Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering av befintliga jorden Mikroorganismer med potential för Breaking Down Biologiskt nedbrytbara plast kompost filmer som används i jordbruk

Published: May 10, 2013 doi: 10.3791/50373
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 2, 2, 1
1Biology Department, Western Washington University, 2Washington State University Northwestern Research and Extension Center, 3Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University

Summary

Plast märkta filmer "biologiskt nedbrytbart" är kommersiellt tillgängliga för användning inom jordbruket som täckningsmaterial. Jordbearbetning utgör en attraktiv metod för slutligt omhändertagande, men nedbrytning under fältförhållanden är dåligt känd. Syftet med denna studie var att utveckla metoder för att isolera befintlig jord svampar och bakterier som koloniserar plast kompost film efter fältet begravning.

Abstract

Svamp infödda till jordbruksmark som koloniserat kommersiellt tillgängliga biologiskt nedbrytbara kompost (BDM) filmer isolerades och bedömas för potential att försämra plast. Vanligtvis när formuleringar av plast är kända och en källa för matarmaterialet finns tillgänglig kan pulveriserad plast suspenderas i agar-baserade medier och nedbrytning bestäms av visualisering av clearing zoner. Men härmar denna metod dåligt in situ nedbrytning av BDMS. Först BDMS inte sprids som små partiklar i hela jordmatrisen. Andra är BDMS inte säljs kommersiellt som rena polymerer, utan snarare som filmer som innehåller tillsatser (t.ex. fyllmedel, mjukgörare och färgämnen) som kan påverka mikrobiell tillväxt. De procedurer som beskrivs häri användes för isolat som förvärvats från jord begravda-marktäckning filmer. Svamp isolat som förvärvats från utgrävda BDMS testades individuellt för tillväxt på bitar av nya, disinfested BDMS som atop definierat medium innehållande ingen e kolkällaXCEPT agar. Isolat som växte på BDMS testades vidare i flytande medium där BDMS var den enda läggas kolkälla. Efter cirka tio veckor togs fungal kolonisering och BDM nedbrytning fastställdes genom svepelektronmikroskopi. Isolat identifierades via analys av ribosom RNA gensekvenser. Denna rapport beskriver metoder för svamp isolering, men bakterier också isolerades med hjälp av dessa metoder genom att ersätta medier lämpliga för bakterier. Vår metodik bör vara användbar för studier som undersöker nedbrytning av intakta plastfilmer eller produkter för vilka plast råvaror är antingen okänd eller inte tillgänglig. Men vår inställning inte ger en kvantitativ metod för att jämföra priser i BDM nedbrytning.

Introduction

Nedbrytningen har historiskt ansetts vara en oönskad egenskap av plast polymerer, eftersom nedbrytning förkortar span produktens livslängd och hållbarhet. Nyligen, har medvetenheten om miljöproblem presenteras av plastavfall i den naturliga miljön 1,2,3 gjort biologiskt nedbrytbara plaster ett attraktivt alternativ till konventionella plastmaterial. Nedbrytning (definierat som strukturförändringar, fragmentering och minskad molekylvikt, integritet och styrka 4,5) sker via en serie av händelser, både abiotiska processer (termisk stress, foto-oxidation, hydrolys, erosion och mekanisk påfrestning), och biologisk nedbrytning 6. Medan abiotiska processer kan ändra fragment storlek och egenskaper av plast, är mikroorganismer som krävs för deras slutliga mineralisering till vatten och koldioxid (under aeroba förhållanden) och / eller metan (under anaeroba förhållanden).

En betydande nisch förbionedbrytbara plaster finns i jordbruket, där plast täckningsmaterial används för att förhindra ogräs tillväxt, behålla markfuktighet och öka markens temperatur 7,8. Hundratusentals hektar i USA ensam är täckta med plast täckningsmaterial 9, inklusive täckningsmaterial består av biologiskt nedbrytbar plast. Efter en gröda växtsäsongen, alternativen för bortskaffande av biologiskt nedbrytbara täckningsmaterial (BDMS) omfattar deponering i en deponi, förbränning för energiåtervinning 10, nedbrytning via kompostering eller nedbrytning i jorden efter jordbearbetning 11. Av dessa är den minst arbetskrävande ödet plöjer BDMS i marken, men utan effektiv nedbrytning och mineralisering under icke-grödor månader (vanligtvis på vintern), kunde plast fragment kvar och störa jordbruksmaskiner under vårbruket och plantering, samt kvar i miljön där de avsevärt påverkar djurliv, växtliv, och microbiota 1,2,3,10.

12. På vintern skulle marken temperaturer på de flesta platser vara lägre än något av dessa temperaturer, förmodligen resulterar i ännu lägre mikrobiell aktivitet och följaktligen, mindre mineralisering. Förutom att sakta förstöras, har missbruk av termen "biologiskt nedbrytbar" ledde till misstro mot dessa produkter från konsumenter 13,14, inklusive de inom jordbruksindustrin. Biologisk nedbrytning är omvandlingenav polymerer till koldioxid (och / eller metan) och vatten 14 av naturligt förekommande mikroorganismer 4. Därför måste bionedbrytning mätas kemiskt, den fysiska anslutningen av mikroorganismer med ett substrat innebär inte mikrobiell nedbrytning av det materialet.

Som en del av ett försök att undersöka hållbar användning av BDMS inom jordbruket, denna studie fokuserat på upptäckt mikroorganismer infödda till jordbruksmark som koloniserar och försämra kommersiellt tillgängliga BDMS. Standardiserade testmetoder har publicerats för kemiskt mäta nedbrytningen av biologiskt nedbrytbar plast genom abiotiska och biologiska medel 15,16,17. Men itu med dessa metoder inte nedbrytning av plast av enskilda mikrobiella arter, eller tillhandahålla metoder för deras isolering. Metodiken häri mer liknar vanliga metoder för att utvärdera plast för resistens mot mikrobiell nedbrytning efter inokulering prover med svampsporer18,19.

När formuleringar av plast är kända och en källa för matarmaterialet finns tillgänglig kan pulveriserad plast suspenderas i agar-baserade medier och nedbrytning bestäms av visualisering av clearing zoner 13. Denna metod har tidigare använts för att identifiera mikroorganismer som bryter ned polymerer såsom polyuretan 20, 21 poly-(butylen-sam-adipat) och poly (mjölksyra) 22. En liknande metod innefattar suspendering ren pulveriserad plast i flytande medium där plasten är den enda kolkällan 20,23. Även om dessa metoder har fördelen av ett fastställt system, härma de dåligt in situ nedbrytning av BDMS. Det första är ytarean fördelas olika eftersom BDMS inte dispergeras i små partiklar genom markytan matrisen, utan snarare, säljs och används som filmer. Det andra är den kemiska sammansättningen av BDMS skiljer sig från rena polymerer. BDMS innehåller i allmänhet tillsatser, såsomfyllmedel, mjukningsmedel och färgämnen, och dessa tillsatser kan påverka mikrobiell tillväxt och därmed, graden av mineralisering. Av denna anledning, och eftersom sammansättningen av vissa kommersiella filmer i denna studie var egenutvecklade, plastfilm i sin fotoklar formulär användes för att isolera svampar och bakterier. För enkelhetens skull är metoderna nedan beskrivs endast svampar, med ändringar noterade vid behov för bakteriella isoleringar.

I en nyligen genomförd studie 24, var tre kommersiellt tillgängliga BDMS och en experimentell film som används vid jordbruks platser i tre olika regioner i USA för en växtsäsong, och placerades därefter i mesh (250 mikron) väskor och begravdes under en vinter i jord på samma platser. De 250 micron masköppningar tillåter svamphyfer att penetrera medan exklusive rötter och de flesta fauna jord, och minimera jord intrång 25,26. Nylon material förhindrar väska nedbrytning i mark. Efter schaktning, fungal isolat utvanns från BDM bitar och bedömdes med avseende på tillväxt på minimalt medium utan en kolkälla förutom agar och en 5 cm x 5 cm yta-disinfested kvadrat av ny, oanvänd BDM film som var pre-disinfested. De flesta plaster som används som filmer inte kan autoklaveras utan förlust av integritet, var så UV-ljus som används för att döda eventuella mikrobiella celler som finns på plasten. ISO 846 19 rekommenderar yta-insektsbekämpning i 70% etanol och efterföljande torkning, men om du använder denna metod, måste man se till att ingen komponent eller tillsats av filmen påverkas negativt av etanolen. Eftersom BDMS förmodligen är tillverkade för att tåla solljus, var UV valts som en saneringsmetod.

Isolat som växte på BDM bitar bättre än på minimalt medium ensam selekterades för ytterligare studie. Agar, en polysackarid som produceras av marina alger, används för att stelna mikrobiella medier eftersom det är normalt inte utnyttjas metaboliskt genom agrikulturellt och medicinskt intekunna mikroorganismer, men har agar-hydrolyserande enzymer isolerats från marina bakterier 27 och agar-hydrolyserande bakterier också har isolerats från jord 28. BDM polymerer och agar är båda förväntas vara sällsynta substrat för enzymer som utsöndras av jordsvampar, som inte har utvecklats i miljöer som innehåller dessa polymerer som potentiella näringskällor, men båda substraten är närvarande i plattan bioanalys som beskrivs häri (steg 7). Svampar som använder BDMS men inte agar som kolkälla kan skiljas från svampar som använder agar endast genom att jämföra tillväxt på agar stelnat-medium innehållande i) inget tillsatt kolkälla förutom agar (negativ kontroll), ii) BDM filmer (experimentell) och iii) glukos (positiv kontroll). Tillväxt av alla isolat förväntas på minimalt medium plus glukos; svampar inte uppkommer om glukos-innehållande plattor kanske inte förmåga att växa på den särskilda minimalt medium användes i experimentet. Potential BDM nedbrytare bör växa på agar stelnat-minimalt medium + BDM filmen bättre än de växer på agar stelnat-minimalt medium enbart. Svampar växer på minimalt medium plattor är agar-nedbrytare eller oligotrophs, och förväntas också växa på agar samband med BDM filmer i bioanalysresultaten plattor, men inte på de filmerna själva (om de inte serendipitously även försämra BDM polymerer).

För att eliminera möjligheten att se mikrobiell tillväxt till följd av utnyttjande av agar och inte av BDMS, följde vi vår första analys för BDM kolonisering på agarplattor med en bioanalys definierat buljongmedium (Steg 9). BDM bitar representerade den enda kända kolkällan i bioanalysen rören.

Efter den initiala screeningen, och vid återuppliva glycerolstamlösningar av isolaten, några bildade knapphändig men synligt mycel i flytande definierat medium innehållande ingen känd kolkälla. Dessa resultat antydde att vissa av de förvärvade isolaten var oligotrophs - organismer som växer genom sophantering mycket små mängder av kol, kväve och andra näringsämnen löses antingen i vattenmiljö eller befintliga som flyktiga ämnen i luften 29,30,31. Artidentifiering via 18S ribosom DNA-analys stödde denna uppfattning, eftersom många av de matchade isolat svamp släkten tidigare rapporterats uppvisa oligotrophy 32. Oligotrophs, som vanligtvis saprofyter, kräver ett brett spektrum av metabola funktioner för substrat utnyttjande i olika miljöer 30. Därför är det inte förvånande att samma svampar som vi isolerade från BDMS (förmodligen kräver ovanliga enzymatiska kapacitet) visade näringsfattiga kapacitet, och kunde växa på spårkontaminanter såsom hudfett från fingeravtryck, damm och flyktiga spår i luften. På grund av den isolering av oligotrophs, drog vi slutsatsen att tillväxten på en BDM ovansidan kunde inte användas för att härleda BDM sammanbrott. De här beskrivna metoderna återspeglar vår strävan att SCReen infödda BDM kolonisatörer från jordbruksmarker för bona fide BDM uppdelning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denna procedur kräver minst flera månader för inkubation av BDM filmer i marken, och ytterligare flera månader för sekventiella bioassayer både på agarplattor och agar-fri, kemiskt definierade buljong att bedöma kolonisering och nedbrytning. Enskilda metoder är listade i den ordning de kommer att utföras.

Ett. Inkubation av BDM filmer i jord

Införliva BDM filmer i marken under förhållanden som efterliknar de under vilka de kommer att förväntas att försämras. Förvärva 400 g (torrvikt ekvivalent) av inhemska jord och smörgås en 10 cm x 10 cm BDM med marken i en 13 x 13 cm nylonnät (250 micron) väska. Nära med nylontråd. Inkubationstider är på försöksledaren gottfinnande. Övervaka och / eller modifiera parametrar som är relevanta för mikrobiell aktivitet (t.ex. jordtemperatur, näringsämnen och fukt) med regelbundna intervall under hela inkubationstiden på lämpligt sätt.

2. Framställning av Mediaoch reagenser

För att undvika att införa näringskällor oavsiktligt in i media och rör kultur, använda reagens-grade kemikalier, nyinköpta rör kultur, typ I ultrarent (t.ex. nanopure) vatten, och stringent-tvättad glas för att blanda medier. Undvik korskontaminering av reagenser - det är bäst att använda en dedikerad uppsättning reagenser och glas för detta ändamål. Observera att det är möjligt att svampar kan isoleras vars tillväxt inhiberas av en ingrediens i de reagens som anges nedan. Om det inträffar, kan viss optimering krävas.

  1. Innan du köper media, tvätta all nödvändig glas med ett laboratorium rengöringsmedel och därefter syra-tvätt (t.ex. blöt över natten i 10% HCl). Skölj ett minimum av tolv gånger i destillerat vatten och två gånger i ultrarent vatten. Täck alla glas med ren aluminiumfolie för att utesluta damm. Använd handskar och undvik att vidröra insidan och kanterna av fartyg för att utesluta hudfett från fingeravtryck. För att undvika tvål Resimedlemsavgifter och repor i glas som underlättar kolonisation, kultur svampar i nyligen inköpta (oanvänd), sköljas och autoklaveras glasrör kultur och mössor.
  2. Potatisdextrosagar (PDA) används för den ursprungliga isoleringen av svampar från jord och för etablering av enskilda isolerade kolonier och generering av inokulum för långtidsförvaring. Förbered medier enligt tillverkarens instruktioner och efter autoklavering (vid kylning till 50 ° C), för att lägga till kloramfenikol (från en 10 mg / ml stamlösning i EtOH) till en slutlig koncentration av 30 pg / ml, utesluta bakterier. Detta medium är nu kallad PDA CHL 30.
  3. Svamp minimalt medium (FMM) används som en solid bas för BDMS ympade med potentiella svamp plast nedbrytare. Bortsett från agar (vid användning för att stelna mediet), är det kolfri. Till cirka 800 ml avjoniserat H2O, tillsätt 6,0 g NaNOs 3, 0,52 g KCl, 0,52 g MgSO 4 · 7H2 O, 1,52 g KH 2 PO 4, och 1 ml Hutner s spårämnen stamlösning (2,2 g ZnSO 4 · 7H 2 O, 1,1 g H 3 BO 3, 0,5 g MnCl2 · 4H 2 O, 0,5 g FeSO 4 · 7H 2 O, 0,16 g CoCl2 · 5H 2 O, 0,16 g CUSO4 · 5H 2 O, 0,11 g (NH4) 6mo 7 O 24 · 4H 2 O, och 5,0 g Na 4 EDTA i 100 ml destillerat H2O 33 , 34. Justera pH till 6,5 med användning av NaOH, och föra volymen till 1 L. För det flytande bioanalysen, filter-sterilisera FMM att undvika utfällning av salter. Om fast medium önskas, tillsätt 16 g agar och autoklav. När halvfast agar är krävs, minska agar till 8 g / I. Vid kylning till 50 ° C, tillsätt kloramfenikol till en slutlig koncentration av 30 pg / ml. Detta medium nu kallas FMM chl 30. Som en kontroll för att säkerställa att fungal isolat växer i detta medium, bör FMM vara made som ovan men med 10 g glukos per liter. Detta kallas glukos minimalt medium 35 (GMM).
  4. Fosfat-buffrad saltlösning 36 (PBS) används för att suspendera jordpartiklar och mikrobiella celler i den initiala serieutspädning av jord-exponerade BDMS. För att göra PBS, tillsätt 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4, och 0,24 g KH 2 PO 4 till 800 ml destillerat vatten. Lös salter och justera pH till 7,4 med HCl. Ta totala volymen till 1 L med ultrarent vatten. Fyll ren kultur rör med 9,5 ml och 4,5 ml PBS per rör. Autoklav.
  5. 30% (vol / vol) glycerol används för suspension kryokonserverade bakterier och jästceller, sporer, och svampmycel under lagring vid -80 ° C. Gör denna lösning i ultrarent vatten. Autoklav.
  6. 0,01% (volym / volym) Triton X-100 används för att hänga svampsporer, detergenten fungerar som ett icke-toxiskt vätmedel för hydrofoba sporer. Lös 100 ^ Triton X-100 I 1 L av ultrarent vatten. Autoklav.
  7. 0,1 M natriumfosfatbuffert (pH 7,2) används som lösningsmedel för glutaraldehyd under SEM fixering. Blanda 68,4 ml av 1 M Na 2 HPO 4 och 31,6 ml 1 M NaH 2 PO 4 och föra totala volymen till 1 L med ultrarent vatten 36.

Tre. Framställning av bioanalys Material: Surface Sanering av BDM Films

  1. Eftersom rester av främmande ämnen som papper och tejp på skärande redskap är potentiella kolkällor, använd nyligen inköpta sax eller färska rakblad, och en oorganisk yta för kapning. Använd handskar för att undvika kontaminering av BDM filmer med hudfett. Skär BDM filmer i små fyrkanter (4.25 x 4.25 cm). Denna storlek torg passar i en standard 100 x 15 mm petriskål.
  2. Använd ett bakteriedödande UV-lampa (emission våglängd = 253,7 nm) för att sanera BDM filmer. En sådan lampa finns ofta i en standard biosäkerhet skåp. Se till att närUV-ljuset är i drift finns det ingen flödet av extern luft in i biosäkerhet skåpet som kan kontaminera de BDM filmerna.
  3. Våta ytor inuti huven med 70% EtOH och låt fläkten kör för 15 min för att spola luft. Stäng sedan fönsterbåge och sanera huven ytan med UV under 2 timmar.
  4. Placera BDM filmerna i den sanerade huven, i rader. Låt UV-ljus att lysa på filmer under 2 timmar.
  5. Använd en ren, steriliserad pincett för att vända BDM filmerna. Börja vid den främre raden och arbete till sista raden för att minimera tiden som händer och armar är direkt ovanför den nyligen sanerade BDM ytor. När flipping BDMS, placera den nyligen disinfested sidan neråt på en ren yta som utsätts för UV-ljus men som inte tidigare i kontakt med den icke-disinfested sidan av filmen.
  6. Efter 2 timmar av UV-behandling på varje sida, ta bort BDM filmerna från biosäkerhet skåpet med en steril pincett, återigen arbeta framifrån och bak för att undvika att placera händer och armar över redan-saneringnerade filmer. Placera BDM filmerna i sterila, torra, täckta behållare såsom foliebeklädd bägare. Förvaras vid rumstemperatur i mörker.

4. Plate Bioanalys Setup

Utför alla steg i en steril överföring huva med aseptisk teknik.

  1. Lägg de UV-disinfested BDM bitar på ytan av agarplattor. Ställ ner ett hörn först, och försiktigt låta återstoden av kvadratiska valsen i kontakt med agar. Undvik rynkor. Vissa filmer kommer att bilda rynkor som under lagring, det är oundvikligt. Särskilt tunna filmer kan kräva användning av två pincett för att lägga arb platt.
  2. Placera pärlor av halvfast FMM CHL 30 agar ovanpå plastfilmen för att ge en vatten-och näringskälla för initial kolonisering av hydrofoba plaster. Pärlor är inte nödvändiga för vatten-genomsläppliga filmer. Re-smälta agar i mikron, och använda en mikropipett att överföra fyra 10 l droppar av smält agar på kompost (en i varje motsvarandeNER). Rör inte spetsen på pipetten direkt till kompost som kan punktera. Överskrid inte 10 ul per droppe, eftersom övervikt på kompost kan dra plasten bort agarytan när plattorna är inverterade.
  3. Låt plattorna sitter rättvänd med lock på natten för att stelna helt, och sedan lagra tätade muffar agar-side upp vid 4 ° C i mörker. När du är redo att utföra det biologiska testet (steg 7), använd i) en platta av FMM CHL 30 (negativ kontroll), ii) en bioassay skylt som innehåller fyra 10 l droppar av halvfast FMM CHL 30 på plastfilm, och iii) en platta av GMM (positiv kontroll). På detta sätt replikat fyra av varje isolat kan testas per platta med medium.

Fem. Flytande Bioanalys Setup

  1. Följ instruktionerna för BDM skärning i steg 3.1. Före kapning plastfilmer för flytande bioassayen, välj en storlek som passar in i kulturen röret.Området nödvändigt för att uppnå en likformig massa bland flera plasttyper beror på filmtjockleken. Vi fann att bitar motsvarar 0,0175 g passar bra i 15 x 150 mm provrör kultur.
  2. Surface-sanera filmer med UV-ljus såsom beskrivits i steg 3 ovan.
  3. För varje replikat av mikrobiella isolat, förbereda tre rör för inokulering: i) 5 ml FMM innehållande en BDM fragment av den förutbestämda storleken (experimentell), ii) 5 ml FMM med ingen kolkälla (negativ kontroll), och iii) 5 ml GMM (positiv kontroll). Dessutom förbereder replikera rör av FMM innehåller varje BDM som skall testas, men inte ympa dem. Dessa kontroller rören kommer att avslöja någon mikrobiell tillväxt till följd av kontamination.

6. Isolering av Fungi

Efter jord inkubation och prov borttagning, är svampar isolerade från jord som följer de BDM filmerna. Om så önskas kan bakterier simultaneously isoleras med samma metod med användning av medier som är lämpliga för isolering av jordbakterier, såsom 1/10X utspädd tryptisk jäst agar kompletterad med 50 | ig / ml cykloheximid att avskräcka svamptillväxt 37. När definierat medium krävs för bakteriella isoleringar i steg 5 och 7, M9 38 (plus cykloheximid) är ett bra val.

  1. Före provet behandling, förbereda PBS och PDA CHL 30. Tillåt PDA chl 30 plattorna torka (unbagged) vid rumstemperatur under ca 24 timmar för att eliminera kondens på lock och agarytan. Pre-label PDA chl 30 plattor.
  2. Gräv nätpåsar innehåller BDM bitar från gravplatser som valts i steg 1. Fartyg och förvara vid 4 ° C inte längre än 48 timmar efter extraktion från jord.
  3. Använd steril spatel och pincett, försiktigt bort jord tills plasten är exponerade men inte borsta bort jorden som är klängande till BDM filmens yta. Skär BDM filmen i 1 cm2 bitar tills 0,5 g material återvinns för varje fyra totalt upprepningar. Överför 0,5 g BDM film och bifogade jord till 25 tuber ml kultur innehållande 9,5 ml PBS. Om kompost är helt förstörd eller en jord-bara kontrollen håller på att bearbetas, tillsätt 0,5 g jord till PBS, om möjligt, väljer bitar som fortfarande är missfärgade från kvarvarande kompostmaterial.
  4. Vortexblanda odlingsrör innehållande 9,5 ml PBS och 0,5 g kompost i 30 sekunder vid hög hastighet, sonikera i en sonicating vattenbad i 10 min och vortexa igen under 30 sek. Omröringen är avsett att bryta isär biofilms, fysiskt avlägsna celler inbäddade i eller vidhäftning till marktäckning bitar, och skapa en homogen suspension.
  5. Förbered seriellt späda PBS / marklösning att erhålla individuella kolonibildande enheter från platings. För varje prov, plats i ett laminärt flöde huva en kultur rör fyllt med 4,5 ml steril PBS. För varje prov, fylla tre brunnar i en djup och 96-brunnar fylldes med 450 pl PBS.
  6. Den ursprungliga plast / jordsuspension (0,5 g kompost plus 9,5 ml PBS-lösning) representerar en 5,0 x 10 -2 utspädning av mikrobiellt material som fastnat på plasten. Tillsätt 0,5 ml suspension från denna ursprungliga röret till 4,5 ml steril PBS i ett odlingsrör för erhållande av en 5,0 x 10 -3 utspädning. Vortex i 30 sekunder vid hög hastighet. Lägg 50 | il till 450 | il av PBS i 96-brunnar. Upprepa för alla prover / replikat. Använd en multikanalspipett att späda proverna en masse. Blanda varje ny utspädning genom att pipettera upp och ned tio gånger. Ändra tips mellan utspädningar. Gör spädningar upp till 5,0 x 10 -6.
  7. (Valfritt) Bakterieisolat var rikligare än svamp isolat i prov som beskrivs häri, alltså om att samtidigt isolera bakterier, sedan utföra spädningar upp till 5 x 10 -8 i steg 6.6 ovan.
  8. Jämnt fördelad 100 | il från var och en av 5,0 x 10 -3 genom 5,0 x 10 -6utspädningar över agaryta PDA chl 30 plattor med låga steriliserade-böjda glasstavar. Förvara plattorna upprätt i 30 minuter för att låta vätskan suga in, sedan försegla plattor med Parafilm för att undvika läckage av sporer från oidentifierade isolat. Inkubera inverterade plattorna vid 20 ° C i mörker under 5 dagar för att möjliggöra både snabba och långsamt växande svampar att bilda kolonier.

7. Första urval av Plast-nedbrytande svampar

Viktigt: Alla kulturer från denna punkt framåt bör endast öppnas i en biosäkerhet skåp (inte ett laminärt flöde huva) för att undvika förorening av miljön med sporer av okänd identitet. Vissa jord svampar och bakterier är potentiella mänskliga patogener.

  1. Undersök utspädning plattor innehållande väl isolerade kolonier. Välj en koloni som inte vidrör en annan koloni.
  2. Använda en enda steril tandpetare, försiktigt röra en koloni och sedan på agar av FMM (i steg 2.3 steg 4), och GMM (gjord i steg 2.3)-plattor, i den ordningen. För att inokulera agar pärlor atop plastfilmer, gnid tandpetare försiktigt på ytan av agar prick och svep sedan över plastfilmen. Upprepa inokulering från samma källa koloni tills det finns fyra replikat strimmor på varje platta.
  3. Upprepa steg 7.1 till 7.2 förrän flera replikat av varje visuellt unik koloni typ väljs från varje BDM prov.
  4. Tätningsskivorna med Parafilm, invertera, och inkubera vid 20 ° C i mörker i 5 dagar.
  5. Identifiera isolat som växer på BDMS bättre än de växer på FMM. Om tillväxten är inte självklart, visa prov under ett dissekera mikroskop för att kontrollera kolonisering eller brist därav (Figur 1). Behåll locket på, om locket har kondens, byt till ett nytt lock men gör det i biosäkerhet skåpet.
  6. När potentiella BDM nedbrytare väljs, använd somterile tandpetare att skrapa ympen från svampen koloniserar själva plasten, och strimma för isolering av enstaka kolonibildande-enheter på PDA chl 30 plattor.
  7. Seal plattor med Parafilm och inkubera PDA chl 30 plattor ympades med plast-nedbrytande isolat vid 20 ° C under 5 dagar i mörker.
  8. Nu när enskilda isolerade kolonier renas, så att de verkligen kan kolonisera plastfilmer som testas. Samla inokulum (sporer, jästceller eller hyfer) från en enda koloni-bildande enhet med en steril tandpetare. Upprepa steg 7.2 till 7.5. Efter 5 dagars inkubation vid 20 ° C, undersöka bioanalysresultaten plattor för svamptillväxt. Om isolera växer på en BDM film bättre än den växer på FMM i både första (7,5) och den andra (7,8) försök, sedan lagra isolatet såsom beskrivs nedan i steg 8.

8. Långtidslagring av plast nedbrytare Sammantaget kommer plast-nedbrytande isolat testas i plattan bioanalysen (7,5), åter renas till enskilda isolerade kolonibildande enheter (7,6) som testats i plattan bioanalys igen (7,8), och slutligen, testade i vätskan bioanalys ( 9,1-9,5). Vid testningen bör isolat överföras till färskt medium varje månad och arbetar stock plattorna förvaras vid 4 ° C så snart tillräcklig tillväxt är synlig. Isolat bör också lagras som glycerolstamlösningar vid -80 ° C, och / eller i form av torkade sporer på sterila filterskivor vid 4 ° C. Båda lagringsmetoder beskrivs nedan.

  1. För varje isolat som växte på en BDM film bättre än den växte på FMM i både första (7,5) och den andra (7,8) platta biologiska testsystem, förbereda två PDA chl 30 plattor med två eller tre steriliserade filterpapper diskar, ca 1 cm i diameter , på ytan. Inokulera dessa två plattor frånsamma enda koloni valdes i steg 7.8 ovan. Gör en gräsmatta genom att sprida ympen likformigt över agar för att maximera tillväxten. Täta plattor med Parafilm och inkubera vid 20 ° C under 5 dagar. Detta steg kan inledas samtidigt med steg 7.8 för effektivitet.
  2. Filtret disk på agar ytan bör täckas med mycel / sporer. Ta bort de filterskivoma från agarytan med steriliserade pincett och placera i en steril Eppendorf-rör. Lufttorka filterskivoma natten inne i Eppendorf-rör (med mössan) i en biosäkerhet skåp eller annan torr, steril miljö med minimala luftrörelser för att undvika korskontaminering. Sedan försegla med Parafilm och förvara vid 4 ° C.
  3. Använd en steril bomullspinne eller tandpetare för att skörda sporer och mycel från gräsmattan plattorna. Häng sporer och hyfer i 30% glycerol i cryovials, flash-frysa i flytande kväve, och förvara vid -80 ° C.

9. Stränga Confirmation av plast Utnyttjande via Liquid Bioassay

  1. Generera färska sporer och / eller celler med vilka för att ympa vätskekulturer: inokulera PDA chl 30 plattor med sporer från potentiella plast nedbrytande isolat. Förslut plattorna med Parafilm, och inkubera vid 20 ° C tills svampsporer är synliga.
  2. I en biosäkerhet skåp, skörd spor vid tvättning av plattan med 0,01% Triton X-100 (5 ml per 15 x 100 mm Petri platta fungerar bra) och skrubbning av sporer (eller jästceller) från ytan med en steril böjd-glasstav . Sug spor (eller cell) suspension och överföring till en steril behållare.
  3. Räkna sporer eller celler med en hemacytometer och bestämma lämplig volym för att lägga till 5 ml FMM buljong för totalt 1 x 10 6 sporer / rör. Volymen bör vara mindre än 10 pl. Spädning av koncentrerade sporsuspensioner i 0,01% Triton X-100 kan vara nödvändig.
  4. I en steril överföring huva, ympa odlingsrör framställda i 6 sporer (eller jästceller). Förslut locken med Parafilm för att undvika läckage av sporer, speciellt för oidentifierade isolat. Inkubera i mörker vid 20 ° C och observera prover varje vecka för tillväxt.
  5. Mycelietillväxt av svampar på plastfilmer kan vara synliga inom den första veckan efter inokulering, i synnerhet vid kanterna av plastfilmer. För planktoniska jäst (vilket framgår av molniga media), kan tillväxt övervakas genom optisk densitet avläsningar vid 600 nm. Eftersom svampar kommer sannolikt att fästa direkt vid plastfilmen kan tillväxten bedömas med ögat, och kan bekräftas genom Ijusmikroskopi och / eller svepelektronmikroskopi (SEM).
  6. I FMM enbart kontroller, leta efter världsdelen vita fläckar som är för små för att registrera en förändring i optisk densitet med spektrofotometriska metoder. Dessa fläckar kan aspireras med en Pasteur-pipett och observerades med användning av differential interferens (DIC) mikroskopi. Flecks är ofta oidentifierbara precisionpitate, men i vissa fall kan de vara klumpar av den ursprungliga ympen som hade grott men inte vuxit kraftigt.
  7. Använd visuella och mikroskopiska observationer att jämföra kolonisering av experimentella prover och kontroller, och tilldela betyg för tillväxten på varje prov i BDM film. Eftersom många BDMS är mörk i färgen och möjliggöra minimal observation via mikroskopi utom vid kanterna, och filmtjocklek förbjuder observation under en olje-nedsänkning lins, är SEM nyttigt att uppskatta i) förekomsten av mikrobiell tillväxt, t.ex. via klassificeringssystemet beskrivs i Tabell 1, och ii) omfattningen av BDM nedbrytning.

10. SEM Provberedning

  1. Använd ren, steril sax för att klippa små bitar av BDM från replikatprover. Fix BDMS genom nedsänkning i 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumfosfatbuffert (pH 7,2) under 24 till 48 timmar.
  2. Medan fixering sker, torka ren 100% etanol genom att tillsätta 5-10% volume 3 Å molekylsikt (aktiverat i en torkugn vid 175-260 ° C och kyldes i en exsickator) och låt stå vid rumstemperatur över natten för att säkerställa total uttorkning.
  3. Sänk ned BDMS i 0,1 M natriumfosfatbuffert (pH 7,2) för fyra tvättningar på 15 min vardera.
  4. Sänk BDMS i ultrarent vatten för tre tvättar med 5 min vardera.
  5. Dehydrera BDM sampel i en etanolserie, nedsänkning under 20 minuter vid varje koncentration: 50%, 70%, 80%, 90%, 95% och 100%. Skölj BDMS gånger mer i 100% etanol i 20 min per sköljning.
  6. Ämne prover till kritisk punkt torkning och sputterbeläggning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I en färsk studie 24, replikerar fyra vardera av tre kommersiellt tillgängliga BDMS märkta "biologiskt nedbrytbart", plus en experimentell film och en konventionell plast kontroll, placerades över marken som marktäckning för tomater under våren 2010 på Mount Vernon, WA, Knoxville, TN, och Lubbock, TX. Under hösten 2010, var BDM film rutor bortskuren från väderbitna kompost i fyra likadana tomter, och befintlig jord togs bort från direkt under det område där kompost provet hade skurits ut. Varje ridit BDM torget inklämt i marken inuti ett nylonnät väska som beskrivs i steg 1. En jord-bara kontroll ingick också. Väskor begravdes under 7.5 cm jord i samma tomter och rader som tidigare omfattades av kompost, och kvar på plats tills våren 2011 jordbearbetning, sju månader senare. Väskor därefter lyfts från tomter med en spade, placeras i Ziplock plastpåsar och skickas till laboratoriet på is förpackningar för leverans nästa dag.

<p class = "jove_content"> Här rapporterar vi representativa resultat från vår studie. Native jordsvampar isolerades från varje BDM på alla tre platserna, för totalt 54 isolat. Vi beskriver isolat från två av de kommersiella produkter som används på en webbplats (Mount Vernon). En av produkterna var en biologiskt nedbrytbar plast som kallas BioAgri. Denna svarta filmen är märkt som "stärkelse-baserade" (BioAgri, Palm Harbor, FL) och tillverkade av Mater-Bi bioplast från Novamont (Terni, Italien). Mater-Bi är en blandning av "majsstärkelse och biologiskt nedbrytbara polymerer som erhållits både från förnybara råvaror och fossila råvaror" ( http://www.novamont.com/default.asp?id=505 ). Den andra produkten var inte plast utan snarare en brun "pappersliknande material tillverkat av speciellt konstruerade cellulosafiber" (WeedGuard Plus, solsken Paper Co, Aurora, CO); ( http://www.weedguardplus.com/faqs.php ). Denna prokanal ursprungligen ingick som en kontroll och nedbrytning av dess cellulosakomponenter förväntades.

Använda plattan bioassayen beskrivs häri, har tre potentiella BDM-nedbrytande isolat från WeedGuard Plus och tre från BioAgri återvinnas. Dessa isolat utsattes för flytande bioanalys (steg 9,1-9,7 ovan) i tre exemplar. Även om vissa svamptillväxt var synlig längs kanterna av BDMS efter en vecka i den flytande bioanalysen, proverna inkuberades under 68 dagar före skörd och sista observation. Använda SEM, var svamphyfer observerades på alla prover utom XX och YY, där vi observerade stavformade celler (tabell 2). Eftersom XX och YY växa i jäst form på PDA CHL 30, var denna observation väntat.

För WeedGuard Plus isolat, har ingen tillväxt observerades i FMM-enda kontroller. Den mest BDM nedbrytningen observerades i proverna koloniserade av Isolera SS. I det icke inokulerat controls för WeedGuard Plus kompost (Figur 2A), resterande tracheary element i vegetabiliska fibrer är endast detekteras som liten pock-märkning ses i rader på en del av fibrerna. Även svamphyfer observerades i alla ympade tre prover var tracheary element helt synligt endast i SS prover (Figur 2B), vilket tyder på att nedbrytning av cellulosahaltiga material avslöjade förvedade tracheary element nedanför. Isolera SS var preliminärt identifierades med 18S ribosom DNA som sordariomycete inom ordningen Sordariales.

För BioAgri isolat, sågs ingen signifikant ökning observerats i FMM-enda kontroller. Enstaka vita fläckar syns på virvlande odlingsrör av isolat VV och ZZ observerades med DIC mikroskopi. För Isolera VV, var fläck en spor massa (inte visad), förmodligen kvarvarande från den ursprungliga ympningen. För Isolera ZZ, var massan består av lös maska ​​av hyfer ca 0,2 mm diameter, Vilket tyder på att den ursprungliga spore ympen hade grott, men hade inte vuxit bortom massan avbildad i Figur 3A.

I ej inokulerade kontroller för BioAgri kompostmaterial (figur 3B), är en krokig textur observeras. Identiteten hos de vita funktioner är okänd, men de är frånvarande i en film koloniserats av Isolera VV (fig 3C). Både vita partiklar och stötar är borta i en film koloniserats av Isolera ZZ (Figur 3D). Dessutom visade det senare provet enhetlig förekomst av sprickor över BDM ytan. Isolat VV och ZZ har preliminärt identifierats med hjälp av 18S ribosom DNA som Penicillium sp. (VV) och en sordariomycete i ordningen Hypocreales (ZZ), respektive.

Betyg Utseende av mikrobiell tillväxt
0 Ingen tillväxt påtaglig vid ögat ellergenom mikroskopi
1 Grodda sporer men ingen uppenbar efterföljande tillväxten
2 Tillväxt täcker ≤ 25% av provytan eller medelstora
3 Tillväxt täcker ≤ 50% av provytan eller medelstora
4 Tillväxt täcker ≤ 75% av provytan eller medelstora
5 Tillväxt som täcker> 75% av provytan eller medelstora

Tabell 1. Poängsystem för betyg mikrobiell tillväxt på prover av plastfilmer.

> Mycelia och sporkedjor observerades vid kanten
Isolera BDM

FMM-bara kontroll (poäng)

FMM innehållande 0,0175 g BDM (poäng och / eller commentarer)
Visuell bedömning Ljusmikroskopi SEM
SS WG 0 Hyfer och BDM fibrer omöjliga att skilja Hyfer och BDM fibrer omöjliga att skilja 2; Fungal hyfer synlig
TT WG 0 Hyfer och BDM fibrer omöjliga att skilja Hyfer och BDM fibrer omöjliga att skilja 2; Fungal hyfer synlig
XX WG 0 Broth grumlig Några celler som kan observeras i buljong 2, stavformiga celler på ytan
VV BA 1 Fine mycel synlig på kanten 4, Prolific hyfer och konidioforer
YY BA 0 Broth grumlig Några celler som kan observeras i buljong 2, stavformiga celler på ytan
ZZ BA 1 Lyxig mycelietillväxt på hela ytan Hyfer synlig på kanten 5; Prolific hyfer

Tabell 2. Iakttagelser och betyg tillväxt för svamp isolat erhållna från väderbitna BDM filmer begravda i fält tomter från hösten 2010 till våren 2011 (7 månader) på Mount Vernon, senare ympas på ovittrat BDM material och inkuberades under 68 dagar vid 20 ° C i mörker . WG = WeedGuard Plus, BA = BioAgri. Se Tabell 1 för tillväxt rating system.

fig1.jpg "/>
Figur 1. Kolonisering av BioAgri kompost i plattan bioanalysen som beskrivits i steg 7, sett under ett dissektionsmikroskop med 20X förstoring.

Figur 2
Figur 2. Utseende av WeedGuard Plus kompost efter 68 dagar i FMM men inte ympade (A), eller ympades med isolera ZZ, preliminärt identifierade som Chaetomium sp. (B). Notera de tracheary element (pilar) som är knappt urskiljbar i A, men tydligt ses i B. Ingen tillväxt var synlig i FMM-enda kontroll för Chaetomium isolat. Proverna belades med Au / Pd använder en Quorum SC7640 spotta bestrykare, och avbildas på en accelererande spänning av 15 kV på en Tescan VEGA 5136 MM SEM.


Figur 3. Utseende av BioAgris kompost efter 68 dagar i vätskan bioanalysen. En enda klump av grodda sporer observerades i FMM-enda väg för den ZZ isolera, preliminärt identifierats som en Sordariomycete (A). BioAgri kompost inkuberades i icke inokulerat FMM (B), BioAgri kompost inokulerades med isolat VV, preliminärt identifierats som Penicillium sp. (C), och BioAgri kompost inkuberades med isolera ZZ (D). Proverna belades med Au / Pd använder en Quorum SC7640 spotta bestrykare, och avbildas på en accelererande spänning av 15 kV på en Tescan VEGA 5136 MM SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det förfarande som beskrivs häri utgör ett första-pass teknik för att isolera potentiella BDM nedbrytare från marken, och med framgång använts för att isolera svampar från BDMS nedgrävda i marken i sju månader. Svampar växte när reinoculated på färskt BDM material av samma typ, vilket visar att de isolerade svampar verkligen var kolonisatörer, och att filmerna inte var hämmande på svamptillväxt. Isolering av plast-nedbrytande svampar och bakterier skulle kunna leda till att de används, individuellt eller i kombinationer, för ändringar i jord eller kompost där plaster måste brytas ned.

I sin naturliga marken miljö, existerar mikrobiella arter inte i isolering. Plast nedbrytare och även oligotrofa organismer växer på BDMS, men med hjälp av andra kol-och energikällor, kan keystone arter i koloniseringen av dessa motsträviga näringskällor. I ett försök att utvärdera BDM nedbrytning in vitro men bättre efterlikna en verklig jord microbial gemenskap, den metod som beskrivs häri kan ändras för testning av blandningar, snarare än rena isolat, av svamp och bakteriell ympning.

Av notera, isolerar TT, XX, VV, och YY uppnått minimal nedbrytning av BDMS, men varje uppvisade synliga BDM kolonisering i både plattan och flytande bioanalyserna. Således hade synliga kolonisation inte nödvändigtvis betyda BDM polymernedbrytning. Isolerar TT, XX, VV, och YY är sannolikt att representera oligotrophs som erhållits näringsämnen från omgivningen samt från BDM 29,30,31.

Slutgiltig bevis på att svampar använder en viss BDM som kolkälla kräver mätning av nedbrytning via kemiska metoder. Koldioxid evolution under inkubering av plast med microogranisms indikerar andning, och kan användas som ett indirekt mått på polymerens nedbrytning 15,16,39. Olika metoder används för att få information om storleken och strukturen av polymerer, inkluding högeffektiv vätskekromatografi, gelkromatografi, differentiell svepkalorimetri, termisk gravimetrisk analys, kärnmagnetisk resonansspektroskopi, röntgendiffraktion och Fourier-transform infraröd spektroskopi. Studier för att bedöma CO2 evolution och polymer nedbrytning skulle representera en logisk utveckling från screening som beskrivs häri. Däremot kan kemiska metoder för att mäta polymer storlekar differentierar inte enzymatisk nedbrytning från hydrolys av organiska syror som utsöndras under tillväxten av svampar och bakterier. Innebörden av en enzymatisk mekanism i plast uppdelning skulle kräva isolering av ett rent enzym (er) förmåga att bryta ned polymerer in vitro.

De förfaranden som beskrivs häri bör vara brett tillämpbar för vilken plast som helst som används i en film konformation, såsom mat förpackningsmaterial eller soppåsar. Dessa procedurer har flera fördelar. Det första är de plastfilmer som används i bioAssay är i sin kommersiella form som finns att köpa på marknaden och slutligen nedbrytning i miljön. En nackdel är att använda plast, liksom BDMS skördas efter 2010 vegetationsperioden i denna studie, kan vara mer väderbitna än nya plastfilmer som används i försök in vitro. Före mikrobiella angrepp, UV, vind, nötning av markens partiklar, kemisk hydrolys via oorganiska markens beståndsdelar och fauna jord bidrar till oxidering och fragmentering av polymerer, ändra effektiviteten av enzymatisk verkan på BDM filmerna 11. En annan fördel är att denna metod kan användas oavsett om de enskilda beståndsdelarna i farmaceutiska plastprodukter är kända och / eller tillgängliga i ren form för att testa. Dock är en begränsning av att använda plast med flera eller okända beståndsdelar som synlig nedbrytning inte entydigt kan hänföras till en enskild beståndsdel. Till exempel kan nedbrytningen i fig. 3D representerar stärkelse bÖRDELNING utan nedbrytning av de mer motsträviga polymerer i "stärkelse-baserade" BioAgri film. I en tidigare studie om in-markförstöring stärkelse-ändrade plastfilmer, koldioxid priser evolution återspeglade mängder stärkelse och färgämne till filmer, medan oförändrade polymermolekylvikter stödde hypotesen att tillsatser, inte polymerer, höll på att utnyttjas av mikroorganismer 39. Slutligen, är detta förfarande inriktat på in vitro nedbrytning, vilket ger ett mer definierat system än de som för närvarande i vanlig användning 15,16. Det förväntas att prover nedbrytande i kemiskt definierat medium kommer att visa sig lättare att bedöma via kemiska metoder än prover nedbrytande i jord eller kompost. Sådana bedömningar är den nuvarande inriktningen av detta arbete.

Detta förfarande var framgångsrikt för isolering av BDM-nedbrytande svampar och bakterier från fyra typer av BDM filmer på tre platser i USA (TN, WA, och TX), med olika viather, jordarter och mikrobiell samhällsstrukturer. Denna procedur tar en reduktionistisk uppfattning, fokusera på enskilda isolat med kapacitet för tillväxt på, och uppdelning av BDMS. Men resultaten understryker betydelsen av mikrobiella analyser för att beskriva de separata och länkade roller näringsfattiga kolonisatörer, seriösa depolymerizers BDM och andra samhällsmedlemmar, är som alla förväntas vara viktiga i det yttersta målet för fullständig nedbrytning av plastfilm till biomassa, koldioxid och / eller metan och vatten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Dr Stephen aldermanen, Dr David Leaf, och Erin Macri är tacksamt erkänt för hjälp med mikroskopi. Denna forskning har finansierats genom ett bidrag från NIFA specialgrödor Research Initiative, USDA SCRI-SREP Grant Award nr 2009 till 02.484. Briana Kinash, Kevin Kinloch, Megan Leonhard Joseph McCollum, Maria McSharry och Nicole Sallee som utmärkt tekniskt bistånd och tankeväckande diskussioner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potato Dextrose Agar Becton Dickinson 8X05491
Agar Fisher BP 1423-2
Chloramphenicol Acros Organics 200-287-4
Glutaraldehyde Electon Microscopy Sciences 16216-10 Toxic
Molecular sieve Fisher M-8892
Ethanol Pharmco-Aaper E200
Contrex Decon Labs, Inc. 5204
Parafilm M Pechiney Plastic Packaging S37440
Mineral salts for buffers and media Fisher Various Various vendors sell these reagents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gregory, M. R. Environmental implications of plastic debris in marine settings - entanglement, ingestion, smothering, hangers-on, hitch-hiking and alien invasions. Philosophical Transactions of the Royal Society. 364, 2013-2025 (2009).
  2. Teuten, E. L., Saquing, J. M., et al. Transport and release of chemicals from plastics to the environment and to wildlife. Philosophical Transactions of the Royal Society. 364, 2027-2045 (2009).
  3. Thompson, R. C., Moore, C. J., vom Saal, F. S., Swan, S. H. Plastics the environment and human health: current consensus and future trends. Philosophical Transactions of the Royal Society. 364, 2153-2166 (2009).
  4. ASTM D 883. Standard terminology relating to plastics. , American Society for Testing and Materials International. West Conshohocken, PA. (1991).
  5. SO 472. Plastics - vocabulary, amendment 3. General terms and terms relating to degradable plastics. , International Organization for Standardization. Geneva, Switzerland. (1993).
  6. Krzan, A., Hemjinda, S., Miertus, S., Corti, A., Chiellini, E. Standardization and certification in the area of environmentally degradable plastics. Polymer Degradation and Stability. 91, 2819-2833 (2006).
  7. Shogren, R. L. Biodegradable mulches from renewable resources. Journal of Sustainable Agriculture. 16, 33-47 (2000).
  8. Takakura, T., Fang, W. Climate under cover. , Kluwer Academic Publishers. 1-10 (2001).
  9. Miles, C., Hayes, D., Brodhagen, M., Lee, J., Wszelaki, A., Moore-Kucera, J., Wallace, R., Marsh, T., Inglis, D. Plastic mulches, biodegradable alternatives, China and US. Transforming Landscapes, Transforming Lives: The Business of Sustainable Water Buffer Management. van Steenbergen, F., Tuinhof, A., Knoop, L. , 3R Water Secretariat. Wageningen, The Netherlands. (2011).
  10. Song, J. H., Murphy, R. J., Narayan, R., Davies, G. B. H. Biodegradable and compostable alternatives to conventional plastics. Transactions of the Royal Society B. 364, 2127-2139 (2009).
  11. Hayes, D. G., Dharmalingam, S., Wadsworth, L. C., Leonas, K. K., Miles, C., Inglis, D. A. Biodegradable agricultural mulches derived from biopolymers. Degradable polymers and materials, principles and practice. ACS Symposium Series. Khemani, K. C., Scholz, C. 1114, 2nd Ed, American Chemical Society Press. Washington, D.C. 201-223 (2012).
  12. Ojeda, T. F. M., Dalmolin, E., Forte, M. M. C., Jacques, R. J. S., Bento, F. M., Camargo, F. A. O. Abiotic and biotic degradation of oxo-biodegradable polyethylenes. Polymer Degradation and Stability 94. , 965-970 (2009).
  13. van der Zee, M. Analytical methods for monitoring biodegradation processes of environmentally degradable polymers. Handbook of Biodegradable Polymers. Lendlein, A., Sisson, A. , Wiley-VCH. Weinheim, Germany. 263-281 (2011).
  14. Narayan, R. Misleading claims and misuse of standards continues to proliferate in the nascent bioplastics industry space. BioPlastics. 01/10, (2010).
  15. ASTM D 5338-98. Standard test method for determining aerobic biodegradation of plastic materials under controlled composting conditions. Annual Book of ASTM Standards. , American Society for Testing and Materials International. West Conshohocken, PA. 504-509 (1998).
  16. ASTM D 5988-03. Standard test method for determining aerobic biodegradation in soil of plastic materials or residual plastic materials after composting. Annual Book of ASTM Standards. , American Society for Testing and Materials International. West Conshohocken, PA. 354-358 (2003).
  17. ASTM D 6954-04. Standard guide for exposing and testing plastics that degrade in the environment by a combination of oxidation and biodegradation. Annual Book of ASTM Standards. , American Society for Testing and Materials International. West Conshohocken, PA. 748-753 (2004).
  18. ASTM G21-96. Standard practice for determining resistance of synthetic polymeric materials to fungi. Annual Book of ASTM Standards. , American Society for Testing and Materials International. West Conshohocken, PA. 433-437 (2002).
  19. ISO 846. Plastics - evaluation of the action of microorganisms. , International Organization for Standardization. Geneva, Switzerland. 1-22 (1997).
  20. Russell, J. R., Huang, J., et al. Biodegradation of polyester polyurethane by endophytic fungi. Applied and Environmental Microbiology. 77, 6076-6084 (2011).
  21. Maeda, H., Yamagata, Y., Abe, K., Hasegawa, F., Machida, M., Ishioka, R., Gomi, K., Nakajima, T. Purification and characterization of a biodegradable plastic-degrading enzyme from Aspergillus oryzae. Applied Microbiology and Biotechnology. 67, 778-788 (2005).
  22. Tokiwa, Y., Calabia, B. P. Biodegradability and biodegradation of poly(lactide. Applied Microbiology and Biotechnology. 72, 244-251 (2006).
  23. Karjomaa, S., Suortti, T., Lempiäinen, R., Selin, J. -F., Itävaara, M. Microbial degradation of poly-(L-lactic acid) oligomers. Polymer Degradation and Stability. 59, 333-336 (1998).
  24. Miles, C., Wallace, R., et al. Deterioration of potentially biodegradable alternatives to black plastic mulch in three tomato production regions. HortScience. 47 (9), 1270-1277 (2012).
  25. Hedh, J., Wallander, H., Erland, S. Ectomycorrhizal mycelial species composition in apatite amended and non-amended mesh bags buried in a phosphorus-poor spruce forest. Mycological Research. 112, 681-688 (2008).
  26. Wallander, H., Hagerberg, D. Do ectomycorrhizal fungi have a significant role inweathering of minerals in forest soil?. 4th International Symbiosis Congress, Halifax, Canada, , (2003).
  27. Hehemann, J. -H., Correc, G., et al. Biochemical and structural characterization of the complex agarolytic enzyme system from the marine bacterium Zobellia galactanivorans. Journal of Biological Chemistry. 287, 30571-30584 (2012).
  28. Stanier, R. Y. Studies on marine agar-digesting bacteria. Journal of Bacteriology. 42 (4), 527-559 (1941).
  29. Hirsch, P. Microbial life at extremely low nutrient levels. Advances in Space Research. 6, 287-298 (1986).
  30. Wainwright, M., Adam, T., Barakah, F. A review of the role of oligotrophic micro-organisms in biodeterioration. International Biodeterioration and Biodegradation. 31, 1-13 (1993).
  31. Wainwright, M., Barakah, R., Al-Turk, I., Ali, T. A. Oligotrophic micro-organisms in industry, medicine, and the environment. Science Progress. 75, 313-322 (1991).
  32. Parkinson, S. M., Wainwright, M., Killham, K. Observations on oligotrophic growth of fungi on silica gel. Mycological Research. 93 (4), 529-534 (1989).
  33. Hill, T., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Newsletter. 48, 20-21 (2001).
  34. Hutner, S. H., Provasoli, L., Schatz, A., Haskins, C. P. Some approaches to the study of the role of metals in the metabolism of microorganisms. Proceedings of the American Philosophical Society. 94, 152-170 (1950).
  35. Affeldt, K. J., Brodhagen, M., Keller, N. P. Aspergillus oxylipin signaling and quorum sensing pathways depend on G protein-coupled receptors. Toxins. 4, 695-6171 (2012).
  36. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratories Press. Cold Spring Harbor, New York, NY. (2001).
  37. Marzluf, G. A. Physiology, metabolism, and molecular aspects of filamentous fungi. Methods for General and Molecular Microbiology. Reddy, C. A., Beveridge, T. J., Breznak, J. A., Marzluf, G. A., Schmidt, T. M., Snyder, L. R. , ASM Press. Washington, D.C. 952-964 (2007).
  38. Peters, J. E. Gene transfer in Gram-negative bacteria. Methods for General and Molecular Microbiology. Reddy, C. A., Beveridge, T. J., Breznak, J. A., Marzluf, G. A., Schmidt, T. M., Snyder, L. R. , ASM Press. Washington, D.C. 735-755 (2007).
  39. Yabannavar, A. V., Bartha, R. Methods for assessment of biodegradability of plastic films in soil. Applied and Environmental Microbiology. 60 (10), 3608-3614 (1994).

Tags

Mikrobiologi 75 växtbiologi miljövetenskap SLU markvetenskap molekylärbiologi cellbiologi mykologi svampar bakterier mikroorganismer biologiskt nedbrytbar plast biologiskt nedbrytbara kompostmaterial komposterbar plast komposterbar kompost plast nedbrytning kompostering nedbrytning jord isolering kultur
Isolering av befintliga jorden Mikroorganismer med potential för Breaking Down Biologiskt nedbrytbara plast kompost filmer som används i jordbruk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bailes, G., Lind, M., Ely, A.,… More

Bailes, G., Lind, M., Ely, A., Powell, M., Moore-Kucera, J., Miles, C., Inglis, D., Brodhagen, M. Isolation of Native Soil Microorganisms with Potential for Breaking Down Biodegradable Plastic Mulch Films Used in Agriculture. J. Vis. Exp. (75), e50373, doi:10.3791/50373 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter