Summary
אנחנו השתמשנו בדגימות מרשתית retinectomy לניתוח transcriptomic של היפרדות רשתית. אנחנו פיתחה הליך המאפשר שימור RNA בין גושי הניתוח והמעבדה. אנחנו טופל בפרוטוקול כדי לטהר הרנ"א על ידי ultracentrifugation צזיום כלוריד כדי להבטיח שRNAs המטוהר מתאים לניתוח microarray.
Abstract
היפרדות רשתית (RD) מתארת הפרדה של רשתית נוירו מאפיתל הפיגמנט ברשתית (הרשתית). הרשתית היא חיונית לתפקוד תקין של התאים העצב הרגישים לאור, photoreceptors. ניתוק של הרשתית מהרשתית יוצר פער פיזי, כי הוא מלא בנוזל חוץ תאי. RD יוזם תופעות לוואי תאיות ומולקולרית המשפיעות גם נוירו הרשתית והרשתית מאז חילופי פיסיולוגי של יונים ומטבוליטים הוא מוטרדים קשה. התוצאה עבור חזון קשורה לתקופת הניתוק מאז reapposition מהיר של תוצאות שתי הרקמות בשיקום הראייה 1. הטיפול בRD הוא אך ורק ניתוחי. הסרת ג'ל זגוגית (Vitrectomy) ואחריו הסרת חלק החיוני שאינו של הרשתית באזור המרוחק לטובת היפרדות רשתית. דגימות רשתית הסיר הם מיל nullius (שום דבר) וכתוצאה מכך בדרך כלל מושלך.כדי לשחזר RNA מן הדגימות כירורגית אלה, פיתחנו את כתב עת ההליך המאפשר לרנ"א שימור במהלך ההעברה מהבלוק כירורגית למעבדה. אנחנו גם טופל פרוטוקול לטהר הרנ"א על ידי ultracentrifugation צזיום כלוריד כדי להבטיח שRNAs המטוהר מתאים לניתוח ביטוי גנים הגלובלי. האיכות של RNA קבלה תוקף גם על ידי RT-PCR וניתוח microarray. ניתוח של הנתונים מראה מעורבות בו זמנית של דלקת וניוון photoreceptor במהלך RD.
Introduction
המטרה הטיפולית העיקרית בהיפרדות רשתית (RD) היא למצוא דרך להגביל את נזק photoreceptor תא ודלקת רשתית כתוצאה מההפרדה של קולטניים אור מתאי אפיתל הפיגמנט ברשתית. במהלך RD, תאי הרשתית מופעלים, להעביר, dedifferentiate, ומתרבים על פני השטח של הרשתית המנותקת, הפעלת כוחות התכווצות שהובילו לסיבוכים. ניתוח transcriptomics של RD הוא דרך לזהות גני המטרה עם ביטוי שונה בעקבות RD ומולקולות טיפוליות עתידיות ומכאן שיכולים לשפר את התוצאה סופית חזותית בשילוב עם ניתוח. העובדה ידועה הוא חומצה ריבונוקלאית (RNA) אינה יציבה כפי שהיא חומצת deoxyribonucleic (DNA), האחרון בשימוש נרחב למחקרים גנטיים, יציבותו התירה הרצף של הגנום הניאנדרטלי מדגימות כפליאונטולוג של יותר מ -30,000 שנים 2. תמלול של ה-DNA של גנים מהגנום לתוך RNA השליח הואתהליך מרכזי בביטוי גנים, ואת ה-mRNA הוא יציב כדי להוות אות. RNAs מאוד במהירות מושפל על ידי RNAse אנזימים אשר לסיים את האות. כאשר רקמות מבודדות מהאורגניזם, את RNAs הם לעתים קרובות מאוד מושפל לפני הביטוי הוא למד במעבדת מחקר. RNA מושפל אינו מתאים לניתוח ביטוי גנים. כי צוות המעבדה לא יכול להשתתף בניתוח, פיתחנו הליך שהוא קל ורק דורש שהמנתח לשחזר את הרקמות לפתרון ללא RNAse מתאים. את הרנ"א של הרקמות הוא יציב וניתן לנתח ללא כל סימן של הידרדרות לאחר 72 שעות בטמפרטורת חדר בפתרון זה. את RNAs מדגימות הם מטוהרים על ידי שיטה סטנדרטית מעורבת ultracentrifugation בשיפוע צזיום כלוריד, לאחר שהועבר למעבדה 3. ואז, איכות של RNAs מוערכות על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose ועל ידי RT-PCR. יש פרוטוקול טיהור RNAיתרון של הפרדת המולקולות על פי הצפיפות שלהם שהיא שונה עבור DNA ו-RNA ומבטיח כי רנ"א אינו מזוהם על ידי מולקולות הדנ"א שתפקנה אותות artifactual במחקרי ביטוי גנים. בנוסף, העברת RNAs (tRNAs), שהן כמותית את הרנ"א הנפוץ ביותר בתוך תא, מופרדים על פי אותו הנכס הפיזי מרנ"א ריבוזומלי (rRNAs) ואת RNAs השליח (mRNAs), שני אלה שעבר אחד להיות בסופו של תוצר הלוואי של תהליך הטיהור. הסרת tRNA מההכנה היא שימושית שכן רוב פרוטוקולי אנליטיות microarray כללו שימוש בtranscriptases בחסר וpolymerases RNA אשר מעוכבים על ידי tRNA 4-6. את הרנ"א מנוקה מדגימות כירורגית מסומנים באמצעות פרוטוקול סטנדרטי והכלאה לשבב microarray והתוצאות מנותחות באמצעות שתי שיטות משלימות, שיטת שיעור הגילוי הכוזבת, ושימוש בשיטה חדשה המבוססת על מידע הדדי וvisualized בשרת מבוסס אינטרנט Retinobase 7,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. כתב עת: נוהל לשחזר את הדגימות מהבלוק כירורגי
במעבדה
- קבל חוזה יבוא מחברת ספנות מפורשת.
- מלא 10 (או 25) צורות משלוח עם כתובת הדואר של המעבדה מצביעה על איש הקשר במעבדה (מספר טלפון וכתובת דואר האלקטרוני).
- הכן 10 (או 25) צורות דוגמאות ממוספרות מ -1 עד 10 (או 25). צורות אלה כוללות חללים ייעודיים להודיע על זיהוי אלמוני) של החולה, ב) מועד הניתוח וג) שום הערות נוספות המנתח רוצים להוסיף. הכן 10 (או 25) מעטפות מרופדות (150 מ"מ x 210).
- מוכן באמצעות 25 מ"ל (או 65) ריאגנטים RNAse ללא כלוריד guanidine ז 6 בdiethylpyrocarbonate (DEPC) שטופלו H 2 O (GHCl).
- מלאו 10 או 25 מנתה 5 צינורות פוליאתילן תחתית עגולות סטריליים מ"ל עם 2.4 מ"ל של תמיסת GHCl.
- משמש גז ארגון כדי למלא את החלק העליון של צינורות אלה, יותר מעיתונות TIghtly בכובע כדי למנוע החמצון של פתרון GHCl על פני כמה שנים של אחסון בארון כירורגית.
- להציג את כל 5 צינורות מ"ל בשפופרת 50 מיליליטר סטרילי פוליפרופילן חרוטי תחתית עם כובע בורג. השתמש בפיסת רקמת נייר נקי כדי להחזיק את צינור 5 מ"ל לשפופרת 50 מ"ל, לסגור את הצינור.
- מניחים את צינורות 50 מ"ל על מדף קלקר ומתל לקופסא קרטון עם המעטפות המרופדות, צורות המשלוח, צורות דוגמאות.
- הדבק את ההוראות (ראה: 1.12-1.19) הפנימי של העטיפה של קופסא הקרטון כדי להקל על הקריאה שלהם.
- שלח קופסא הקרטון בדואר לאיש הקשר בבית החולים.
בבית החולים
- להביא את קופסא הקרטון מהארון כירורגית לחדר הניתוח. זהירות שימו לב: אם ההליך כרוך מטופל נפגעים חיסונית, הקרטון לא צריך להיות מובא לחדר הניתוח.
- במהלך הניתוח, הנח את SPECIM הרשתיתen לפוליפרופילן הממוספר 5 מיליליטר סטרילי מלא פתרון GHCl. סגור היטב את הצינור.
- להחזיר את הצינור לזמן קצר.
- מניחים את הצינור על כיסא הנדנדה צינור הדם במשך 10 דקות.
- מלא את הטופס הממוספר המדגם הנלווה.
- דווח על מספר זיהוי על גבי צינור מ"ל המקביל הממוספר 50.
- להציג את צינור 5 מ"ל עם הדגימה כירורגית לתוך צינור 50 מ"ל, להחליף רקמת נייר ולהבריג את הצינור.
- להציג את הצינור ואת הטופס מילא המדגם לתוכו באחת מהמעטפות המרופדות הנלוות. לסגור אותו.
- להתקשר לחברת הספנות המפורשת ללהרים.
2. טיהור RNA
במעבדה
- Homogenize את הדגימה בצינור פוליפרופילן 5 מ"ל שלה עם פתרון GHCl עם homogenizer דקות 1 תוך כדי התנועה מעלה ומטה בצינור.
- הוסף 270 μl 5.0 pH של 2 אצטט אשלגן ז. נער נמרצות במשך 10 דקות על ידי הנחת הצינור על שייקר בהמצב אופקי (420 דקות -1).
- צנטריפוגה 10 דקות ב -5,000 סל"ד (6,500 XG) ב 20 ° C.
- לשאוב בצורה חלקה שבריר המסיס מבלי להפריע גלולה.
- להעביר לתוך צינור סטרילי 14 מ"ל.
- הוסף 5.3 מ"ל של 100 מ"מ טריס pH 8.0, N-Lauroylsarcosine 1%.
- הוסף 3.2 גרם של כלוריד צסיום (CsCl) ולערבב את הצינור על ידי vortexing.
- הוסף 1.8 מ"ל של חומצת CsCl / ethylenediaminetetraacetic (EDTA) בצינור צנטריפוגות סטרילי 11 מ"ל polyallomer.
- עם 10 מ"ל סטרילי פיפטה פסטר, להעביר את פתרון RNA על 1.8 מ"ל CsCl / EDTA על ידי הזזה לאט בקצה הצינור, כדי למנוע הפרעה לכרית הצפיפות.
- מניחים את הצינורות (צינור שני המכיל את המאגרים בלי רשתית במקרה צורך) לרוטור.
- צנטריפוגה 24 שעות ב32,000 סל"ד (225,000 XG) ב 20 ° C.
- הסר את חלק מעולה של הפתרון עם פיפטה פסטר סטרילי, וזורקים אותו.
- הסר הדרגה תוך הבדיקהרגע שבו את ה-DNA (צמיג) הוא aspirated עם סטרילי פיפטה פסטר שני, וזורקים אותו.
- הסר את הפתרון שנותר נזהר שלא לשחרר את גלולה RNA עם סטרילי פיפטה פסטר שלישי.
- סעיף התחתון של הצינור עם אזמל להבה מעוקר, ואז לשים את החלק הנותר של הצינור זה במהופך על מבט סטרילי.
- הפוך את הצינור ולשטוף בעדינות עם 160 μl של GHCl.
- בואו היבש גלולה למשך 10 דקות.
- Resuspend גלולה ב150 μl של (10 מ"מ טריס pH 7.5-1 מ"מ EDTA - 0.1% SDS).
- מעבירים את הפתרון לתוך צינור microcentrifuge סטרילי 2 מ"ל, ולאחר מכן לקצור את גלולה שיורי עם 30 μl של (10 מ"מ טריס pH 7.5-1 מ"מ EDTA - 0.1% SDS).
- הוסף 150 μl של (10 מ"מ טריס pH 7.5-1 mM EDTA).
- הוסף 30 μl של 3 מ 'pH נתרן אצטט 5.0, מערבולת הצינור.
- הוסף 900 μl של אתנול 100% (-20 מעלות צלזיוס), מערבולת הצינור.
- הנח את צינור 30 דקות בקרח נמס.
- Centrifuge דקות צינור 30 ב 15,000 סל"ד ב 4 ° C.
- לשאוב בעדינות את החלק היחסי המסיס, וזורקים אותו.
- הוסף 500 אתנול μl 70% (RT), מערבולת הצינור.
- צנטריפוגה דקות צינור 20 ב15,000 סל"ד (18,000 XG) ב 4 ° C.
- חזור על צעד השטיפה (70% אתנול).
- צנטריפוגה בקצרה ולחסל אתנול נותר עם טפטפת P200.
- בואו גלולה האוויר היבש למשך 10 דקות.
- Resuspend גלולה ב50 μl DEPC שטופל H 2 O.
- מערבבים נמרצות על ידי vortexing.
- דגירה 15 דקות ב 45 מעלות צלזיוס באמבט מים.
3. ניתוח הרנ"א על ידי ג'ל אלקטרופורזה
- יוצקים agarose ג'ל בתוך מנדף כימי.
- בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל סטרילי, להוסיף 2 μl של רנ"א כדי להיות מנותח ו6.4 μl של חיץ הכנת מדגם.
- בצינור 1.5 מ"ל שני, להוסיף 3 μl של תקני RNA ו9.6 μl של חיץ הכנת מדגם.
- מחממים את הצינורות דק 15 על 65 מעלות צלזיוס, לשים אותם על קרח.
- הוסף 1 ethidium רומיד μl (EB) חיץ טעינה ללא צבע בצינור מדגם RNA וחיץ EB μl 1 טעינה עם צבע בצינור הסטנדרטים רנ"א.
- הרץ את הג'ל תחת 80 - 100 V בתוך מנדף כימי בריצה חיץ, עד שאחד מהצבעים (bromophenol הכחול) מגיע ל 2/3 מהחלק התחתון של הג'ל.
- יש לשטוף את הג'ל פעמיים 15 דקות עם 250 מ"ל דה טופל DEPC 2x SSC.
- קח תמונה דיגיטלית התחת תאורת UV.
- לחשב את היחס שבין הרצועה העליונה (23S rRNA) והרצועה התחתונה (rRNA 16S).
4. טיהור סופית של רנ"א
- התאם את עוצמת הקול של מדגם RNA ל -100 μl עם DEPC שטופל H 2 O (במידת צורך).
- הוסף 100 μl של חומצת פנול (1 מיליליטר פנול רווי ב+ 130 μl DEPC שטופל H 2 O של 50 מ"מ של נתרן אצטט, pH 5.2), מערבולת במרץ.
- צנטריפוגה 10 דקות ב -13,000 סל"ד (15,000 XG) בטמפרטורת חדר.
- Recover בזהירות ולהעביר את השלב המימית (שלב העליון) לרומן צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל סטרילי.
- הוסף 10 μl של 3 אצטט M נתרן, pH 5.2 ו250 μl של אתנול 100% (-20 מעלות צלזיוס).
- דגירה צינור 30 דקות לתוך קרח נמס.
- צנטריפוגה דקות צינור 30 ב 14,000 סל"ד (18,000 XG) ב 4 ° C.
- לשאוב בזהירות את החלק היחסי המסיס, וזורקים אותו.
- הוסף 500 μl של 70% אתנול (בטמפרטורת חדר), ומערבולת הצינור.
- צנטריפוגה דקות צינור 20 ב 14,000 סל"ד (18,000 XG) ב 4 ° C.
- חזור על צעד השטיפה (70% אתנול).
- צנטריפוגה בקצרה ולחסל אתנול נותר עם טפטפת P200.
- לתת אוויר יבש גלולה למשך 10 דקות.
- Resuspend את הכדור לתוך 50 μl של DEPC שטופל H 2 O.
- דגירה אז צינור 15 דקות ב 45 ° C.
- מדוד את הספיגה (ABS) ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר ב -2 μl של מדגם RNA. מחושב Abs260/Abs280 היחס. <li> חנות מדגם RNA ב -80 ° C (יציב במשך כמה שנים).
5. פתרונות והליכי ניקוי
- אשלגן אצטט 2 מ ', pH 5.0: ממיסים אצטט 19.6 גרם אשלגן לתוך 70 מ"ל של DEPC שטופל H 2 O. נקה את הבדיקה מד pH על ידי השרייה לעם 1M NaOH במשך 15 דקות, ואחרי 5 שטיפות עם DEPC שטופל H 2 O. התאם ל-pH 5.0 עם חומצה אצטית לאחר מכן להתאים את עוצמת קול עד 100 מ"ל עם שטופלו DEPC H 2 O.
- טריס-HCl 100 מ"מ, pH 8.0, 1% N-Lauroylsarcosine: ממיסים 2 גרם של N-Lauroylsarcosine (מתחת למכסת מנוע) בעד 40 מ"ל של 0.5 מ 'טריס pH 8.0-הבסיס. התאם את עוצמת קול עד 200 מ"ל עם DEPC שטופל H 2 O.) CsCl / EDTA: 96 גרם של CsCl ב50 מיליליטר מ"מ pH 10 EDTA 7.5 מוכנים עם שטופלו DEPC H 2 O. חיטוי ולהתאים את עוצמת קול עד 100 מ"ל עם DEPC שטופל H 2 O. בדקו אם ה-pH <7.5.
- Agarose ג'ל 1%: שים 1 גרם של agarose ב62 מ"ל DEPC שטופל H 2 O. מרתיחים בתנור מיקרוגל. הוסף 18 מ"ל של 12.3 Mפורמלדהיד, 20 מ"ל של מגבים 5x. יוצקים בתוך מנדף כימי.
- מאגר מכין מדגם: כדי להיות מוכן מאולתר. מערבבים פנימה כימי מכסה המנוע של מגבים μl 8 5x, 16 μl של פורמלדהיד M 12.3 ו -40 μl של פוראמיד.
- EB טעינת חיץ (ללא צבע): כדי להיות מוכן מאולתר. הוסף 4 μl 10 מ"ג / מ"ל ברומיד ethidium 20 μl של 80% גליצרול מוכנים עם DEPC שטופל H 2 O.
- EB טעינת חיץ (עם צבע): כדי להיות מוכן מאולתר. הוסף 2 μl 10 מ"ג / מ"ל ברומיד ethidium 10 μl של גליצרול 80% המכיל 0.25% xylen cyanol, 0.25% כחול bromophenol עם שטופלו DEPC H 2 O.
- ריצת חיץ: עד 60 מגבים 5x מ"ל, להוסיף 54 מ"ל של פורמלין M 12.3 ו186 מ"ל של DEPC שטופל H 2 O.
- טופל DEPC H 2 O: מים מזוקקים דגירה עם 0.1% diethylpyrocarbonate V / V לשעה 2 ב 37 ° C עם ערבוב. לעקר על ידי החיטוי.
- ניקוי homogenizer: הוסף 25 מ"ל של תמיסת ניקוי (RBS) ל1 ליטר של DEPC שטופל H 2 O, ותשקיע את דקות ציר 1 עם ערבוב. דגירה שעה 2 ב 60 ° C. לשטוף ביסודיות עם 2 H DEPC שטופל O גלישה במכשיר לאלומיניום והכניס לתוך קופסא המכשיר. לעטוף את הקופסה. לעקר על ידי החיטוי.
- ניקוי מכשיר אלקטרופורזה: לשטוף את המנגנון, את המגש ואת מסרק 15 הבארות. דגירה 15 דקות ב3% מי חמצן. יש לשטוף פעם אחת עם 100% אתנול. אוויר יבש.
- ניקוי הכלים הזכוכית: יש לנקות את הכלים מזכוכית 2% RBS כל הלילה, ולאחר מכן לשטוף במים מזוקקים לפני העיקור ב 200 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הליך ז'ורנל (איור 1) מאפשר לנו לשחזר את הדגימות של רשתית מהגוש כירורגית למטוהרי RNA, ולנתח את transcriptome של היפרדות רשתית. תוצאות היפרדות רשתית בupregulation של chemotactic גן מונוציטים MCP1 CCL2, ובירידה בביטוי של מוט photoreceptor transducing הגן GNAT1, קצר הגל החרוט Opsin OPN1SW, וCRX homeogene (איור 2). האינדוקציה של CCL2 היא כתוצאה מדלקת 9, תוך ההפחתה במקביל של GNAT1, OPN1SW וCRX היא התוצאה של ניוון photoreceptor, שתי מוטות קונוסים. הפסד של קונוסים יכול לנבוע מהירידה בביטוי של NXNL1, אשר מקודדת לפקטור רוד המופק קון הכדאיות 7,10, או RdCVF2 paralogue שלה, המקודד על ידי גן NXNL2. באופן מפתיע, לשעבר שליח NXNL2ists בשתי גירסאות שונות. גרסת 1 (NM_001161625.1) היא רצף קידוד נגזר מניתוח phylogenic אבל לא דווחה בעבר להתבטא 11, ואילו גרסה 2 (NM_145283.2), שעבורו כמה ESTs זוהתה היא mRNA נורמלי שאינו כולל שני אקסון של הגן ומכיל אקסון שני אלטרנטיבי, המכיל רצף Alu חוזר על עצמו, הנמצא יותר מ -40 קילו ב'3 כיוון (איור 3 א). באמצעות RNA מטוהר מרשתית אנושית, אנו יכולים כעת דיווחו כי שתי גירסאות של ה-mRNA NXNL2 באות לידי ביטוי (איור 3).
איור 1. תמונה של קופסא הקרטון המכילה את החומר המסופק על ידי כתב העת.
איור 2. ייצוג של הביטוי של קבוצת משנה של גנים באמצעות Retinobase. לגנים המוצגים בגרפים אלו, מכ"ם, CCL2 GNAT1, OPN1SW וCRX, חלק מדמותו הזכות מקביל לRNA מן הדגימות של היפרדות רשתית (RD1-18), ואילו החלק השמאלי (NR1-18) הוא RNA פקדים מגיל מתאים, שהוכנו באמצעות רשתיות שלאחר המוות. שיטת גרף המכ"ם מתוארת ב8.
איור 3. ביטוי של שתיים הגרסה של גן NXNL2 ברשתית. ייצוג. סכמטי של הגן על כרומוזום 9 NXNL2. NXNL2v1 יש שני אקסונים שהם חזו על ידי יישור מרובה וניתוח phylogenic. NXNL2v2 חסר שאקסון השני וכולל חלופת אקסון 2 ', הממוקמים> 40 KB ב3' כיוון. Tהוא חיצים מראים את המיקום של פריימר בשימוש. ב. RT-PCR מראה ביטוי של שניהם NXNL2v1 וNXNL2v2 ברשתית. הנתיבים הנכונים מתאים לתגובה בהעדר רברס טרנסקריפטאז. אקטין ACTB, cytoplasmic. פריימרים בשימוש: NXNL2v1: 5'-GCATGAGCTGAGGAAGAGGT-3 ', 5'-CTCA AACGGAGAAATTCTGGA-3', NXNLv2: 5'-TCTGCACCCCCACGTTTATT-3 ', 5'-AGGGCCTCCT TTTCCATCTA-3'.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפיתוח של הליך להתאוששות רקמה מהגוש כירורגית כבר חיוני לניתוח transcriptome של היפרדות רשתית. אחד צריך לשים לב כי סוג זה של ניתוח הוא התאמן בחירום ושיש לי ההפעלה רופאי העיניים קצת זמן כדי להשתתף בתכנית מחקר ביולוגית כאשר הם פועלים. retinectomy זה מבוצע גם stochastically בכל שירות, כך שהדרך קלה יותר להגיע למספרים סטטיסטיים היא לעבוד עם רשת. ברשת כזו, סטנדרטיזציה של אוסף הרקמות חיונית להצלחה של הניתוח הביולוגי. על ידי מתן חומר, קל מאוד לשימוש והוראות מדויקות, שניתן לאחסן בטמפרטורת חדר בקבינט ניתוח, קרובות לבלוק כירורגית, עודדו אותנו המנתחים להשתתף במחקר שלנו.
בנוסף, סטנדרטיזציה של הטיהור של רנ"א הושגה כדי לקבל את הטוב ביותר של אלה CL היקרדגימות inical. האוספים של RNAs הטהור יכולים להיות מאוחסנים במשך שנים ב -80 מעלות צלזיוס, וישמשו למחקרים נוספים כמו טכנולוגיות גנומיקה רומן לצוץ. הפרוטוקול מסופק לדגימה כירורגית רשתית אבל גם יכול לשמש בהצלחה לבודד RNA מן רשתית מכרסם לאחר נתיחה. אם ה-RNA הם מושפל,) לבדוק את רמת החומציות של פתרון CsCl / EDTA. ב) להפוך את כל פתרונות מכימיקלים שאינם בשימוש. המגבלה העיקרית של הטכניקה היא הכמות של חומר מוצא שצריכים להתאים לפחות 50,000 תאים.
מה שמייחד את השיטה המשמשת לכאן מהחומרים כימיים המסחריים ביותר הניתנים לבודד RNA הכולל היא המידה של טוהר. RNA הוא מרוקן מכל זיהום הדנ"א אשר מבטל את הצורך בשימוש בטיפול DNAse שיכול להזיק לכל הליך נוסף. בנוסף, הכנות רנ"א הכל מתרוקנים כאן בtRNA, שידוע להיות מעכב של polymerases RNA הנמצאים בשימוש נפוץ בצעד ההגברה לפני שהכלאה microarray לשבבים. יש לנו ציינו שיש הבדיקות מסונתזים מהכנות RNA אלה פעילות ספציפית גבוהה מאוד. דרגת הטוהר של רנ"א שהוכנה בעקבות השיטה המתוארת כאן הוא מאוד מתאים לכלת microarray, אלא גם לבניית ספריות cDNA של איכות גבוהה ועבור RNA רצף כפי שכבר ציינו. המעבדה צריכה להיות RNAse ללא תשלום. ה-pH של CsCl / EDTA צריך להיות חומצי כדי למנוע את השפלתו של RNA על ידי תמוגה אלקליין. הצפיפות של CsCl / EDTA צריך להיות מאומתת בזהירות על מנת שלא יהיה גבוהה מדי, וכדי למנוע את שקיעה של רנ"א.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים סשה רייכמן ודומיניק Santiard-רון על עזרתם בעריכת פרוטוקול טיהור רנ"א.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Aventi J-E | |
| Rotor | Beckman Coulter | JS-5.3 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | LE 80K | |
| Rotor | Beckman Coulter | SW41 | |
| Power supply | Biorad | Pac 3000 | |
| PolytronTM | Kinematica | PT 2100 | Supplied with PT-DA 2105:2 |
| Agarose gel electrophoresis device | Biorad | MiniGel Cell GT | |
| Imaging System | Biorad | GelDoc-It Imager | |
| 5 ml sterile polyethylene tube | Greiner | 115261 | |
| Sterile polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Chemical reagents | Sigma | Molecular biology grade (RNase and DNase free products) | |
| Cleaning Solution | VWR | RBS | |
| Microarray chip | Affymetrix | Human U133 plus 2 array |
References
- Mitry, D., Charteris, D. G., et al. The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations. The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).
- Green, R. E., Krause, J., et al. A draft sequence of the Neandertal genome. Science. 328 (5979), 710 (2010).
- Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation. Biochemistry. 13 (12), 2633 (1974).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).
- Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro. Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).
- Sawadogo, M. On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin. Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).
- Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death. PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).
- Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina. BMC Genomics. 9, 208 (2008).
- Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).
- Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).
- Chalmel, F., Leveillard, T., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).
