seront testés dans l'essai biologique de plaque (7,5), re-purifié de simples unités formant des colonies isolées (7,6), testés dans l'essai biologique de la plaque à nouveau (7.8), et enfin, testés dans l'essai biologique liquide ( 09.01 à 09.05). Lors des tests, les isolats doivent être transférés dans un milieu frais tous les mois et les plaques de stock de travail conservés à 4 ° C dès que la croissance est suffisante visible. Isolats devraient également être stockées sous forme de stocks de glycérol à -80 ° C, et / ou sous forme de spores séchées sur des disques de filtre stérile à 4 ° C. Les deux méthodes de stockage sont décrits ci-dessous.

  1. Pour chaque isolat qui a grandi sur un film BDM mieux qu'il a grandi sur FMM dans les deux premier (7,5) et deuxième (7,8) essais biologiques de la plaque, préparer deux chl 30 plaques PDA avec deux ou trois disques de papier filtre stérilisés, d'environ 1 cm de diamètre , sur la surface. Inoculer ces deux plaques dela même colonie unique choisi à l'étape 7.8 ci-dessus. Faire une pelouse en répandant inoculum uniformément sur l'agar-agar pour maximiser la croissance. Sceller les plaques avec du parafilm et incuber à 20 ° C pendant 5 jours. Cette étape peut être lancée simultanément à l'étape 7.8 de l'efficacité.
  2. Le disque de filtre sur la surface de la gélose doit être recouverte de mycélium / spores. Retirez les disques de filtrage de la surface de la gélose avec des pinces stérilisées, et le placer dans un tube Eppendorf stérile. Air sécher les disques filtrants nuit à l'intérieur des tubes Eppendorf (avec le hors cap) dans une enceinte de biosécurité ou une autre, l'environnement sec et stérile avec la circulation d'air minimal pour éviter la contamination croisée. Puis sceller avec du Parafilm et conserver à 4 ° C.
  3. Utilisez un coton-tige stérile ou cure-dent pour récolter les spores et mycélium des plaques de gazon. Suspendre spores et des hyphes dans 30% de glycérol dans cryovials, flash-gel dans de l'azote liquide et conserver à -80 ° C.

9. Co strictesnfirmation d'utilisation Plastic via Liquid Bioassay

  1. Générer des spores fraîches et / ou des cellules avec lesquelles pour inoculer des cultures liquides: inoculer PDA chl 30 plaques avec des spores de potentiels isolats plastique dégradantes. Sceller les plaques avec du Parafilm et les incuber à 20 ° C jusqu'à ce que les spores fongiques sont visibles.
  2. Dans une enceinte de biosécurité, les spores de récolte par lavage de la plaque avec 0,01% de Triton X-100 (5 ml par 15 x mm plaque 100 Petri fonctionne bien) et frotter les spores (ou cellules de levure) de la surface avec une tige courbée en verre stérile . Aspirer spores (ou cellules) de suspension et de transfert dans un récipient stérile.
  3. Comptez spores ou de cellules avec un hématimètre et déterminer le volume approprié d'ajouter 5 ml de bouillon FMM pour un total de 1 x 10 6 spores / tube. Le volume doit être inférieure à 10 pl. Dilution des suspensions de spores concentrées dans 0,01% de Triton X-100 peut être nécessaire.
  4. Dans une hotte de transfert stérile, inoculer des tubes de culture préparés 6 spores (ou cellules de levure). Sceller les bouchons avec Parafilm pour éviter toute fuite de spores, en particulier pour les isolats non identifiés. Incuber dans l'obscurité à 20 ° C et observer des échantillons hebdomadaires de croissance.
  5. La croissance du mycélium de champignons sur les films plastiques peuvent être visibles dans la première semaine après l'inoculation, en particulier sur les bords des films plastiques. Pour levure planctoniques (comme en témoigne nuageux médias), la croissance peut être contrôlée par des lectures de densité optique à 600 nm. Parce que les champignons sont susceptibles de joindre directement à la pellicule plastique, la croissance peut être évaluée à l'oeil, et peut être confirmé par microscopie optique et / ou la microscopie électronique à balayage (MEB).
  6. En FMM-seuls contrôles, chercher des taches blanches minuscules qui sont trop petits pour enregistrer un changement de densité optique en utilisant des méthodes spectrophotométriques. Ces taches peuvent être aspirés avec une pipette Pasteur et observés par interférence (DIC) microscopie différentiel. Taches sont souvent identifiables précisionpitate, mais dans certains cas, ils peuvent être massifs de l'inoculant initial qui avait germé mais pas considérablement augmenté.
  7. Utilisez des observations visuelles et microscopique de comparer la colonisation des échantillons expérimentaux et les contrôles, et d'attribuer une note à la croissance de chaque échantillon de film de BDM. Parce que beaucoup de BDM sont de couleur foncée et permettre l'observation minimal par microscopie sauf sur les bords, et l'épaisseur de film interdit observation sous une lentille à immersion d'huile, SEM est utile pour estimer i) la présence de la croissance microbienne, par exemple via le système de notation décrit dans Tableau 1, et ii) l'ampleur de la dégradation BDM.

10. SEM Préparation des échantillons

  1. Utilisez propres, ciseaux stériles pour couper des petits morceaux de BDM à partir d'échantillons répétés. Fixer BDM par immersion dans 2,5% de glutaraldéhyde dans un tampon de 0,1 M phosphate de sodium (pH 7,2) pendant 24 à 48 h.
  2. Alors que la fixation se produit, déshydrater l'éthanol pur à 100% en ajoutant 5-10% volume 3 Å tamis moléculaire (activée dans une étuve à 175-260 ° C et refroidi dans un dessiccateur), et laisser reposer à température ambiante pendant la nuit pour assurer la déshydratation totale.
  3. BDM plonger dans un tampon phosphate 0,1 M de sodium (pH 7,2) pendant quatre lavages de 15 min chacun.
  4. BDM plonger dans l'eau ultra-pure pour trois lavages de 5 min chacune.
  5. Déshydrater les échantillons BDM dans une série d'éthanol, immersion pendant 20 minutes à chaque concentration: 50%, 70%, 80%, 90%, 95% et 100%. Rincer BDM deux fois plus dans l'éthanol à 100% pendant 20 minutes pour rincer.
  6. Échantillons soumis à un séchage au point critique et revêtement par pulvérisation.

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Representative Results

Dans une étude récente 24, quatre répétitions de chacun des trois BDM disponibles dans le commerce étiquetés «biodégradable», plus un film expérimental et un contrôle plastique conventionnel, ont été placés sur le sol comme paillis pour la production de tomates au printemps 2010 à Mount Vernon, WA, Knoxville, TN, et Lubbock, TX. À l'automne de 2010, MBD places de cinéma ont été découpés dans chaque résisté paillis en quatre parcelles répétées et terre natale a été retiré directement du dessous de la zone où l'échantillon de paillis avait été excisée. Chaque carré surmonté BDM a été pris en sandwich dans le sol à l'intérieur d'un sac en filet de nylon comme décrit à l'étape 1. Un sol ne contrôle a également été inclus. Sacs ont été ensevelis sous 7,5 cm de sol dans les mêmes parcelles et les lignes précédemment couverts par le paillis, et laissés en place jusqu'à ce que le labour du printemps 2011, sept mois plus tard. Sacs ont ensuite été levées dans les parcelles avec une pelle, placés dans des sacs en plastique zip-lock, et expédiés au laboratoire sur des packs de glace pour une livraison le lendemain.

<p class = "de jove_content"> nous rapportons ici les résultats représentatifs de notre étude. Champignons du sol indigènes ont été isolées les unes des BDM sur les trois sites, pour un total de 54 isolats. Nous décrivons isolats de deux des produits commerciaux utilisés sur un site (Mount Vernon). Un des produits est un plastique biodégradable appelé BioAgri. Ce film noir est étiqueté comme «base d'amidon" (BioAgri, Palm Harbor, Floride) et fabriqué à partir de Mater-Bi bioplastique par Novamont (Terni, Italie). Mater-Bi est un mélange de «amidon de maïs, et les polymères biodégradables obtenus à la fois à partir de matières premières renouvelables et des matières premières fossiles" ( http://www.novamont.com/default.asp?id=505 ). L'autre produit n'était pas en plastique, mais plutôt un "matériau semblable à du papier fabriqué à partir de fibres de cellulose spécialement ingénierie" brun (WeedGuard plus, le soleil Paper Co, Aurora, CO); ( http://www.weedguardplus.com/faqs.php ). Ce proconduit l'origine a été inclus comme témoin et la dégradation de ses composants cellulosiques était attendu.

En utilisant le bio-essai sur plaque décrit ici, trois isolats BDM dégradant potentiels de WeedGuard Plus et trois du BioAgri ont été récupérés. Ces isolats ont été soumis à l'essai biologique liquide (étapes 9.1 à 9.7 ci-dessus) en trois exemplaires. Bien que certains croissance fongique était visible le long des bords de BDM après une semaine dans l'essai biologique liquide, les échantillons ont été incubés pendant 68 jours avant la récolte et dernière observation. MEB, hyphes ont été observés sur tous les échantillons sauf XX et YY, où nous avons observé des cellules en forme de tige (tableau 2). Parce XX et YY poussent en forme de levure sur PDA chl 30, cette observation était attendue.

Pour les isolats de WeedGuard Plus, aucune croissance n'a été observée dans les FMM-seuls contrôles. La dégradation la plus BDM a été observée dans les échantillons colonisés par Isoler SS. Dans le contro non inoculéls pour le paillis WeedGuard Plus (figure 2A), des éléments trachéaires résiduelles des fibres d'origine végétale ne sont détectables que légère infectantes marquage vu en rangées sur une partie des fibres. Bien que les hyphes ont été observées dans les trois échantillons inoculés, des éléments de trachée étaient clairement visibles seulement dans les échantillons SS (figure 2B), ce qui suggère que la digestion de matière cellulosique a révélé les éléments trachéaires lignifiées dessous. Isoler SS a été provisoirement identifiée par l'ADN ribosomal 18S comme sordariomycète dans les Sordariales de commande.

Pour les isolats BIOAGRI, pas de croissance significative a été observée dans les FMM-seuls contrôles. Taches blanches simples visibles sur tourbillonnant les tubes de culture des isolats VV et ZZ ont été observées par microscopie DIC. Pour isoler VV, la paille était une masse de spores (non représenté), vraisemblablement résiduelle de l'inoculation initiale. Pour isoler ZZ, la masse était composée de maille lâche d'hyphes environ 0,2 mm de diamètre, Ce qui suggère que l'inoculum de spores d'origine avait germé, mais n'avait pas augmenté au-delà de la masse illustré à la figure 3A.

Dans les témoins non inoculés pour le paillis BioAgri (figure 3B), on observe une texture bosselée. L'identité des traits blancs est inconnue, mais ils sont absents dans un film colonisée par Isoler VV (figure 3C). Tant les particules blanches et des bosses ont disparu dans un film colonisée par Isoler ZZ (figure 3D). En outre, le dernier échantillon a révélé la présence de fissures uniforme sur toute la surface BDM. Isolats VV et ZZ ont été provisoirement identifiés en utilisant l'ADN ribosomal 18S comme Penicillium sp. (VV) et un sordariomycète dans les Hypocreales de commande (ZZ), respectivement.

Score Apparence de la croissance microbienne
0 Pas de croissance apparente à l'œil nu oupar microscopie
1 Spores germées, mais aucune croissance ultérieure apparent
2 Croissance couvrant ≤ 25% de la surface de test ou moyen
3 Croissance couvrant ≤ 50% de la surface de test ou moyen
4 Croissance couvrant ≤ 75% de la surface de test ou moyen
5 Croissance couvrant> 75% de la surface de test ou moyen

Tableau 1. Du système de notation pour la croissance microbienne du classement sur ​​des éprouvettes de films plastiques.

> Mycelia et chaînes de spores observées à bord
Isoler BDM

FMM seule commande (score)

FMM contenant 0,0175 g BDM (score et / ou comments)
Évaluation visuelle Microscopie optique SEM
SS WG 0 Les hyphes et fibres BDM indiscernables Les hyphes et fibres BDM indiscernables 2; hyphes visible
TT WG 0 Les hyphes et fibres BDM indiscernables Les hyphes et fibres BDM indiscernables 2; hyphes visible
XX WG 0 Bouillon nuageux Peu de cellules observées dans le bouillon 2, formant des bâtonnets sur la surface
VV BA 1 Beaux mycélium visible à bord 4; hyphes et conidiophores Prolific
YY BA 0 Bouillon nuageux Peu de cellules observées dans le bouillon 2, formant des bâtonnets sur la surface
ZZ BA 1 La croissance du mycélium de luxe sur toute la surface Les hyphes visible à bord 5; hyphes Prolific

Tableau 2. Observations et notes de croissance pour les isolats fongiques obtenus à partir résisté films BDM enterrés dans des parcelles de terrain à partir de l'automne 2010 jusqu'au printemps 2011 (7 mois) à Mount Vernon, plus tard inoculé sur un matériel de BDM inaltéré et incubée pendant 68 jours à 20 ° C dans l'obscurité . WG = WeedGuard Plus; BA = BioAgri. Voir le tableau 1 pour système de classement de la croissance.

fig1.jpg "/>
Figure 1. La colonisation de BioAgri paillis dans le bio-essai sur plaque décrite à l'étape 7, vu sous un microscope à dissection au grossissement de 20x.

Figure 2
Figure 2. Apparition de WeedGuard plus paillis après 68 jours dans FMM mais non vaccinés (A), ou inoculés avec isoler ZZ, provisoirement identifiée comme Chaetomium sp. (B). Notez les éléments de trachée (flèches) qui sont à peine distinguable en A, mais clairement vu dans B. Aucune croissance n'a été visible dans la FMM seule commande pour le Chaetomium isoler. Les échantillons ont été revêtus d'Au / Pd en utilisant un quorum SC7640 pulvérisation coucheuse et imagées à une tension d'accélération de 15 kV sur une Tescan VEGA 5136 MM SEM.


Figure 3. Apparition de paillis BioAgri après 68 jours dans l'essai biologique liquide. Un seul bouquet de spores germées a été observée dans la FMM seule commande pour l'ZZ isoler, provisoirement identifiée comme un Sordariomycètes (A). BioAgri paillis incubés dans FMM non inoculé (B), BioAgri paillis inoculé avec isoler VV, provisoirement identifiée comme Penicillium sp. (C), et BioAgri paillis incubée avec isoler ZZ (D). Les échantillons ont été revêtus d'Au / Pd en utilisant un quorum SC7640 pulvérisation coucheuse et imagées à une tension d'accélération de 15 kV sur une Tescan VEGA 5136 MM SEM.

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Discussion

La procédure décrite ici représente une technique de premier passage pour isoler dégradeurs BDM potentiels du sol, et a été utilisé avec succès pour isoler les champignons de BDM enfouis dans le sol pendant sept mois. Les champignons ont augmenté lorsque inocule sur un matériel de BDM frais du même type, ce qui indique que les champignons isolés étaient en effet colonisateurs, et que les films n'étaient pas d'inhibition de la croissance fongique. Isolement des champignons dégradant le plastique et les bactéries pourrait potentiellement conduire à leur utilisation, individuellement ou en combinaisons, des amendements à terre ou de compost où les plastiques doivent être dégradée.

Dans leur environnement terre natale, les espèces microbiennes ne sont pas isolés. Dégradeurs plastique et les organismes même oligotrophiques croissante sur BDM, mais en utilisant d'autres sources de carbone et d'énergie, pourraient être des espèces clés dans la colonisation de ces sources de nutriments récalcitrants. Dans un effort pour évaluer la dégradation BDM in vitro mais mieux imiter un vrai sol microbicidescommunauté al, la méthode décrite ici pourrait être modifié pour les tests de mélanges, plutôt que d'isolats purs, d'inoculum fongique et bactérienne.

Fait à noter, isole TT, XX, VV, et une dégradation minimale YY atteint des BDM, mais chacun a montré colonisation BDM visible à la fois dans la plaque et essais biologiques liquides. Ainsi, la colonisation visible ne signifie pas nécessairement une dégradation du polymère BDM. Isole TT, XX, VV et AA sont susceptibles de représenter oligotrophes que les éléments nutritifs obtenus à partir de l'environnement ainsi que de la BDM 29,30,31.

La preuve définitive que les champignons utilisent un BDM particulier en tant que source de carbone nécessite la mesure de la dégradation par des méthodes chimiques. dégagement de dioxyde de carbone pendant l'incubation de plastique avec les microorganismes indique respiration, et peut être utilisé comme une mesure indirecte de répartition polymère 15,16,39. Diverses méthodes sont utilisées pour obtenir des informations sur la taille et la structure des polymères, including chromatographie haute performance en phase liquide, la chromatographie par exclusion de taille, la calorimétrie différentielle à balayage, analyse thermique gravimétrique, la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire, la diffraction des rayons X, et la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier. Études visant à évaluer l'évolution CO 2 et la répartition polymère représenterait une progression logique de la procédure de sélection décrit ci-après. Cependant, les méthodes chimiques pour mesurer tailles polymères ne peuvent pas différencier la dégradation enzymatique de l'hydrolyse par les acides organiques sécrétées pendant la croissance des champignons et des bactéries. L'implication d'un mécanisme enzymatique de ventilation en matière plastique, il faudrait l'isolement d'une enzyme pure (s) capables de dégrader in vitro les polymères.

Les procédures décrites dans les présentes doivent être largement applicable pour toute matière plastique qui est utilisée dans une conformation du film, tels que les matériaux d'emballage des aliments ou des sacs à ordures. Ces procédures présentent plusieurs avantages. Tout d'abord, les films plastiques utilisés dans la bioAéssayé sont sous leur forme commerciale, disponible à l'achat sur le marché et la dégradation éventuelle de l'environnement. Une mise en garde est que les plastiques utilisés, comme les BDM récoltés après la saison de croissance de 2010 dans cette étude, peuvent être plus altérée que les nouveaux films plastiques utilisés dans l'tests biologiques in vitro. Avant l'attaque microbienne, UV, au vent, à l'abrasion par les particules du sol, l'hydrolyse chimique via des composants inorganiques du sol et la faune du sol contribuent à l'oxydation et à la fragmentation des polymères, altérant l'efficacité de l'action enzymatique sur BDM films 11. Un deuxième avantage est que cette méthode peut être utilisée si oui ou non les constituants de produits en plastique propriétaires sont connus et / ou à l'état pur pour les tests. Toutefois, une limitation de l'utilisation de matières plastiques avec les électeurs multiples ou inconnu est visible que la dégradation ne peut être définitivement attribué à un seul constituant. Par exemple, la dégradation de la figure 3D pourrait représenter l'amidon bENTILATION sans dégradation des polymères plus récalcitrantes à la "base d'amidon" film BioAgri. Dans une étude précédente sur la dégradation dans les sols de films plastiques d'amidon modifié, le taux d'évolution de dioxyde de carbone reflètent les quantités d'amidon et le colorant ajouté aux films, alors que les poids moléculaires des polymères inchangés soutenu l'hypothèse selon laquelle les additifs, pas des polymères, ont été utilisées par les micro-organismes 39. Enfin, cette procédure est axée sur la dégradation in vitro, fournissant ainsi un système plus définis que ceux actuellement en utilisation standard 15,16. On s'attend à ce que les échantillons dégradantes dans un milieu défini chimiquement se révélera plus facile à évaluer par des méthodes chimiques que les échantillons dégradant dans le sol ou compost. Ces évaluations sont l'orientation actuelle de ce travail.

Cette procédure a été un succès pour l'isolement des champignons dégradant le BDM et les bactéries de quatre types de films BDM à trois endroits aux États-Unis (TN, WA, et TX), avec différents nousather, les types de sol, et microbienne structures communautaires. Cette procédure prend un point de vue réductionniste, en se concentrant sur des isolats individuels avec la capacité de croissance sur, et la répartition des BDM. Cependant, les résultats soulignent l'importance de l'analyse de la communauté microbienne pour décrire les rôles distincts et liés des colonisateurs oligotrophes foi depolymerizers BDM bonne foi, et d'autres membres de la communauté, qui sont censés être important dans le but ultime de la dégradation complète de films plastiques de la biomasse, le gaz carbonique et / ou du méthane, et de l'eau.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Dr. Stephen Alderman, le Dr David Leaf et Erin Macri Nous tenons à remercier pour l'aide à la microscopie. Cette recherche a été financée par une subvention de l'Initiative de recherche sur les cultures spéciales NIFA, Grant Award SCRI-SREP USDA No. 2009-02484. Briana Kinash, Kevin Kinloch, Megan Leonhard Joseph McCollum, Maria Mc Sharry et Nicole Salé fourni une excellente assistance technique et des discussions approfondies.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potato Dextrose Agar Becton Dickinson 8X05491
Agar Fisher BP 1423-2
Chloramphenicol Acros Organics 200-287-4
Glutaraldehyde Electon Microscopy Sciences 16216-10 Toxic
Molecular sieve Fisher M-8892
Ethanol Pharmco-Aaper E200
Contrex Decon Labs, Inc. 5204
Parafilm M Pechiney Plastic Packaging S37440
Mineral salts for buffers and media Fisher Various Various vendors sell these reagents

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References

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Microbiologie Numéro 75 Biologie végétale sciences de l'environnement sciences de l'agriculture de la science du sol biologie moléculaire biologie cellulaire Mycologie champignons bactéries micro-organismes plastique biodégradable le paillis biodégradable plastique compostable paillis compostable la dégradation de plastique le compostage panne le sol l'isolement la culture
Isolement des microorganismes du sol autochtones ayant un potentiel de Breaking Down biodégradables paillis de plastique films utilisés dans l&#39;agriculture
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Bailes, G., Lind, M., Ely, A.,… More

Bailes, G., Lind, M., Ely, A., Powell, M., Moore-Kucera, J., Miles, C., Inglis, D., Brodhagen, M. Isolation of Native Soil Microorganisms with Potential for Breaking Down Biodegradable Plastic Mulch Films Used in Agriculture. J. Vis. Exp. (75), e50373, doi:10.3791/50373 (2013).

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